丁雅雯 代金福 岑怡 范睿 伍寶朵 郝朝運 胡麗松

關鍵詞：胡椒；外植體滅菌；愈傷誘導；體細胞胚胎發(fā)生

胡椒（PipernigrumL.）是胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）多年生常綠藤本植物[1]，原產(chǎn)于印度西高止山脈（印度南部西海岸的馬拉巴爾地區(qū)，現(xiàn)屬喀拉拉邦），是世界重要的熱帶香辛料作物之一，有“香料之王”的美譽。在醫(yī)學工業(yè)中胡椒被用作健胃劑、解熱劑和支氣管粘膜刺激劑等。在食品工業(yè)被用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑等[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，2019年世界胡椒收獲面積達55.3萬hm2，總產(chǎn)量達43.3萬t。我國胡椒主要分布在海南、云南、廣東等省，種植面積超過3萬hm2，年產(chǎn)量達3.6萬t，面積和產(chǎn)量均位居世界第五。其中，海南是我國的胡椒主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量約占全國80%[4-5]。近年來，隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食結構的變化，胡椒消費量還將大幅增加。市場需求的不斷擴大給胡椒產(chǎn)業(yè)提供了廣闊的發(fā)展前景。種苗繁育是產(chǎn)業(yè)推廣的重要環(huán)節(jié)，目前胡椒良種繁殖以傳統(tǒng)的扦插為主，該方法具有種苗優(yōu)良性狀穩(wěn)定的優(yōu)點，但它對苗圃規(guī)劃、母株選擇、苗期培育等環(huán)節(jié)有著嚴格的要求，成本較高，且無法滿足產(chǎn)業(yè)快速推進需求[6-7]。因此，基于體細胞再生的高通量育苗技術是產(chǎn)業(yè)快速推進的迫切需求。

植物組織培養(yǎng)，又稱為植物離體再生，一般的過程主要是離體的植物組織，在適宜的培養(yǎng)條件下，體細胞通過脫分化形成愈傷組織，愈傷組織進一步分化成體細胞胚，然后體細胞胚經(jīng)歷類似合子胚的發(fā)育過程，最終再生成完整植株，基于體細胞再生的種苗發(fā)育技術能夠極大地保留種苗的優(yōu)良性狀。同時，在室內人工環(huán)境下進行種苗繁育，可避免遭受天氣因素的干擾，生長狀態(tài)相對一致，利于集中管理，降低成本。體細胞組培再生是種苗高通量、規(guī)?；?、商業(yè)化生產(chǎn)應用最廣泛的技術。例如，MATHEWS等[8]報道，以胡椒實生苗的各部位組織為外植體，僅苗端可以叢生芽方式增殖，但其他部位組織只能產(chǎn)生愈傷組織，而不能再生植株；BHAT等[9]以同為胡椒屬的蔞葉（P.betleL.）和蓽拔（P.longumL.）的各種外植體成功地培養(yǎng)出新植株，但對胡椒則只能在節(jié)環(huán)組織上產(chǎn)生不定芽，其他外植體只能誘導形成愈傷組織而無器官發(fā)生；劉進平等[10]以印尼大葉種胡椒的莖尖、合子胚、胚軸片段和子葉片段等為外植體進行了系統(tǒng)的組培再生研究。結果發(fā)現(xiàn)盡管采取了75%酒精、1%升汞和20g/L次氯酸鈉組合的滅菌手段，僅成熟的種子可以建立無菌培養(yǎng)。在此基礎上，以無菌種子苗芽尖為外植體建立了胡椒叢生芽誘導技術，由于后代變異、童期長、再生效率等問題該技術沒有在產(chǎn)業(yè)上推廣應用[11-13]。印度香料研究所用成熟的胡椒種子為外植體，在改良型無生長素的SchenkandHildebrandt（SH）培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，誘導出愈傷組織，進而分化出新的植株。盡管該研究提供了胡椒體細胞再生成功的技術方案，但從研究結果來看，并沒有明確外植體是種子萌發(fā)出的胚狀體，還是外種皮珠孔組織[14]。前人的研究從外植體選擇、滅菌方法及培養(yǎng)條件等方面為胡椒體細胞再生研究提供了重要的參考。本研究以熱引1號胡椒為研究對象，利用酒精梯度表面滅菌結合0.1%氯化汞對胡椒果實進行處理，通過無菌種子萌發(fā)獲得外種皮外植體；利用對不同的植物生長調節(jié)劑種類和濃度配比，篩選出適宜的愈傷誘導培養(yǎng)基、體胚發(fā)生和生根壯苗培養(yǎng)條件，為胡椒組培苗的離體快繁技術提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為我國主栽品種熱引1號（P.nigrumc.v.Reyin-1）胡椒，材料種植于中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所內的農業(yè)農村部萬寧胡椒種質資源圃。

1.2方法

1.2.1外植體消毒滅菌與接種利用酒精和0.1%氯化汞設置不同條件組合對胡椒果實進行滅菌處理。處理1：0.1%氯化汞對外果皮直接滅菌8～10min，無菌水沖洗3～5次后去除果皮獲得無菌種子；處理2：75%酒精對外果皮滅菌45s，無菌水清洗3～5次，去除果皮后用75%酒精對種子滅菌45s，無菌水清洗3～5次獲得無菌種子；處理3：75%酒精表面消毒45s，無菌水清洗3～5次，去除果皮后用75%酒精對種子消毒滅菌45s，無菌水清洗3～5次，0.1%氯化汞浸泡消毒6～10min，無菌水清洗3～5次后獲得無菌種子。滅菌后的種子，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上進行無菌培養(yǎng)，2周后統(tǒng)計污染率。種子萌發(fā)培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加1.5%蔗糖、0.25%活性炭和0.25%植物凝膠（表1）。種子材料接種時，每瓶培養(yǎng)基中接種3～4粒，29℃、黑暗條件下培養(yǎng)20～30d，可獲得外種皮。

1.2.2愈傷組織及體細胞誘導將無菌外種皮接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接種3～5粒，每個組合接種6～8瓶，重復3次。每月繼代轉接1次，繼代培養(yǎng)2次之后，統(tǒng)計愈傷組織誘導率愈傷誘導率=（愈傷組織總數(shù)-死亡愈傷組織種殼數(shù)）/接種外種皮總數(shù)×100%。挑選狀態(tài)一致的愈傷組織轉接在原培養(yǎng)基上，繼續(xù)繼代轉接，2代之后，統(tǒng)計胚性愈傷組織分化率。胚性愈傷組織分化率=分化出胚性愈傷組織的外植體總數(shù)/（愈傷組織總數(shù)-死亡愈傷組織總數(shù)）×100%。愈傷組織誘導和分化培養(yǎng)基均選用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，除添加1.5%蔗糖和0.25%植物凝膠外，還附加了2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20mg/L）、3-吲哚丁酸（IBA，0.25、0.50、1.00、2.00、4.00mg/L）和6-糠基氨基嘌呤（KT，0.075、0.150、0.300、0.600、1.200、2.400、4.800mg/L）3種植物生長調節(jié)劑，具體培養(yǎng)基配方如表1所示，3種植物生長調節(jié)劑組合出12種實驗組，未添加任何植物生長調節(jié)劑的MS培養(yǎng)基為對照組。胡椒愈傷組織誘導、增殖和分化培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基均未添加活性炭，誘導培養(yǎng)過程均在27℃，黑暗條件下進行。

愈傷每月繼代培養(yǎng)1次，繼代3次后。統(tǒng)計出間接體細胞胚胎誘導率，間接體胚發(fā)生誘導率=（誘導出體細胞胚的愈傷組織團數(shù)）/胚性愈傷總數(shù)×100%。發(fā)現(xiàn)有體胚長出時，及時轉移至光下培養(yǎng)。體細胞胚胎誘導培養(yǎng)基具體成分如表1所示。待胚性愈傷分化出球形胚后，轉接至MS培養(yǎng)基上，每月繼代轉接1次，記錄體胚狀態(tài)變化，直至分化出子葉胚，將誘導出的子葉胚轉接在體胚繼代培養(yǎng)基上，進而使其分化成完整植株。胡椒體胚繼代培養(yǎng)基的組成成分和種子萌發(fā)培養(yǎng)基相同（表1），每瓶培養(yǎng)基中接種4粒子葉胚，接種50瓶。體細胞胚轉接后排放于培養(yǎng)溫度27℃，光照周期12h/d，光照強度2000lx的條件下進行培養(yǎng)。記錄體胚狀態(tài)變化，胚胎被認為在長出明顯的主根和子葉后才叫發(fā)芽。

1.2.3壯苗培養(yǎng)將子葉胚繼代在體胚繼代培養(yǎng)基上，待幼苗長出2片以上新葉，苗高達3cm以上，繼代在壯苗培養(yǎng)基上進行生根壯苗。胡椒壯苗培養(yǎng)基選用1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加1.5%蔗糖、0.25%活性炭和0.25%植物凝膠。每瓶培養(yǎng)基接種1～2株幼苗，接種100瓶。排放于培養(yǎng)溫度29℃，光周期12h/d，光照強度2000lx的條件下進行培養(yǎng)。

2結果與分析

2.1外植體滅菌

以充分成熟、紅潤、飽滿、無病蟲害的果實為試驗材料（圖1），設置3種方式進行外植體滅菌處理，具體設置見材料方法。接種在不含植物生長調節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，放置于黑暗條件下培養(yǎng)2周統(tǒng)計污染率。污染率控制在10%以內。

在黑暗條件下培養(yǎng)約3周，種胚開始萌發(fā)，再經(jīng)過1個月左右的培養(yǎng)，獲得一棵含兩片子葉和一粒種殼的胡椒實生幼苗。無菌實生幼苗再經(jīng)過10～30d的培養(yǎng)，外種皮從子葉上脫落，獲得無菌外種皮作為植物組織培養(yǎng)的外植體材料（圖1C）。

2.2愈傷組織誘導

以外種皮為外植體開展愈傷組織誘導研究，以MS培養(yǎng)基為對照和基礎培養(yǎng)基，設置3種植物生長調節(jié)劑濃度組合并記錄愈傷誘導效果（表2）。外種皮經(jīng)誘導培養(yǎng)后在珠孔組織處可見愈傷，生長正常的愈傷形態(tài)如圖2A、圖2B所示。統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)，與IBA相比，2，4-D更益于誘導胡椒愈傷組織，不同濃度的2，4-D與KT植物生長調節(jié)劑組合均能促進胚性愈傷組織的分化，隨著濃度的升高，愈傷組織誘導率呈上升趨勢，愈傷最高誘導率達97.62%（表2）。繼代1個月后，試驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的IBA和KT植物生長調節(jié)劑組合培養(yǎng)的愈傷組織逐漸死亡，IBA誘導活性不足，因此IBA不適宜作為胚性愈傷分化的植物生長調節(jié)劑。

不同濃度2，4-D和KT植物生長調節(jié)劑組合培養(yǎng)的愈傷組織經(jīng)過2個月的繼代培養(yǎng)，2，4-D濃度為1.6mg/L，KT濃度為2.4mg/L時，部分愈傷組織轉化為增殖型愈傷（圖2），增殖生長量大，繼代轉接2周后，增大到3倍以上，1個月后，便布滿整個培養(yǎng)瓶，多呈乳白色，質地疏松，半透明狀，表面附著白色粉狀物或結晶體，卻無法分化為胚性愈傷組織。

當2，4-D濃度為0.8mg/L，KT濃度為1.200mg/L時，出現(xiàn)灰白色或灰褐色，團粒結構，半透明狀與淺黃色，顆粒狀，松散的胚性愈傷組織（圖2C、圖2D）。胚性愈傷分化率可達58.18%（表2）。

2.3體細胞胚胎誘導及體細胞分化

胚性愈傷經(jīng)過約3周的培養(yǎng)，轉化為白色，結構松散，顆粒狀的體細胞胚，出現(xiàn)大量球形胚，少數(shù)為心形胚和魚雷形胚（圖3A）。試驗結果表明，在相對較低濃度的2，4-D（0.05、0.10mg/L）和KT（0.075、0.150mg/L）組合下，胡椒愈傷無法誘導出胚狀體，當2，4-D濃度為0.40mg/L，KT濃度為0.600mg/L時，體胚誘導率最高，為13.33%（表3）。將誘導出的球形體細胞胚（圖3A）繼代轉接在含0.40mg/L2，4-D和0.600mg/L的KTMS培養(yǎng)基上，經(jīng)過1周左右的時間，轉化為心形胚（圖3B），3周后出現(xiàn)魚雷形體胚和子葉胚（圖3C、圖3D）。將子葉胚單獨轉接于體細胞胚繼代培養(yǎng)基上，繼帶培養(yǎng)約1個月，待子葉胚生長至約2cm，頂部分化出兩片綠色小葉后（圖3E、圖3F）可進行后續(xù)生根誘導培養(yǎng)。

2.4生根誘導與煉苗培養(yǎng)

待子葉完全長成后，將幼苗轉接在1/2MS培養(yǎng)基，添加1.5%蔗糖，0.25%活性炭和0.25%植物凝膠進行生根誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)1個月后，葉片寬大，綠色加深，有新葉長出，2片對生新葉間長有芽點，并可見新誘導的白色根系，組培苗生長迅速，可生長至5～7cm（圖4A、圖4B）。待組培苗葉片轉為深綠色，有光澤，葉脈清晰，主蔓出現(xiàn)莖節(jié)，莖粗達0.9cm，根系布滿培養(yǎng)瓶底部（圖4C、圖4D）后，將組培苗移至室外培養(yǎng)基質中進行煉苗培養(yǎng)。培養(yǎng)基質采用草炭土、珍珠巖、蛭石混合物，比例為1∶1∶1，溫室中遮蔭培養(yǎng)2周后獲得組培苗（圖4E、圖4F）。

3討論

現(xiàn)有的文獻中有關胡椒體胚發(fā)生的研究較少，基于體細胞再生組培苗繁育技術仍有很多細節(jié)需完善。前人研究表明，胡椒體胚發(fā)生，與基因型、外植體生理狀態(tài)、培養(yǎng)基種類、植物生長調節(jié)劑種類、培養(yǎng)條件等諸多因素決定[15]。其中，外植體滅菌是開展組培繁育的第一步。劉進平等[10]用大田胡椒的芽、單節(jié)莖段、葉片、幼嫩花絮等材料進行外植體消毒滅菌，污染率均為100%，發(fā)現(xiàn)僅有成熟的胡椒種子可以建立無菌培養(yǎng)，但污染率仍然高達30%～60%。陳雄庭等[16]以胡椒主蔓節(jié)間切斷為外植體，其污染率在45%以上。印度香料研究所的研究人員報道了以胡椒種子胚為外植體，通過體細胞再生途徑獲得胡椒組培苗的方法[17]。但文章中并未明確外植體是種子萌發(fā)的胚狀體還是外種皮珠孔組織。本研究以成熟胡椒種子的外種皮作為外植體，通過酒精和升汞復合式滅菌處理，有效地降低了胡椒外植體污染問題，污染率控制在10%以內，建立了胡椒外植體高效的滅菌方式。同時將種子萌發(fā)的胚狀體和外種皮分離后培養(yǎng)，明確了外種皮的珠孔組織是適宜胡椒組培再生外植體。

愈傷組織的誘導分化效率和減少褐變是影響胡椒組培成功的關鍵。劉進平[18]研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)胡椒愈傷組織在后續(xù)繼代培養(yǎng)中會逐漸褐化直至變黑死亡，即使加入質量分數(shù)10%PVP或0.3%活性炭也未能阻止愈傷褐變發(fā)生。本研究探究了添加植物生長調節(jié)劑組合對體胚誘導的影響，結果表明，2，4-D和KT組合是最佳的誘導植物生長調節(jié)劑組合，在2，4-D濃度為0.80mg/L和KT濃度為1.200mg/L時能促進胚性愈傷的誘導。在2，4-D濃度為0.40mg/L，KT濃度為0.600mg/L時，體胚分化率最高，為13.33%。同時發(fā)現(xiàn)體胚分化的過程中有次生胚發(fā)生，從胚軸下部根莖交接部位發(fā)生一叢新的次級胚胎，可實現(xiàn)體胚循環(huán)再生[18-20]。該次生體細胞胚胎起源于初生體細胞胚的根莖處，或是原始體細胞胚附著的胚性愈傷組織，組織發(fā)生增殖，從而產(chǎn)生大量次生體細胞胚胚團。為實現(xiàn)胚胎發(fā)生，也可以通過適當調節(jié)植物生長調節(jié)劑種類和濃度配比，或培養(yǎng)基中其他的有效成分等方式來實現(xiàn)。本研究以建立胡椒組培苗繁育技術為目標，系統(tǒng)研究了從外植體滅菌、愈傷誘導、體胚分化到室外煉苗的過程中的關鍵技術，并最終獲得組培苗，研究結果為胡椒高通量種苗繁育提供了全面的技術參考，具有重要的應用價值。