汪沐　謝鵬　唐夢君

摘要：為建立一種新的熒光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合（FISH-FCM）的方法，以快速鑒定肉食品中的腸桿菌科細(xì)菌，采用與腸桿菌科細(xì)菌16S rRNA保守序列互補(bǔ)的探針Enter1432并驗(yàn)證其特異性。結(jié)果表明：6種腸桿科細(xì)菌與探針Enter1432雜交率均在90%以上，而5種非腸桿菌科細(xì)菌與探針雜交率均低于1%；與SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，F(xiàn)ISH-FCM定量檢測法全程約需4～5 h，檢測8份豬肉樣品中腸桿菌科細(xì)菌數(shù)為1.4萬～640萬個(gè)/g，4份雞肉樣品中腸桿菌科細(xì)菌數(shù)為5.0萬～21萬個(gè)/g，檢出率為100%。綜上所述，研究建立的FISH-FCM法可快速檢測肉品中的腸桿菌科細(xì)菌，適于食品衛(wèi)生、臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

關(guān)鍵詞：熒光原位雜交；流式細(xì)胞術(shù)；腸桿菌科；快速定量檢測

中圖分類號： TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0336-03

腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細(xì)菌是一類分布極為廣泛的革蘭氏陰性菌，包括對人致病性較強(qiáng)的埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、耶爾森菌屬細(xì)菌[1]。腸桿菌作為歐盟各國食品衛(wèi)生檢查中重要的指標(biāo)細(xì)菌，是國際間食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、水平測試的必測項(xiàng)目之一。目前，我國仍以大腸菌群、糞大腸菌群作為食品衛(wèi)生指標(biāo)菌。以腸桿科菌替代大腸菌群、糞大腸菌群作為檢測指標(biāo)可消除因后者產(chǎn)氣特性隨檢驗(yàn)方法、試驗(yàn)條件不同而造成結(jié)果的不準(zhǔn)確性[2]。由于我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)管理不當(dāng)，出口畜禽產(chǎn)品中腸桿菌科細(xì)菌檢測超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，易被歐盟發(fā)達(dá)國家市場拒絕，進(jìn)而形成所謂的貿(mào)易壁壘。我國進(jìn)出口商檢局經(jīng)過多次修訂，制定了針對畜禽等農(nóng)產(chǎn)品中腸桿菌檢測的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》。該標(biāo)準(zhǔn)以傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，包括分離培養(yǎng)、生化判定，其步驟繁瑣，時(shí)間冗長，工作量大，得到報(bào)告結(jié)果通常需要3 d左右。過長的檢驗(yàn)時(shí)間使得生產(chǎn)部門延誤時(shí)間，增加成本，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，而且無法應(yīng)對緊急情況。因此，各級食品衛(wèi)生防疫部門迫切需要一種快速準(zhǔn)確定量檢測腸桿菌的方法。本研究通過利用熒光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合（FISH-FCM）對畜禽肉產(chǎn)品中腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行定量檢測，并與傳統(tǒng)行標(biāo)方法進(jìn)行比較，探討FISH-FCM在食品安全衛(wèi)生領(lǐng)域中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 待檢樣品

本試驗(yàn)檢測的8份豬肉樣品、4份雞肉鮮樣品分別隨機(jī)取自江蘇省揚(yáng)州市A、B、C、D等4個(gè)不同的農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 菌種

本試驗(yàn)中所采用的部分細(xì)菌（大腸桿菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所唐夢君老師、龔建森老師提供。

1.3 寡核苷酸探針

根據(jù)Sghir等報(bào)道[3]，試驗(yàn)采用腸桿科細(xì)菌特異性探針Enter1432，序列為5′-CTTTTGCAACCCACT-3′。其中5′端由異硫氰酸酯熒光素FITC（Abs/Em=494/520）標(biāo)記，由寶生物工程（大連）有限公司合成并標(biāo)記探針。

1.4 FISH-FCM法驗(yàn)證探針的特異性

將大腸桿菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、屎腸球菌11種菌株按照常規(guī)劃線培養(yǎng)法獲得單菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)菌濃度調(diào)整為0.1億個(gè)/mL，雜交方法參照Vaahtovuo等的報(bào)道[4-5]并有所改進(jìn)：（1）取200 μL菌液，用等體積8%多聚甲醛溶液于4 ℃固定1 h；（2）固定完畢后，將樣品于12 000 g高速離心10 min，用PBS緩沖液洗滌3次；（3）取 10 μL 固定的菌液，加入85 μL預(yù)熱的雜交緩沖液（0.9 mol/L NaCl，pH值7.2的20 mmol/L Tris-HCl，0.1% SDS）中，加入5 μL 100 ng/μL 探針，50 ℃雜交2 h；（4）在1 mL PBS緩沖液中加入50 μL雜交溶液，渦旋振蕩；（5）將溶液上流式細(xì)胞儀（BD FACSCaliburTM，Becton Dickinson，美國），對每個(gè)樣品分析2 000 個(gè)物體。

1.5 FISH-FCM法檢測樣品

鮮肉樣品前處理步驟同SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》，制備成稀釋10倍的肉樣液。取1 mL肉樣液，80 g低速離心1 min，去除雜質(zhì)。其余雜交方法同上，制備“1.4”節(jié)步驟（5）中的液體，加入10 μL 0.5 mg/mL 碘化丙啶，37 ℃避光孵育20 min。加入50 μL 1 000個(gè)/μL熒光微球（CountBringhtTM，Invitrogeon，美國）。混合溶液上樣于流式細(xì)胞儀分析，每個(gè)樣品分析10 000個(gè)物體。

1.6 培養(yǎng)法檢測樣品

按照SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》中相應(yīng)方法檢測樣品。

1.7 試驗(yàn)方法

用CellQuest Pro軟件（版本5.2.1，Becton Dickinson，美國）分析。在dot plot 圖上，x軸表示雜交結(jié)合熒光探針的目的細(xì)菌的熒光強(qiáng)度，y軸表示DNA染料的熒光強(qiáng)度。按照以下公式計(jì)算肉樣品中的細(xì)菌數(shù)量：

AB×CD×104=測定樣本的細(xì)菌濃度。

式中：A為目的細(xì)菌所占比例，%；B為熒光微球所占比例，%；C為測定樣本中的熒光的數(shù)量，個(gè)；D為測定樣本的體積或質(zhì)量，g/μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 FISH-FCM法驗(yàn)證探針Enter1432的有效性

由圖1-A可知，目標(biāo)菌株幾乎未與探針Enter1432結(jié)合，在dot plot散點(diǎn)圖上處于Q4區(qū)域，呈陰性結(jié)果；由圖1-B可知，目標(biāo)菌株大部分與探針Enter1432結(jié)合，在dot plot散點(diǎn)圖上處于Q3區(qū)域，呈陽性結(jié)果。由表1可知，6種腸桿科細(xì)菌與探針Enter1432的雜交率為91.9%～95.7%，而5種非腸桿科細(xì)菌與探針的雜交率均低于1%。

2.2 FISH-FCM法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較檢測肉樣品中的腸桿科細(xì)菌

由圖2、表2可知，按照SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測8份豬肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量為0.63萬～53萬CFU/g，4份雞肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量為0.10萬～1.5萬CFU/g。用FISH-FCM法檢測8份豬肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量為1.4萬～640萬個(gè)/g，4份雞肉樣品中腸桿科細(xì)菌數(shù)量為5.0萬～21萬個(gè)/g。

3 結(jié)論與討論

熒光原位雜交（FISH）法鑒定微生物最初應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[6-8]，熒光素標(biāo)記的核酸探針可與目的細(xì)菌結(jié)合，使其在熒光顯微鏡下顯示出相應(yīng)顏色，該方法具有特異性高、直觀的特點(diǎn)，但是由于通常情況下為保證統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性，操作人員需要選擇多達(dá)數(shù)10個(gè)視野進(jìn)行分析，這無疑增加了工作量，降低了試驗(yàn)效率。流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠?qū)渭?xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行理化、免疫及分子生物學(xué)等多參數(shù)性狀檢測的現(xiàn)代分析技術(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。已有研究將FISH與FCM相結(jié)合用于分析活性淤泥、海水樣品中目標(biāo)菌群的數(shù)量變化[9-10]。此外，近年來研究人員通過FISH-FCM法分析人體或動(dòng)物排出糞樣中有害菌、有益菌的數(shù)量變化，以監(jiān)測其健康[11-12]。環(huán)境中的物質(zhì)及人或動(dòng)物的腸道內(nèi)容物十分復(fù)雜，不僅含有大量細(xì)菌，還含有許多非細(xì)菌物質(zhì)，包括食物殘?jiān)?、有機(jī)碎屑以及脫落細(xì)胞等。雖然目前FISH-FCM尚未被應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的檢測，但是該技術(shù)可應(yīng)用于上述如此復(fù)雜成分物質(zhì)的微生物分析檢測，筆者認(rèn)為對于食品而言，該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)該存在較強(qiáng)的可行性，并具有廣闊的應(yīng)用前景。

在本試驗(yàn)中Enter1432探針與6種腸桿科細(xì)菌雜交率均在90%以上，而與非腸桿科細(xì)菌的雜交率均在1%以內(nèi)，說明Enter1432探針在鑒定腸桿科細(xì)菌上具有較高的特異性，這與前人的研究結(jié)果[4，13]一致。在檢測豬、雞鮮肉樣品中腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量方面，經(jīng)SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》法檢測發(fā)現(xiàn)，12份樣品中均檢測到腸桿菌科細(xì)菌，檢出率為100%，且腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量在0.1萬～53萬CFU/g 之間，不同樣品檢測結(jié)果差異較大。根據(jù)瑞士聯(lián)邦獸醫(yī)局1981年的標(biāo)準(zhǔn)，生碎肉制品中腸桿科細(xì)菌含量的上限是500萬CFU/g，而近年歐盟對豬胴體的腸桿科細(xì)菌作出了更加嚴(yán)格且上限為3 lg CFU/cm2的規(guī)定，由此可見本試驗(yàn)中部分樣本腸桿菌科細(xì)菌污染較為嚴(yán)重。筆者推測，由于本試驗(yàn)中所采集的鮮肉樣本均來自傳統(tǒng)集市商販，肉品在經(jīng)過屠宰、加工、運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)中均存在污染的可能。由于歐盟對動(dòng)物屠宰過程的衛(wèi)生要求較高，對其加工過程控制進(jìn)行可追溯且肉品包裝后須急凍處理，從而抑制細(xì)菌繁殖，后期肉品多經(jīng)大型超市出售給消費(fèi)者，而我國目前大多數(shù)以攤販為主要特征的集市貿(mào)易手段在上述各個(gè)環(huán)節(jié)中對肉品的衛(wèi)生控制程度不高，細(xì)菌的繁殖滋生現(xiàn)象可能較為明顯，因此本試驗(yàn)采集的肉樣品存在較高的腸桿菌科細(xì)菌檢出率、檢出數(shù)量。

本試驗(yàn)采用FISH-FCM法檢測肉樣品中的腸桿科細(xì)菌數(shù)量值是SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》中相應(yīng)檢測法的8.1～20.7倍。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只針對活的目標(biāo)細(xì)菌，對于已死亡或者弱活力細(xì)菌在培養(yǎng)操作過程中無法檢測出，而FISH-FCM法針對目標(biāo)細(xì)菌的DNA進(jìn)行定量，因此無論細(xì)菌的生存狀態(tài)如何，其均能被檢測出。其次，由于單個(gè)細(xì)菌、若干同類細(xì)菌在培養(yǎng)過程中均能形成單一菌落，而FISH-FCM針對的是細(xì)菌數(shù)?；谏鲜鲈颍現(xiàn)ISH-FCM法檢測出的細(xì)菌數(shù)要比培養(yǎng)法檢測出的菌落數(shù)高。

綜上所述，鑒于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法耗時(shí)長、工作量大的特點(diǎn)，本研究建立的FISH-FCM法可快速檢測肉品中的腸桿菌科細(xì)菌，適于食品衛(wèi)生和臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

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