冷青云 陸錦萍 黃少華 徐世松 李海燕 ?？『? 尹俊梅

關鍵詞：流式細胞術；蘭屬；倍性鑒定

蘭屬（CymbidiumSw.）是蘭科（Orchidaceae）重要觀賞類群之一，原生種約86種[1]，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，向南到澳大利亞北部，中國是該屬的分布中心和多樣性中心，分布于秦嶺山脈以南地區(qū)，約有63種[2]。種內(nèi)品種及種間雜種和品種間雜交種超過2萬種，截至2022年，在國際蘭花雜種登錄權威機構（InternationalRegistrationAuthorityforOrchidHybrids，RHS）上登錄的蘭屬植物雜交種有超過17363個[3]。

蘭屬育種方式有選擇育種、雜交育種與誘變育種等，其中雜交育種是蘭屬植物的主要育種手段。在雜交育種工作中，了解親本及雜交后代的倍性和育性十分重要，有利于提高育種的成功率。通過染色體計數(shù)法對一些蘭屬原生種及雜交品種（雜交蘭和大花蕙蘭）進行倍性鑒定研究，原生種及雜交蘭主要是二倍體，大花蕙蘭（Cymbidiumhybridium）的染色體倍性多樣化，有二倍體、三倍體、四倍體、六倍體和非整倍體[4-10]。然染色體計數(shù)法對細胞學操作技術要求較高，且費時費工，面對大規(guī)模種質(zhì)資源及雜交后代群體的倍性鑒定需要尋找一種快速便捷、高通量鑒定的方法。

流式細胞術（flowcytometry，F(xiàn)CM）是20世紀70年代發(fā)展起來的一種對懸浮的單細胞進行高速分析和分選的技術。在植物學研究中，常用于倍性分析、細胞計數(shù)、細胞周期分析及植物基因組大小估算等研究，具有分析速度快、靈敏度高、可靠性好等優(yōu)點[11-12]。近年來在紅掌[13]、香蕉[14]、橡膠[15]、火龍果[16]、茉莉花[17]、桂花[18]、三角梅[19-20]等植物倍性鑒定中應用。在蘭科植物研究中，已有超過26屬70種的基因組大小是通過FCM評估，包括蘭屬、兜蘭屬（Paphiopedilum）、樹蘭屬（Epidnedium）等[21-25]，另外，F(xiàn)CM也應用于對化學誘變劑處理后的蝴蝶蘭（Phalaenopsis）、石斛（Dendrobium）、白芨（Bletilla）倍性鑒定[26-29]。本研究通過流式細胞術對蘭屬3個雜交后代群體進行倍性鑒定，以期為快速鑒定雜種后代倍性提供技術方法，并獲得優(yōu)良的多倍體植株，為今后的多倍體育種提供種質(zhì)材料。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為親本黃金小神童（CymbidiumGoldenElf.‘Sundust）、冬風蘭（CymbidiumdayanumRchb.f）、美花蘭（CymbidiuminsigneRolfe）以及其雜交后代群體，其中，黃金小神童為雜交種，其他為原生種，具體組合及雜交后代數(shù)量見表1。所有材料均保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所八隊熱帶花卉種質(zhì)資源圃。

1.2方法

1.2.1蘭屬流式細胞術倍性檢測技術體系構建裂解液種類、試驗材料組織部位是影響倍性檢測的關鍵環(huán)節(jié)。本試驗應用了3種裂解液Galbraithsbuffer（GLB）（30mmol/LNa3C6H5O7·2H2O、45mmol/LMgCl2、20mmol/L3-[nmorpholino]propanesulfonicacid]、0.1%TritonX-100（w/V），pH7.0）、WoodyPlantBuffer（WPB）（0.2mol/LTris-HCl，86mmol/LNaCl，10mmol/L焦亞硫酸鈉，4mmol/LMgCl2·6H2O，2mmol/LEDTANa2·2H2O，1%PVP-10，1%（V/V）TritonX-100，pH7.5[26]、CyStainUVPreciseP試劑盒，以黃金小神童幼嫩葉片、根尖組織、花梗、花萼片為材料，利用流式細胞儀測定相對熒光強度（relativefluorescenceintensityofPI-stainednuclei，F(xiàn)L）和G0/G1期的變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV），篩選出最適合裂解液及組織部位，每個處理重復3次。

1.2.2蘭屬雜交后代流式細胞術倍性檢測基于黃金小神童為試驗材料構建的蘭屬流式細胞術倍性檢測技術體系：解離液為CyStainUVPreciseP，幼嫩葉片為試材，檢測其倍性。

將樣品置于含1.0mL預冷的GLB解離液的培養(yǎng)皿中，用鋒利的刀片切碎，2min后用300目尼龍網(wǎng)過濾，濾液加入預冷的碘化丙啶（PI）和RNAase溶液，工作濃度均為50μg/mL。置于冰上避光染色0.5～1h后上機檢測，儀器為SysmexCyFlow?PloidyAnalyser，激發(fā)光為488nm，每次檢測收集5000個顆粒，儀器自帶軟件作圖分析，變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。每份材料重復3次。

1.2.3不同倍性氣孔形狀觀察葉片氣孔大小和密度比較：取不同倍性葉片，在葉片下表皮均勻涂上一層透明指甲油，待指甲油干后，用鑷子挑取其表皮置于有蒸餾水的載玻片上，吸取多余的水分，加蓋玻片后在LeicaDM2500生物顯微鏡40×物鏡下觀察測量。每片至少觀察10個視野，記錄每個視野內(nèi)氣孔器的個數(shù)，每片選取30個氣孔，測量每個氣孔器的長度和寬度。

2結果與分析

2.1蘭屬流式細胞術倍性檢測技術體系構建

2.1.1不同裂解液對細胞核解離的影響以黃金小神童嫩葉為供試材料，利用流式細胞儀研究3種裂解液對蘭屬植物的裂解效果（圖1，表2），發(fā)現(xiàn)3種裂解液均能較好地保證完整的細胞核從破碎細胞中裂解出來，同時可降解細胞中的次生代謝產(chǎn)物。對于FL值，3種裂解液有顯著差異，其中GLB裂解液裂解樣品得出的FL值最低，最高的FL值出現(xiàn)在CyStainUVPreciseP裂解的樣品中，且顯著高于另外2個裂解液。在用3種裂解液對蘭屬進行流式分析中，CV值差異不顯著，最高的為WPB裂解液，CV值為5.66%，大于5%；最低為GLB裂解液，為3.93%。裂解液的選擇標準為有最高的FL值和最低的CV值，通過表2發(fā)現(xiàn)，CyStainUVPreciseP在3種裂解液種中最佳。從圖1也可看出，CyStainUVPreciseP制備的樣品流式細胞圖出峰清晰、穩(wěn)定、雜峰少，并且可以清晰地觀察到G2期。因此，選定CyStainUVPreciseP試劑盒為本研究后期的裂解液。

2.1.2不同組織部位對植物倍性的影響本研究分別使用植株的嫩葉、根尖、花梗和花萼片來驗證不同組織器官對植物倍性檢測結果準確性的影響。由圖2可知，4種組織器官均能裂解出細胞核，嫩葉和花梗有一個明顯峰值，其峰值清晰，細胞碎片少，根尖和花萼片流式DNA含量直方圖顯示出2C、4C、8C共3個峰值，根尖在2C、4C處峰值等高，花萼片的主峰值出現(xiàn)在4C處，是葉片主峰值的2倍，這2種組織呈現(xiàn)體內(nèi)多倍化現(xiàn)象，不適合作為蘭屬倍性檢測的組織材料，花梗能較好地出峰，也無多倍化細胞干擾，但其取材時間只能在開花期特定時間采集，而葉片可以在任何季節(jié)取材，是理想的蘭屬倍性檢測組織部位。在后續(xù)的研究中選擇以幼嫩葉片為材料開展流式細胞術檢測。

2.2蘭屬雜交后代流式細胞術倍性檢測

以CyStainUVPreciseP試劑盒為裂解液，利用流式細胞儀對3個親本及其雜交后代進行倍性檢測。測定結果見圖3，3個親本流式細胞圖出峰清晰、穩(wěn)定、雜峰少，熒光強度在12251～13509之間，差異不大。因3個親本均為二倍體，將雜交后代DNA相對含量峰值在12800左右定為二倍體，三倍體峰值在19200左右和四倍體峰值在25600左右。雜交后代倍性檢測統(tǒng)計結果見表3，共檢測出多倍體8株，其中黃金小神童×美花蘭后代檢測出三倍體1株，占比為1.02%；（黃金小神童×冬鳳蘭）×美花蘭后代檢測出三倍體5株，占比8.92%；四倍體2株，占比3.57%。

2.3不同倍性氣孔形狀比較

蘭屬二倍體、三倍體和四倍體的氣孔性狀分析結果表明（表4，圖4），不同倍性間的氣孔長度、寬度和密度均差異顯著（P<0.05）；氣孔長度和寬度的排序為四倍體>三倍體>二倍體，而氣孔密度的排序則相反。

3討論

目前，流式細胞術是大規(guī)模檢測植物倍性的有效手段，具有快速、準確、操作簡便和可重復性強等優(yōu)點。其中裂解液種類和試驗材料組織部位是影響其準確性的關鍵因素。前人研究發(fā)現(xiàn)GLB對蘭屬裂解效果最好[24-25]。本研究在對蘭屬植物裂解試驗中，發(fā)現(xiàn)CyStainUVPreciseP試劑盒裂解液是所用3種裂解液中效果最佳的，CyStainUVPreciseP為專利產(chǎn)品，配方成分未公開，且售價偏高，GLB含有檸檬酸鈉和TritonX-100，能清除蘭屬植物葉肉細胞中含有大量的糖類、酚類等黏性物質(zhì)，其裂解的細胞懸浮液也能出較好的峰值，因此在對蘭屬物種進行流式細胞技術測定時，無法獲得CyStainUVPreciseP試劑盒裂解液的情況下，也可選擇GLB進行試驗。蘭科普遍存在核內(nèi)再復制現(xiàn)象[12]，蘭屬組織器官中也均存在多倍體化[30]。本研究所選的4種植物組織中，根尖和花萼片均存在不同程度的內(nèi)源多倍體化現(xiàn)象，內(nèi)源多倍體化在植物倍性鑒定中會造成倍性改變的假象，對結果的準確性產(chǎn)生影響；嫩葉和花梗出峰穩(wěn)定，因嫩葉不受開花等影響，在幼苗期及成苗期均可以采樣，是蘭屬倍性檢測的最佳組織材料。

多倍體育種是觀賞植物育種的重要方向之一。目前商業(yè)化的大花蕙蘭品種多數(shù)為多倍體。不同倍性品種間雜交是蘭屬多倍體的主要選育途徑，三倍體可由四倍體為親本與二倍體雜交產(chǎn)生，四倍體由四倍體和四倍體雜交產(chǎn)生，二倍體品種間雜交也能產(chǎn)生四倍體的子代[8，10]。本研究在2個二倍體為親本的雜交組合后代中檢測到三倍體和四倍體，四倍體可能是由二倍體合子經(jīng)體細胞加倍后發(fā)育成植株，三倍體是由未減數(shù)分裂的2n配子和經(jīng)減數(shù)分裂n配子受精融合發(fā)育而成，其中2n配子來源于母本的概率大于父本，因為在獲得多倍體雜交組合的母本均為雜交種，黃金小神童是建蘭（C.ensifolium）和大花蕙蘭（C.EnidHaupt）的雜交種，經(jīng)多次雜交選育而成，具有50%建蘭、12.5%美花蘭和6.25%獨占春的血統(tǒng)[英國皇家園藝學會（RHS）的蘭科植物品種國際登錄網(wǎng)]。有研究表明遠緣雜交是獲得高效發(fā)生2n配子資源的有效手段，雜交種在配子形成過程中減數(shù)分裂異常，出現(xiàn)2n配子概率顯著高于原生種[31-32]。從本研究中雜交組合3比組合2出現(xiàn)多倍體比例高的現(xiàn)象，也可發(fā)現(xiàn)雜交代數(shù)越高，遺傳背景越復雜，獲得可育配子比例低，產(chǎn)生后代數(shù)量也相對少，但更容易出現(xiàn)多倍體。在蘭屬雜交育種中，親本選擇可以親緣關系較遠，親本至少有一方是經(jīng)過多代雜交后的雜交種，這樣子代植株倍性會相對豐富。

染色體組的加倍會導致基因表達和調(diào)控的改變，從而造成植物形態(tài)和生理上的相應變化，如葉片變寬、變厚，花瓣變厚、顏色變深，氣孔長度和寬度增大、密度降低、育性和抗性改變等。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著倍性的提高氣孔的長度和寬度均增大，氣孔密度變小。這與張源源等[33]在橡膠多倍體研究中的結果相似。而株型、花朵數(shù)量、大小和顏色、花期長短、抗性及育性等特性有待進一步觀察。