王世堯 張果 楊書才 蔣拴麗 王瑞華 王俊

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；花色表型；數(shù)量分類；聚類分析；ISCC-NBS色名表示法

蝴蝶蘭（Phalaenopsisspp.），因花姿似蝴蝶飛舞而得名，素有“蘭之皇后”之美譽(yù)[1]。當(dāng)前，全球已登錄38963個(gè)栽培蝴蝶蘭品種，長期的雜交育種使蝴蝶蘭具有豐富絢麗的色彩[2]。花色是觀賞植物的重要經(jīng)濟(jì)性狀，精準(zhǔn)定義蝴蝶蘭花色對其分類、品種鑒定及產(chǎn)業(yè)交流的規(guī)范性舉足輕重[3]。陳和明等[4]基于213份蝴蝶蘭資源的18個(gè)性狀構(gòu)建蝴蝶蘭品質(zhì)性狀綜合評價(jià)體系，花色性狀為品質(zhì)評價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，且變異程度較高。湯楷等[5]對17份蝴蝶蘭新品種（系）的16個(gè)性狀運(yùn)用加權(quán)主成分分析法進(jìn)行商品性綜合評價(jià)，花色權(quán)重占20.87%。近年來，蝴蝶蘭花色表型研究主要借助定性描述及比色卡來鑒別花色，宋一嵐等[6]通過定性描述將蝴蝶蘭分為白、黃、紫紅、深紫、暗紫及6個(gè)復(fù)色鑲嵌色系；陳劍鋒等[7]利用比色卡對127份蝴蝶蘭各花器官的主色進(jìn)行了定義，但2種方式皆易受環(huán)境和人為因素影響進(jìn)而造成較大誤差。分光色差儀等精密儀器可有效消除上述影響，具備穩(wěn)定性高、可量化的特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于菊花[8]、荷花[9]、百合[10]、月季[11]等多種重要觀賞植物的花色分類研究中，使得花色表型的數(shù)量化得以實(shí)現(xiàn)。

隨著蝴蝶蘭種質(zhì)資源愈加豐富，蝴蝶蘭在花色素組成[12]、花色功能基因鑒定[13-14]及基于形態(tài)特征的系統(tǒng)分類學(xué)[15-16]等方面開展了大量的研究工作，但基于蝴蝶蘭花色表型數(shù)量化的分類研究尚無相關(guān)報(bào)道。對觀賞植物的花色進(jìn)行精準(zhǔn)評價(jià)亦是建立其與各組遺傳標(biāo)記之間聯(lián)系的前提[17]，因此，亟須建立一套科學(xué)系統(tǒng)的基于表型的蝴蝶蘭花色數(shù)量分類體系。本研究通過使用分光測色儀結(jié)合英國皇家園林協(xié)會RHS植物比色卡（RoyalHorticulturalSocietyColourChart，RHSCC）對146份蝴蝶蘭種質(zhì)進(jìn)行花色測定，采用聚類分析和ISCC-NBS色名表示法對其進(jìn)行分類命名，并對分布情況進(jìn)行分析，以期精準(zhǔn)定義蝴蝶蘭花色并科學(xué)分類，為蝴蝶蘭品種數(shù)量分類與鑒定、花色定向育種等工作提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料均為鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所蝴蝶蘭種質(zhì)資源圃所收集、保存的資源。2022年9—10月對資源圃內(nèi)資源利用降溫設(shè)備進(jìn)行催花處理，2023年1—2月進(jìn)入盛花期。經(jīng)初步鑒定和篩選，選取長勢良好，花色表型穩(wěn)定的146份蝴蝶蘭種質(zhì)（部分如圖1所示），于盛花期的晴朗上午進(jìn)行取樣測定。

1.2花色表型的測定

對每個(gè)品種選取具有典型顏色特征的3朵花，分別利用RHSCC和分光測色儀（三恩時(shí)TS7036）進(jìn)行測定：在室內(nèi)自然光條件下用比色卡進(jìn)行比色，3次重復(fù)后以出現(xiàn)頻率最高的顏色為最終測定結(jié)果；在光源C/2°、測量口徑4mm的參數(shù)設(shè)置下使用測色儀，置花被片平鋪于白紙上，將集光孔對準(zhǔn)測定部位（圖2），測定3個(gè)重復(fù)，取均值代表花被片顏色。

蝴蝶蘭側(cè)花瓣、萼片及唇瓣由斑點(diǎn)、條紋等圖案導(dǎo)致的異色，根據(jù)其是否能覆蓋底色來判定，若連成片狀且顏色異于底色則認(rèn)為是復(fù)色，若不能將底色覆蓋則定義為純色。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SQCX軟件獲取分光測色儀測定的基于CIELab表色系統(tǒng)的明度值（L*）、紅度值（a*）、黃度值（b*）、彩度值（C）、色相角（h）和基于孟塞爾顏色系統(tǒng)的色相值（Hue）、明度值（Value）和彩度值（Chroma）；采用MicrosoftExcel2007軟件對統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；利用Origin2023軟件，使用最遠(yuǎn)鄰近法（歐式距離）對L*值、a*值和b*值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，分析其不同色系的差異并作圖。

2結(jié)果與分析

2.1蝴蝶蘭花瓣、萼片和唇瓣的花色表型差異分析

蝴蝶蘭花朵由3枚萼片、2枚側(cè)花瓣和1枚高度特化的腹部花瓣——唇瓣構(gòu)成，具有較高的觀賞價(jià)值。對供試的146份蝴蝶蘭種質(zhì)資源的側(cè)花瓣、萼片和唇瓣的顏色進(jìn)行測定（存在部分復(fù)色材料，分別獲得172組側(cè)花瓣、萼片數(shù)據(jù)及146組唇瓣數(shù)據(jù)），取其均值分析整體花色表型差異。如表1所示，側(cè)花瓣和萼片的顏色參數(shù)值均無顯著差異，而唇瓣L*值顯著低于花瓣和萼片，其a*值和C值則顯著高于二者，表明唇瓣相對于花瓣和萼片的顏色亮度較暗，但彩度較大，更偏向于紅色。

2.2基于聚類分析的蝴蝶蘭花色分類

因供試種質(zhì)資源的花瓣和萼片的顏色差異不大，本研究主要以側(cè)花瓣的色值作為分類依據(jù)。供試蝴蝶蘭花色在CIELab表色系統(tǒng)各參數(shù)分布廣泛（表2），L*值介于20.20～93.00之間；a*值和b*值分別分布在?13.76～74.10，?35.40～64.07區(qū)間內(nèi)。對其L*、a*、b*值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，當(dāng)歐式距離為10時(shí)，可將其分為8個(gè)類別（圖3）；參考RHSCC的命名規(guī)則進(jìn)行命名，可分為8個(gè)色系（表2）：紫色系、暗紫色系、淺紫色系、紫紅色系、白色系、黃綠色系、粉色系和灰橙色系，其中紫紅色系和白色系占比較大，但通過分析聚類樣本發(fā)現(xiàn)，部分淡黃綠色、淡粉色等彩度偏低的品種被劃在白色系，表明僅通過聚類分析不能對蝴蝶蘭花色有效區(qū)分。

2.3基于ISCC-NBS色名表示法的蝴蝶蘭花色分類

2.3.1蝴蝶蘭花色分類基于聚類分析結(jié)果，采用ISCC-NBS色名表示法對所測得的172個(gè)蝴蝶蘭花色表型值重新進(jìn)行命名及歸類，共獲得44個(gè)顏色名稱（表3）。通過簡化飽和度和明度描述，可將供試蝴蝶蘭花色劃分為7大色系：黃色系、棕色系、紅色系、紫羅蘭色系、粉色系、紫色系和白色系。根據(jù)劃分色系的色相、明度和彩度的參數(shù)范圍（表4），可發(fā)現(xiàn)紫羅蘭色和紫色系的明度和彩度相當(dāng)，紅色系中存在品種的明度較低，表現(xiàn)為暗紅色或暗紅偏灰，接近于黑色。

2.3.2蝴蝶蘭花色表型分布特點(diǎn)使用CIELab表色系統(tǒng)對基于ISCC-NBS體系分類下的蝴蝶蘭7個(gè)色系的L*、a*、b*參數(shù)進(jìn)行分析，各色系的參數(shù)值分布規(guī)律較為明顯（圖4）。白色系和黃色系的L*值較大且分布集中，紅色系的L*值最??；粉色系、紫色系和棕色系的L*值重疊，可通過a*值和b*值進(jìn)行有效區(qū)分；白色系和黃色系的a*值在負(fù)值范圍內(nèi)有分布，其他色系的a*值均在正值范圍；紫羅蘭色系和紫色系b*值集中分布在負(fù)值，二者在a*、b*值的分布相似，但前者L*值明顯低于后者。

供試蝴蝶蘭花色在a*、b*色相坐標(biāo)上，主要集中在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限，在呈現(xiàn)藍(lán)色的第Ⅲ象限中無分布（圖5A）。在第Ⅰ象限主要分布棕色、粉色、紅色3個(gè)色系的品種；黃色系主要分布在第Ⅱ象限；第Ⅳ象限主要分布紫色、紫羅蘭色2個(gè)色系，紅色系亦有分布；白色系集中分布在接近原點(diǎn)的位置。在L*、a*、b*值的三維散點(diǎn)圖中花色數(shù)據(jù)多集中在一條主線附近，呈帶狀分布（圖5B）。

2.3.3蝴蝶蘭L*值與C值相關(guān)性分析彩度C值的變化會對明度L*值產(chǎn)生影響，根據(jù)供試蝴蝶蘭不同色系的L*值與C值二維坐標(biāo)的分布，可將其分為2個(gè)類群（圖6）。第一類群的L*值隨C值的增大而變小，包含白色、黃色、棕色、紫羅蘭色、紫色和粉色等6個(gè)色系（圖7A），對其L*值和C值進(jìn)行線性擬合分析，繪制線性回歸圖，結(jié)果表明，擬合線性方程為y=-0.71749+93.17836，呈顯著負(fù)相關(guān)（r=0.689）；第二類群僅包含紅色系（圖7B），L*值和C值間無顯著相關(guān)性（r=0.080）。

3討論

蝴蝶蘭新品種DUS測試指南中[18]，利用RHSCC以群體目測的方式定義花瓣主色，將蝴蝶蘭分為白色、黃色、綠色、橙色、粉紅色、紫紅色和褐色等7種類型，該種方式存在一定的主觀性，在實(shí)際應(yīng)用中不能保證定義結(jié)果具有良好的便捷性和精確度。而比色卡與測色儀相結(jié)合可保留視覺的直觀性和精密儀器的客觀性，可實(shí)現(xiàn)對花色的量化和精確描述。本研究中，基于側(cè)花瓣的L*、a*、b*值進(jìn)行聚類分析方法將蝴蝶蘭劃分為8個(gè)類別，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)并不能將白色與淺粉色、淺黃色和淺綠色等花色進(jìn)行有效區(qū)分。殷涵泰等[19]利用測色儀測定107份秋石斛品種花瓣和唇瓣的顏色并進(jìn)行聚類分析，將其分為白、粉、黃綠、紫紅、淺紫、紫、深紫、復(fù)色等8個(gè)色系，但存在黃色和綠色資源不能分開的情況；王玉蛟等[20]在對芍藥的花色分類中也出現(xiàn)了此類情況，白色與黃綠色系中的淺色品種聚為一類，表明僅使用聚類分析對顏色較接近的花色進(jìn)行分類易導(dǎo)致偏差。ISCC-NBS色名表示法是基于孟塞爾顏色系統(tǒng)由美國色彩協(xié)會（InterSocietyColourCouncil，ISCC）和美國國家標(biāo)準(zhǔn)局（NationalBureauofStandards，NBS）共同確定并頒布了267個(gè)適用于非發(fā)光物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)顏色名稱，可從6個(gè)維度對顏色進(jìn)行準(zhǔn)確的分類和定義[21]。吳靜等[22]基于466個(gè)紫斑牡丹單株花色的表型值，使用ISCC-NBS色名表示法將紫斑牡丹的花色分為8大色系，可有效區(qū)分相近的色系，取得了較合理的分類結(jié)果。本研究基于聚類分析結(jié)果并利用ISCC-NBS色名表示法將蝴蝶蘭花色分為7個(gè)色系，不同色系與CIELab系統(tǒng)的L*、a*和b*參數(shù)具有合理的對應(yīng)關(guān)系，即可歸納各色系的參數(shù)分布范圍，實(shí)現(xiàn)對不同蝴蝶蘭花色的定量描述，如目測易混淆為同一色系的紫羅蘭色和紫色可通過L*值進(jìn)行有效區(qū)分，實(shí)際應(yīng)用中被定性為粉色的品種如小梅花（P.Xiaomeihua）、安娜（P.Anna）等被正確劃分為紫色系，表明ISCC-NBS色名表示法的色系劃分具備可量化的客觀性。但本研究中存在種質(zhì)資源樣本較少的問題，如劃分為粉色系的供試種質(zhì)僅有3種，對應(yīng)參數(shù)范圍的準(zhǔn)確性仍需進(jìn)一步完善；此外，受限于分光測色儀的通光孔孔徑的尺寸，蝴蝶蘭的紋路、斑點(diǎn)、斑塊等顏色分布類型難以實(shí)現(xiàn)對其量化和精確描述。因此，須加強(qiáng)蝴蝶蘭種質(zhì)資源的收集力度，同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化測色方法，通過聚類分析結(jié)合ISCC-NBS色名表示法及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用進(jìn)而綜合得到更科學(xué)、適用且精確的蝴蝶蘭品種分類體系。

花朵呈色主要與其組織結(jié)構(gòu)和組織細(xì)胞中的色素種類、含量密切相關(guān)[23]。蝴蝶蘭花色多彩，供試種質(zhì)在a*、b*參數(shù)坐標(biāo)上除藍(lán)綠色區(qū)間外廣泛分布，缺乏純正的藍(lán)色品種。飛燕草素（delphinidin）及其衍生物對藍(lán)色花形成至關(guān)重要，F(xiàn)3′5′H被稱為藍(lán)色基因，其時(shí)空表達(dá)和表達(dá)強(qiáng)度決定了飛燕草素的分布和積累量[24]。蝴蝶蘭中的F3′5′H基因與其他植物F3′5′H基因同源性僅為50%，可能在進(jìn)化過程中丟失了原有的功能是導(dǎo)致其無法呈藍(lán)色的潛在原因[25-26]。LIANG等[27]將大花飛燕草（Delphiniumgrandiflorum）的DgF3′5′H和蝴蝶蘭PeMYB2在P.SogoYukidian‘V3瞬時(shí)共表達(dá)，產(chǎn)生一種新奇的藍(lán)紫色，其液泡的pH及金屬離子（Al3+、Ca2+、Fe3+）與花青素的摩爾比均與紫色蝴蝶蘭存在顯著差異。日本學(xué)者將鴨跖草的基因轉(zhuǎn)入蝴蝶蘭中，培育出轉(zhuǎn)基因藍(lán)紫色蝴蝶蘭新品種BlueGene，但后代繁殖困難及栽培過程中需添加外源物質(zhì)才能使其花色穩(wěn)定[28-29]。隨著多組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)日漸成熟，基于藍(lán)色蝴蝶蘭呈色機(jī)制的復(fù)雜性，開展多維度的交叉融合研究是培育藍(lán)色蝴蝶蘭新品種的必由之路。

蝴蝶蘭花色表型的明度和彩度整體呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，可分為兩類：第一類群包括白色、黃色、棕色、紫羅蘭色、紫色和粉色6個(gè)色系，第二類群僅包含紅色系，這可能與決定各色系的多種類別色素有關(guān)。蝴蝶石斛蘭中明度L*值與總花青苷含量和總黃酮含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)[30]。郭鑫等[31]對190個(gè)紫斑牡丹品種為材料分析L*與C值，進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)亦分為2個(gè)類群，紫紅色和黑紅色系明度和彩度呈正相關(guān)，與本研究中紅色系蝴蝶蘭的表征趨近。大部分植物的萼片為綠色，而蘭科植物中萼片和花瓣特化的唇瓣均有豐富的顏色[32]。李崇輝等[30]對24份蝴蝶石斛蘭種質(zhì)的花色表型進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)唇瓣顏色比花瓣和萼片暗，但色彩更濃郁，與蝴蝶蘭的花色特征相同。在未來的蝴蝶蘭花色育種工作中，須進(jìn)一步明確外源基因?qū)雽m色素合成途徑和呈色的作用，亦可結(jié)合花型育種培育“三唇瓣”品種[33]；此外，還可通過引入蝴蝶蘭近緣屬特殊的花色種質(zhì)資源與其進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，以期創(chuàng)制出新奇特異的蝴蝶蘭花色新種質(zhì)，如蝴蝶蘭與萬代蘭屬（Vanda）中的藍(lán)色或火焰蘭屬（Renanthera）的亮橙色種質(zhì)資源進(jìn)行屬間雜交，獲得的雜種群體均可充分遺傳雙親的特點(diǎn)[34-35]。

4結(jié)論

通過對146份蝴蝶蘭種質(zhì)資源花色表型值進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭花色較為豐富，缺乏藍(lán)色系；花瓣和萼片顏色整體差異不大，唇瓣相較二者顏色更暗，彩度較大?；趥?cè)花瓣的L*、a*、b*值進(jìn)行聚類分析的分類結(jié)果不能完全表征蝴蝶蘭花色的分布特點(diǎn)；利用ISCC-NBS色名表示法可將供試種質(zhì)資源分為黃色系、棕色系、紅色系、紫羅蘭色系、粉色系、紫色系和白色系共7個(gè)色系，對于蝴蝶蘭花色表型分類更為準(zhǔn)確，整理出不同色系花色參數(shù)范圍；整體上蝴蝶蘭花色明度和彩度呈負(fù)相關(guān)，可分為紅色系和其余色系2個(gè)類群。本研究初步建立基于表型的蝴蝶蘭花色數(shù)量分類體系，為蝴蝶蘭新品種和花色選育提供理論基礎(chǔ)。