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        熒光原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合FISH—FCM對肉食品中腸桿菌科細(xì)菌的快速定量檢測

        2016-10-20 15:37:59汪沐謝鵬唐夢君
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年7期

        汪沐 謝鵬 唐夢君

        摘要:為建立一種新的熒光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合(FISH-FCM)的方法,以快速鑒定肉食品中的腸桿菌科細(xì)菌,采用與腸桿菌科細(xì)菌16S rRNA保守序列互補(bǔ)的探針Enter1432并驗(yàn)證其特異性。結(jié)果表明:6種腸桿科細(xì)菌與探針Enter1432雜交率均在90%以上,而5種非腸桿菌科細(xì)菌與探針雜交率均低于1%;與SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,F(xiàn)ISH-FCM定量檢測法全程約需4~5 h,檢測8份豬肉樣品中腸桿菌科細(xì)菌數(shù)為1.4萬~640萬個(gè)/g,4份雞肉樣品中腸桿菌科細(xì)菌數(shù)為5.0萬~21萬個(gè)/g,檢出率為100%。綜上所述,研究建立的FISH-FCM法可快速檢測肉品中的腸桿菌科細(xì)菌,適于食品衛(wèi)生、臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

        關(guān)鍵詞:熒光原位雜交;流式細(xì)胞術(shù);腸桿菌科;快速定量檢測

        中圖分類號: TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2016)07-0336-03

        腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌是一類分布極為廣泛的革蘭氏陰性菌,包括對人致病性較強(qiáng)的埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、耶爾森菌屬細(xì)菌[1]。腸桿菌作為歐盟各國食品衛(wèi)生檢查中重要的指標(biāo)細(xì)菌,是國際間食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、水平測試的必測項(xiàng)目之一。目前,我國仍以大腸菌群、糞大腸菌群作為食品衛(wèi)生指標(biāo)菌。以腸桿科菌替代大腸菌群、糞大腸菌群作為檢測指標(biāo)可消除因后者產(chǎn)氣特性隨檢驗(yàn)方法、試驗(yàn)條件不同而造成結(jié)果的不準(zhǔn)確性[2]。由于我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)管理不當(dāng),出口畜禽產(chǎn)品中腸桿菌科細(xì)菌檢測超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,易被歐盟發(fā)達(dá)國家市場拒絕,進(jìn)而形成所謂的貿(mào)易壁壘。我國進(jìn)出口商檢局經(jīng)過多次修訂,制定了針對畜禽等農(nóng)產(chǎn)品中腸桿菌檢測的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》。該標(biāo)準(zhǔn)以傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法為基礎(chǔ),包括分離培養(yǎng)、生化判定,其步驟繁瑣,時(shí)間冗長,工作量大,得到報(bào)告結(jié)果通常需要3 d左右。過長的檢驗(yàn)時(shí)間使得生產(chǎn)部門延誤時(shí)間,增加成本,造成一定的經(jīng)濟(jì)損失,而且無法應(yīng)對緊急情況。因此,各級食品衛(wèi)生防疫部門迫切需要一種快速準(zhǔn)確定量檢測腸桿菌的方法。本研究通過利用熒光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合(FISH-FCM)對畜禽肉產(chǎn)品中腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行定量檢測,并與傳統(tǒng)行標(biāo)方法進(jìn)行比較,探討FISH-FCM在食品安全衛(wèi)生領(lǐng)域中應(yīng)用的可行性。

        1 材料與方法

        1.1 待檢樣品

        本試驗(yàn)檢測的8份豬肉樣品、4份雞肉鮮樣品分別隨機(jī)取自江蘇省揚(yáng)州市A、B、C、D等4個(gè)不同的農(nóng)貿(mào)市場。

        1.2 菌種

        本試驗(yàn)中所采用的部分細(xì)菌(大腸桿菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所唐夢君老師、龔建森老師提供。

        1.3 寡核苷酸探針

        根據(jù)Sghir等報(bào)道[3],試驗(yàn)采用腸桿科細(xì)菌特異性探針Enter1432,序列為5′-CTTTTGCAACCCACT-3′。其中5′端由異硫氰酸酯熒光素FITC(Abs/Em=494/520)標(biāo)記,由寶生物工程(大連)有限公司合成并標(biāo)記探針。

        1.4 FISH-FCM法驗(yàn)證探針的特異性

        將大腸桿菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、屎腸球菌11種菌株按照常規(guī)劃線培養(yǎng)法獲得單菌落,在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),將細(xì)菌濃度調(diào)整為0.1億個(gè)/mL,雜交方法參照Vaahtovuo等的報(bào)道[4-5]并有所改進(jìn):(1)取200 μL菌液,用等體積8%多聚甲醛溶液于4 ℃固定1 h;(2)固定完畢后,將樣品于12 000 g高速離心10 min,用PBS緩沖液洗滌3次;(3)取 10 μL 固定的菌液,加入85 μL預(yù)熱的雜交緩沖液(0.9 mol/L NaCl,pH值7.2的20 mmol/L Tris-HCl,0.1% SDS)中,加入5 μL 100 ng/μL 探針,50 ℃雜交2 h;(4)在1 mL PBS緩沖液中加入50 μL雜交溶液,渦旋振蕩;(5)將溶液上流式細(xì)胞儀(BD FACSCaliburTM,Becton Dickinson,美國),對每個(gè)樣品分析2 000 個(gè)物體。

        1.5 FISH-FCM法檢測樣品

        鮮肉樣品前處理步驟同SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》,制備成稀釋10倍的肉樣液。取1 mL肉樣液,80 g低速離心1 min,去除雜質(zhì)。其余雜交方法同上,制備“1.4”節(jié)步驟(5)中的液體,加入10 μL 0.5 mg/mL 碘化丙啶,37 ℃避光孵育20 min。加入50 μL 1 000個(gè)/μL熒光微球(CountBringhtTM,Invitrogeon,美國)。混合溶液上樣于流式細(xì)胞儀分析,每個(gè)樣品分析10 000個(gè)物體。

        1.6 培養(yǎng)法檢測樣品

        按照SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》中相應(yīng)方法檢測樣品。

        1.7 試驗(yàn)方法

        用CellQuest Pro軟件(版本5.2.1,Becton Dickinson,美國)分析。在dot plot 圖上,x軸表示雜交結(jié)合熒光探針的目的細(xì)菌的熒光強(qiáng)度,y軸表示DNA染料的熒光強(qiáng)度。按照以下公式計(jì)算肉樣品中的細(xì)菌數(shù)量:

        AB×CD×104=測定樣本的細(xì)菌濃度。

        式中:A為目的細(xì)菌所占比例,%;B為熒光微球所占比例,%;C為測定樣本中的熒光的數(shù)量,個(gè);D為測定樣本的體積或質(zhì)量,g/μL。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 FISH-FCM法驗(yàn)證探針Enter1432的有效性

        由圖1-A可知,目標(biāo)菌株幾乎未與探針Enter1432結(jié)合,在dot plot散點(diǎn)圖上處于Q4區(qū)域,呈陰性結(jié)果;由圖1-B可知,目標(biāo)菌株大部分與探針Enter1432結(jié)合,在dot plot散點(diǎn)圖上處于Q3區(qū)域,呈陽性結(jié)果。由表1可知,6種腸桿科細(xì)菌與探針Enter1432的雜交率為91.9%~95.7%,而5種非腸桿科細(xì)菌與探針的雜交率均低于1%。

        2.2 FISH-FCM法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較檢測肉樣品中的腸桿科細(xì)菌

        由圖2、表2可知,按照SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測8份豬肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量為0.63萬~53萬CFU/g,4份雞肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量為0.10萬~1.5萬CFU/g。用FISH-FCM法檢測8份豬肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量為1.4萬~640萬個(gè)/g,4份雞肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量為5.0萬~21萬個(gè)/g。

        3 結(jié)論與討論

        熒光原位雜交(FISH)法鑒定微生物最初應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[6-8],熒光素標(biāo)記的核酸探針可與目的細(xì)菌結(jié)合,使其在熒光顯微鏡下顯示出相應(yīng)顏色,該方法具有特異性高、直觀的特點(diǎn),但是由于通常情況下為保證統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性,操作人員需要選擇多達(dá)數(shù)10個(gè)視野進(jìn)行分析,這無疑增加了工作量,降低了試驗(yàn)效率。流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠?qū)渭?xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行理化、免疫及分子生物學(xué)等多參數(shù)性狀檢測的現(xiàn)代分析技術(shù),具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。已有研究將FISH與FCM相結(jié)合用于分析活性淤泥、海水樣品中目標(biāo)菌群的數(shù)量變化[9-10]。此外,近年來研究人員通過FISH-FCM法分析人體或動(dòng)物排出糞樣中有害菌、有益菌的數(shù)量變化,以監(jiān)測其健康[11-12]。環(huán)境中的物質(zhì)及人或動(dòng)物的腸道內(nèi)容物十分復(fù)雜,不僅含有大量細(xì)菌,還含有許多非細(xì)菌物質(zhì),包括食物殘?jiān)?、有機(jī)碎屑以及脫落細(xì)胞等。雖然目前FISH-FCM尚未被應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的檢測,但是該技術(shù)可應(yīng)用于上述如此復(fù)雜成分物質(zhì)的微生物分析檢測,筆者認(rèn)為對于食品而言,該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)該存在較強(qiáng)的可行性,并具有廣闊的應(yīng)用前景。

        在本試驗(yàn)中Enter1432探針與6種腸桿科細(xì)菌雜交率均在90%以上,而與非腸桿科細(xì)菌的雜交率均在1%以內(nèi),說明Enter1432探針在鑒定腸桿科細(xì)菌上具有較高的特異性,這與前人的研究結(jié)果[4,13]一致。在檢測豬、雞鮮肉樣品中腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量方面,經(jīng)SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》法檢測發(fā)現(xiàn),12份樣品中均檢測到腸桿菌科細(xì)菌,檢出率為100%,且腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量在0.1萬~53萬CFU/g 之間,不同樣品檢測結(jié)果差異較大。根據(jù)瑞士聯(lián)邦獸醫(yī)局1981年的標(biāo)準(zhǔn),生碎肉制品中腸桿科細(xì)菌含量的上限是500萬CFU/g,而近年歐盟對豬胴體的腸桿科細(xì)菌作出了更加嚴(yán)格且上限為3 lg CFU/cm2的規(guī)定,由此可見本試驗(yàn)中部分樣本腸桿菌科細(xì)菌污染較為嚴(yán)重。筆者推測,由于本試驗(yàn)中所采集的鮮肉樣本均來自傳統(tǒng)集市商販,肉品在經(jīng)過屠宰、加工、運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)中均存在污染的可能。由于歐盟對動(dòng)物屠宰過程的衛(wèi)生要求較高,對其加工過程控制進(jìn)行可追溯且肉品包裝后須急凍處理,從而抑制細(xì)菌繁殖,后期肉品多經(jīng)大型超市出售給消費(fèi)者,而我國目前大多數(shù)以攤販為主要特征的集市貿(mào)易手段在上述各個(gè)環(huán)節(jié)中對肉品的衛(wèi)生控制程度不高,細(xì)菌的繁殖滋生現(xiàn)象可能較為明顯,因此本試驗(yàn)采集的肉樣品存在較高的腸桿菌科細(xì)菌檢出率、檢出數(shù)量。

        本試驗(yàn)采用FISH-FCM法檢測肉樣品中的腸桿科細(xì)菌數(shù)量值是SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》中相應(yīng)檢測法的8.1~20.7倍。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只針對活的目標(biāo)細(xì)菌,對于已死亡或者弱活力細(xì)菌在培養(yǎng)操作過程中無法檢測出,而FISH-FCM法針對目標(biāo)細(xì)菌的DNA進(jìn)行定量,因此無論細(xì)菌的生存狀態(tài)如何,其均能被檢測出。其次,由于單個(gè)細(xì)菌、若干同類細(xì)菌在培養(yǎng)過程中均能形成單一菌落,而FISH-FCM針對的是細(xì)菌數(shù)?;谏鲜鲈颍現(xiàn)ISH-FCM法檢測出的細(xì)菌數(shù)要比培養(yǎng)法檢測出的菌落數(shù)高。

        綜上所述,鑒于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法耗時(shí)長、工作量大的特點(diǎn),本研究建立的FISH-FCM法可快速檢測肉品中的腸桿菌科細(xì)菌,適于食品衛(wèi)生和臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

        參考文獻(xiàn):

        [1]房 海,陳翠珍,張曉君. 腸桿菌科病原細(xì)菌[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2011.

        [2]Stiles M E,Ng L K. Enterobacteriaceae associated with meats and meat handling[J]. Applied and Environmental Microbiology,1981,41(4):867-872.

        [3]Sghir A,Gramet G,Suau A,et al. Quantification of bacterial groups within human fecal flora by oligonucleotide probe hybridization[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(5):2263-2266.

        [4]Vaahtovuoa J,Korkeamki M,Munukka E,et al. Microbial balance index—a view on the intestinal microbiota[J]. Pigs & Poultry,2007,109(1):174-178.

        [5]姜云濤,梁景平,李超倫,等. 熒光原位雜交技術(shù)和流式細(xì)胞儀在菌斑中致齲性變形鏈球菌定量檢測中的應(yīng)用[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究,2006,22(1):1-4.

        [6]Greisen K,Loeffelholz M,Purohit A,et al. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria,including bacteria found in cerebrospinal fluid[J]. Journal of Clinical Microbiology,1994,32(2):335-351.

        [7]Jansen G J,Mooibroek M,Idema J,et al. Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes[J]. Journal of Clinical Microbiology,2000,38(2):814-817.

        [8]何永貴,王 沛,鄔家平,等. 熒光原位雜交法快速鑒定血培養(yǎng)陽性葡萄球菌的臨床應(yīng)用[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2005,20(4):297-299.

        [9]Thurnheer T,Gmür R,Guggenheim B. Multiplex FISH analysis of a six-species bacterial biofilm[J]. Journal of Microbiological Methods,2004,56(1):37-47.

        [10]朱 琳. 環(huán)境硝化細(xì)菌熒光原位雜交檢測方法的建立及其應(yīng)用[D]. 南京:東南大學(xué),2005.

        [11]Kalliomki M,Collado M C,Salminen S,et al. Early differences in fecal microbiota composition in children may predict overweight[J]. The American Journal of Clinical Nutrition,2008,87(3):534-538.

        [12]Xie P,Wang Y,Wang C,et al. Effect of different fat sources in parental diets on growth performance,villus morphology,digestive enzymes and colorectal microbiota in pigeon squabs[J]. Archives of Animal Nutrition,2013,67(2):147-160.

        [13]Tsuruta T,Inoue R,Iwanaga T,et al. Development of a method for the identification of S-IgA-coated bacterial composition in mouse and human feces[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2010,74(5):968-973.

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