潘俊宇，王斌，范榮波，王義堅，楊永新，韓榮偉，于忠娜

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東煙臺 265200）（2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109）（3.萊西市畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，山東青島 266600）（4.青島荷斯坦奶牛養(yǎng)殖有限公司，山東青島 266600）

據(jù)統(tǒng)計，乳品摻假在食品摻假中排名第二[1]，僅次于食用油脂摻假。常見的摻假方式是向生乳或乳制品中摻入尿素、三聚氰胺、水、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)（見表1），以達到掩蔽乳品質(zhì)量問題或謀取暴利的目的。近年來，隨著國家相關(guān)部門監(jiān)管力度的加強，乳品摻假現(xiàn)象已經(jīng)得到了極大的遏制，但仍存在向乳及乳制品中摻入動、植物蛋白，或向量少價高的特種奶畜乳中摻假廉價牛乳的現(xiàn)象。乳品摻假不僅會給消費者造成經(jīng)濟損失，甚至?xí)鹣M者的不良反應(yīng)[2]。

表1 常見乳品摻假及相應(yīng)檢測方法Table 1 Common dairy adulteration and corresponding detection methods

目前有關(guān)乳品真實性鑒定的研究方法主要有傅里葉變換紅外光譜、聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）和酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）等。Sevval 等[3]建立了傅里葉變換紅外光譜檢測水牛乳和山羊乳中摻假牛乳的檢測方法，檢測限為5%；Rodrigues 等[4]運用PCR 技術(shù)成功檢測出了散裝羊乳中摻假牛乳。Pesic 等[5]運用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）方法檢測出羊乳中存在牛乳成分；Song 等[6]以β-酪蛋白為標記物開發(fā)了ELISA 試劑盒，成功檢測了薩能奶山羊乳和關(guān)中奶山羊乳中摻假的牛乳；Francesca 等[7]運用毛細管電泳法，以α-乳白蛋白為標記物檢測出了水牛乳中的牛乳；PCR/ELISA 方法雖有快速、靈敏的特點，但多數(shù)用于定性或半定量分析，且容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，凝膠電泳和毛細管電泳方法也存在著步驟復(fù)雜、上樣量低、重現(xiàn)性差等缺點[8]。

蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛用于特色畜乳摻假鑒定及標記物的挖掘[9]。蛋白組學(xué)技術(shù)由Marc Wikinszai 于上世紀九十年代初期提出，該技術(shù)可對同一來源（如來源于一個細胞、一種分泌物或一個細胞器）的蛋白質(zhì)進行的系統(tǒng)分離、鑒定和表征[10]。在質(zhì)譜等高通量技術(shù)的支持下，收集了大量的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)以建立生物信息數(shù)據(jù)庫。通過結(jié)合生物信息學(xué)工具，可實現(xiàn)對蛋白質(zhì)來源的鑒定，預(yù)測蛋白質(zhì)的功能、分布等。

蛋白質(zhì)組學(xué)在摻假中的應(yīng)用常與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合以達到檢測的目的，樣品在離子源的作用下形成氣態(tài)肽段離子進行質(zhì)譜檢測。基質(zhì)輔助激光解吸（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）與飛行時間（Time of Flight，TOF）質(zhì)量分析器聯(lián)用或是電噴霧電離（Electro Spray Ionization，ESI）與液相色譜聯(lián)用是兩種常用的蛋白質(zhì)鑒定方法。前者要求基質(zhì)和樣品點在樣品靶位上形成共結(jié)晶后再進行激光解吸，不能直接銜接質(zhì)譜，而選擇ESI 時，樣品經(jīng)過液相色譜分離后通過離子源處理直接銜接質(zhì)譜進行分析。離子源ESI 提供了高度的儀器靈活性，不僅可以很容易地與液相色譜系統(tǒng)結(jié)合，而且還可以與各種質(zhì)量分析儀結(jié)合，但是易受到電解質(zhì)鹽的抑制作用，對除鹽的要求較高[11,12]。而MALDI 具有產(chǎn)生肽和蛋白質(zhì)的單電荷離子的優(yōu)勢，但時間效率較低[13]。

作者查閱了近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在乳品摻假鑒定中的相關(guān)研究報道，按照其在不同物種乳摻假檢測中的應(yīng)用展開綜述，以期對乳品摻假檢測方法的選擇提供更多的思路，見表1。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在牛乳摻假檢測中的應(yīng)用

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在奶牛乳摻假檢測中的應(yīng)用

牛乳是人們生活中十分重要的營養(yǎng)來源，其摻假外源蛋白類型包括向牛乳中摻入乳粉、水解植物蛋白等。Yang 等[24]運用納米液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（nano-High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectroscopy，nano HPLC-MS/MS）對液態(tài)乳中摻假的大豆、豌豆、水解小麥、水解水稻蛋白進行了檢測。發(fā)現(xiàn)采用高速離心方式能夠去除牛奶的高豐度蛋白，以便放大分析摻入的水解植物蛋白，并從UniProt 網(wǎng)站獲得鑒定信息，通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）確定標記物分別為β-伴大豆球蛋白的α亞基、伴豌豆球蛋白、α-淀粉酶抑制劑CM3，最終得出檢出限分別為0.5%、2%、0.5%和4%。Lu 等[25]成功通過超高效液相色譜四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra-Performance Liquid Chromatography -Quadrupole Time-of-flight -Mass Spectrometry，UPLC-QTOF-MS）檢測出生乳中摻假的大豆蛋白和豌豆蛋白，檢出限為1%，標記物分別是β-伴大豆球蛋白和豌豆球蛋白。Hao 等[26]使用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（Ultra-Performance Liquid Chromatography Tandem Triple Quadrupole-Mass Spectrometry，UPLC-TQMS）分析了46 種經(jīng)胰蛋白酶消化而得的肽，從UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得的鑒定信息可知，αS1-酪蛋白肽段FFVAPFPEVFGK、κ-酪蛋白肽段 YIPIQYVLSR、αS2-酪蛋白肽段FALPQYLK、β-乳球蛋白肽段IDALNENK 和β-酪蛋白肽段VLPVPQK 能夠作為物種特異肽段來定量蛋白質(zhì)。通過同位素稀釋UPLC-TQMS 來分析上述物種特異性肽，可定量牛乳中的主要蛋白質(zhì)，經(jīng)驗證每100 g 牛乳蛋白中含有70.26 g 上述種類蛋白，根據(jù)這個閾值，可檢測生乳中摻雜的大豆蛋白，檢出限為10%。Hao 等[26]的方法檢出限顯著高于Yang 等[24]和Lu 等[25]的方法，這是由于在他的方法中只對幾種主要蛋白質(zhì)進行了定量。

Du 等[27]對牛全脂液態(tài)乳中加入乳粉進行了檢測，利用超高效液相色譜四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight-Mass Spectrometry，UPLC-QTOF-MS）分析完整蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，利用MathWorks 軟件獲得肽信息，最終確定檢出限為0.5%，α-乳白蛋白糖基化多肽肽段FLDDDLTDDIMCVK為標記物。同樣是對牛乳中摻假乳粉的檢測，Calvano 等[28]使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOFMS）分析方法，確定檢出限為1%，標記物為αS1-酪蛋白的去磷酸化肽段YKVPQLEIVPNSAEER、αS1-酪蛋白的糖基化肽段TKVIPYVR、β-酪蛋白的乳糖基化肽段VLPVPQKAVPYPQR、β-乳球蛋白的乳糖基化肽段LIVTQTMKGLDIQK、β-乳球蛋白的乳糖基化肽段ALKALPMHIR和β-乳球蛋白的乳糖基化肽段TPEVDDEALEKFDK。這是由于乳粉在加工過程中的熱處理造成美拉德反應(yīng)，使得酪蛋白和乳清蛋白發(fā)生修飾[29,30]，故可使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對奶粉中蛋白質(zhì)進行表征。Calvano 等[28]還對樣品二維凝膠電泳的差異斑點進行了質(zhì)譜分析，這是常用的差異蛋白驗證方法。

從上述試驗結(jié)果來看，不同的研究生物標記物和檢測限存在差異，這可能是因為所定量的蛋白范圍不同導(dǎo)致確定了不同生物標記物，或是依據(jù)不同的生物標記物進行真實性鑒定，但是都可以獲得較低的檢出限和明確的生物標記物，足以說明蛋白組學(xué)在牛乳真實性鑒定方面的可行性。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在牦牛乳摻假檢測中的應(yīng)用

牦牛乳中脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、維生素和必需氨基酸含量高，脂肪酸種類多，膽固醇含量較低，具有一定的抗氧化能力[31]。Yang 等[32]分析了包含牦牛在內(nèi)的多個物種的乳脂肪球膜（Milk Fat Globule Membrane，MFGM）組成，通過iTRAQ 技術(shù)對蛋白質(zhì)進行鑒定和定量，揭示了MFGM 蛋白的物種差異，可用于蛋白質(zhì)印跡法或ELISA 法檢測物種乳摻假。此外，Yang 等[33]基于iTRAQ 技術(shù)分析了包括牦牛乳在內(nèi)的五種乳的乳清蛋白質(zhì)組，五種乳的乳清蛋白的組學(xué)模型存在顯著差異，其中牦牛的物種特異蛋白為一種未命名蛋白。陳雨湉等[34]基于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，采用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜/串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（UPLC-OrbitrapMS，UPLC-TQMS），得出了包括牦牛乳在內(nèi)的八種物種乳的特征肽段，其中牦牛的特征肽段為β-乳球蛋白的LSFNPTQLEGQCHI。將牦牛乳β-乳球蛋白的肽序列與牛乳比較，發(fā)現(xiàn)只存在一處差異，存在于特征肽段內(nèi)部（圖1）。特征多肽分析不僅能用于多物種乳蛋白的鑒別，還可滿足高溫滅菌乳或乳粉等加工奶制品的檢測。

圖1 牦牛乳與牛乳的αS1-酪蛋白肽序列對比Fig.1 Alignment of αS1-casein in yak and bovine milk

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水牛乳摻假檢測中的應(yīng)用

水牛乳的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、總固形物、維生素和礦物質(zhì)含量較高，這改善了水牛乳的口感，可用于制造奶酪[35]。等電聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）是常用的檢測水牛乳真實性的方法，但容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，通過蛋白質(zhì)組學(xué)程序替代/結(jié)合這一方法可以有效避免[36]。Russo 等[37]運用MALDI-TOF MS 檢測水牛乳清干酪中摻入的牛乳清干酪。以β-乳球蛋白的149-162 肽段為分子標記物，最終得到的檢出限為5%。Sassi 等[38]也運用相同的技術(shù)對水牛、綿羊、山羊和牛的液態(tài)乳進行了分析，并確定了各自的物種特異性肽段，同時還對超高溫滅菌乳、巴氏殺菌乳、生乳和奶粉進行生物標記物的表征。Bernardi 等[39]使用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）對水牛乳酪中摻入的羊奶和牛奶進行檢測。從MASCOT 數(shù)據(jù)庫獲得的鑒定信息可知山羊乳和牛乳的特征肽段分別為αS1-酪蛋白的肽段YLGYLEQLLK和αS2-酪蛋白的肽段AMKPWIQPK。這些特定肽段已成功應(yīng)用于不同成分的奶酪的鑒定，在物種乳摻假的檢測中表現(xiàn)出高度的特異性。同時還發(fā)現(xiàn)奶酪的老化和生產(chǎn)方式并不會影響物種特異性肽的鑒定。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在羊乳摻假檢測中的應(yīng)用

羊乳可以改善輕微的消化疾病和預(yù)防嬰兒過敏性疾病[40]，對于患有牛乳引起的胃腸道過敏和慢性腸病的嬰兒，可選擇羊乳作為替代，目前常見的羊乳摻假是向羊乳及乳粉中摻入液態(tài)牛乳或乳粉。Girolamo 等[41]使用MALDI-TOFMS 對山羊乳中摻假的牛乳進行分析，利用FlexControl 軟件分析質(zhì)譜，通過層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）和主成分分析，在0.5%的水平上能夠直觀的區(qū)分出山羊乳中是否摻入液態(tài)生牛乳。Jamnik 等[42]采用二維凝膠電泳結(jié)合MALDI-TOFMS 的鑒定方法，發(fā)現(xiàn)以κ-酪蛋白為標記物，能夠鑒定山羊乳中摻入的牛乳，檢出限為2%。這項研究中山羊和奶牛乳的κ-酪蛋白在二維凝膠上位置不同，利用MALDI-TOFMS 對不同位置條帶進行蛋白質(zhì)鑒定。Jamnik 等[42]和Girolamo 等[41]運用了相同的分析方法，但是前者的研究中檢測限略高，這可能是由于后者并未進行生物標記物的確定而直接分析差異性。

Nardiello 等[43]通過納米液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（Nano-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，nanoLC-MS/MS）方法，以來自β-乳球蛋白的肽段LSFNPTQLEEQCHI和αS1-酪蛋白的肽段HQGLPQEVLNENLLR為生物標記物，能夠檢測出羊乳中摻入的牛乳，該方法檢出限為1%，通過羊乳與牛乳的αS1-酪蛋白肽序列對比和羊乳與牛乳的β-乳球蛋白肽序列對比，可以發(fā)現(xiàn)在肽段序列上有明顯差異，但只有肽段 LSFNPTQLEEQCHI 和肽段HQGLPQEVLNENLLR被測定為信號肽段（圖2、圖3）。

圖3 羊乳與牛乳的αS1-酪蛋白肽序列對比Fig.3 Alignment of αS1-casein in bovine and goat milk

Chen 等[44]分別使用（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Time-of-Flight-Mass Spectrometry，UPLC-TOF-MS）和UPLC-TQMS 對山羊乳粉中摻假的牛乳進行定性和定量，確定了生物標記物β-乳球蛋白的肽段LSFNPTQLEEQCHI可作為山羊乳中摻假牛乳的生物標記物，這可能是因為采用的分析技術(shù)不同。Camerini 等[45]基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）的分析方法可得出和Chen 的研究中相同的特異性肽段LSFNPTQLEEQCHI，檢出限更低，為0.5%，這可能是因為Camerini 選擇的二級質(zhì)譜精確度更高。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在駝乳摻假檢測中的應(yīng)用

駝乳具有很高的營養(yǎng)和藥用價值，產(chǎn)量低、價格高，經(jīng)常發(fā)生駝乳中摻入羊乳、牛乳的情況[46,47]。Katharina 等[48]利用二維凝膠電泳結(jié)合MALDI-TOFMS 對生乳樣品進行分析，并運用蛋白組學(xué)鑒定軟件MASCOT 進行搜索。結(jié)果顯示駝乳與牛、山羊、水牛、馬乳的蛋白質(zhì)組成存在顯著差異。駱駝乳中不含β-乳球蛋白，而牛、水牛、山羊和馬乳中β-乳球蛋白是主要的乳清蛋白，α-乳清蛋白是駱駝乳中含量最豐富的乳清蛋白，具有123 個殘基，分子量為14.6 ku，與其他動物乳相比差異較大，因此，牛和山羊奶中的α-乳清蛋白和β-乳球蛋白在凝膠上的分布差異可作為檢測駱駝奶摻入牛或山羊奶的依據(jù)。Yang等[49]運用同樣的方法，得到了相似的結(jié)果。在摻入2%（V/V）牛乳或羊乳的駝乳中，通過比較二維凝膠電泳的圖像差異并利用MALDI-TOFMS 進行分析，發(fā)現(xiàn)羊乳或牛乳的α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和αS1-酪蛋白的電泳斑點能夠作為標記物來鑒定駝乳真實性。在摻入0.5%（V/V）牛乳或羊乳的駝乳中，羊乳或牛乳的β-乳球蛋白可作為鑒定駝乳真實性的依據(jù)。Yang 和Katharina 的研究均是采用二維凝膠電泳圖像直觀的區(qū)分不同乳，將特定蛋白斑點膠內(nèi)消化后進行質(zhì)譜分析，雖然這種方法會高度依賴電泳結(jié)果，根據(jù)實驗人員操作熟練程度的差異會出現(xiàn)誤差。但兩項研究所確定的標記物相同，證明了這種鑒定方法的可行性。此外，Yang 等[33]還利用相對和絕對定量同位素標記（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技術(shù)定量分析了駝乳、牛乳、牦牛乳、水牛乳和山羊乳的乳清蛋白。駱駝乳的乳清酸性蛋白和醌氧化還原酶，山羊奶的雙糖鏈蛋白聚糖以及牛奶的伯胺氧化酶可作為表征蛋白，這為鑒定駝乳真實性提供了支持。駝乳不含β-乳球蛋白，因此，以β-乳球蛋白為摻假標記物可通過電泳條帶鑒定方法便捷的鑒定駝乳中是否摻入牛或羊等其他物種乳。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)在驢乳摻假檢測中的應(yīng)用

驢乳口感良好，溶菌酶含量高，對病原微生物具有選擇性作用。驢乳產(chǎn)量低，售價較高，但目前利用蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定驢乳真實性的研究較少[50,51]。Girolamo 等[41]利用MALDI-TOFMS 分析了摻假了牛乳的驢乳樣品，并通過PCA 和HCA 直觀的區(qū)分了摻假樣品和未摻假樣品，得到0.5%的檢出限。Zhang等[52]比較了牛乳和驢乳的乳清蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示牛乳和驢乳種異表達的乳清蛋白數(shù)量多達365 個，這一結(jié)果可作為潛在的摻假標記物。

5 結(jié)語

蛋白質(zhì)組學(xué)通過物種蛋白差異性可成功確定物種乳的真實性。本文依據(jù)乳的種類分類，對蛋白組學(xué)在乳品摻假檢測和乳中特異性生物標記物方面的的研究進行了綜述，包括分析手段、檢出限、生物標記物等，可以看出蛋白質(zhì)組學(xué)可以在較低水平上鑒定外源性蛋白，不同物種乳生物標記物的確定可以作為乳品真實性鑒定的依據(jù)。但不管是真實性鑒定還是結(jié)果驗證，蛋白質(zhì)組學(xué)在這方面的應(yīng)用高度依賴質(zhì)譜分析，但乳品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜性和分析技術(shù)的局限性不利于蛋白質(zhì)組學(xué)對乳品中低豐度蛋白的檢測。近年來質(zhì)譜技術(shù)進展飛快，有利于更快、更詳盡地對蛋白質(zhì)組進行表征，也預(yù)示著蛋白質(zhì)組學(xué)在乳品摻假檢測方面的廣闊前景。高通量、精確、快速和便攜將成為蛋白質(zhì)組學(xué)檢測應(yīng)用的主要發(fā)展方向，以圖像來展示差異的方法將會受到更多的青睞。