楊晶晶 方永軍 張鴻韜 龍翔宇 秦云霞 陽江華 肖小虎

關鍵詞：巴西橡膠樹；Ca2+-ATPase（ACA/ECA）；基因家族；生物學功能；表達分析

鈣離子（Ca2+）作為植物細胞的第二信使幾乎參與了植物生長發(fā)育的各個方面，包括對生物和非生物脅迫的反應[1]。植物細胞內Ca2+信號的傳遞主要是通過改變細胞內外鈣離子濃度實現(xiàn)的，而Ca2+濃度的變化則主要由膜上的跨膜轉運蛋白進行控制[2]。植物細胞的Ca2+轉運主要由鈣離子通道、鈣離子反向轉運蛋白和鈣離子泵[3]，Ca2+-ATPase屬于P-型ATP酶離子超家族的P2分支，根據(jù)其蛋白質氨基酸序列和生化特征方面的差異分為2個亞家族（P2A和P2B），也分別稱為內質網(wǎng)型Ca2+-ATPase（ER-typecalciumATPase，ECA，P2A）和自抑制的質膜（PM）型Ca2+-ATPase（autoinhibitedcalciumATPase，ACA，P2B）[4]。在植物細胞中，定位于質膜和內質網(wǎng)中的P型Ca2+-ATP酶被認為在調節(jié)細胞質Ca2+濃度方面起重要作用[5]，同時P型Ca2+-ATP酶在植物生長發(fā)育的各個方面都是不可或缺的，包括花粉管生長、細胞程序性死亡、根部尖端生長，以及生物和非生物脅迫應答（如低溫、高溫、鹽脅迫、干旱和滲透脅迫等）、共生等方面[3]。目前已經(jīng)在擬南芥[6]、水稻[7]、白菜[8]、茄科植物[9]、苜蓿[10]等植物中鑒定得到ACA/ECA基因家族多個成員，并對其在植物中的功能進行了研究。研究表明，在擬南芥中，ACA8基因功能的缺失能顯著提高擬南芥對零下低溫的抗凍性[11]；在低鈣環(huán)境下，ECA1表達受到干擾的轉基因株系耐受低Ca2+（0.2mmol/L）或高Mn2+（0.5mmol/L）脅迫的能力降低[12]。水稻ACA/ECA家族由15個成員組成，其中有3個屬于內質網(wǎng)膜型鈣離子泵，12個屬于自抑制型鈣離子泵，鹽、干旱和ABA脅迫可以顯著激活OsACA6的表達，但熱脅迫激活作用相對較弱[13]。ACA/ECA家族在大白菜不同組織中表達模式不同，5個成員編碼蛋白定位于細胞膜上，其中Bra002762、Bra035649、Bra031701與低溫和鹽脅迫響應有關，而Bra003276和Bra024117與自交不親和性相關[5]，大白菜缺少ECA基因會導致新葉生長緩慢，葉片枯萎黃化[14]。在茄科植物中，低溫和鹽脅迫處理后，SLyECA1基因表達豐度較高，且處理前后表達趨勢變化明顯，說明SLyACA1基因可能是提高植株抗性的關鍵基因[9]。野生大豆Ca2+ATPase基因GsACA1在苜蓿中超量表達，能夠顯著提高轉基因苜蓿的耐鹽堿性[10]。以上研究表明，ACA/ECA基因家族成員在多種植物中均發(fā)揮了重要作用。

巴西橡膠樹是大戟科橡膠樹屬喬木，其產生的膠乳是天然橡膠生成的主要原料。天然橡膠（naturalrubber）是一種以聚異戊二烯為主要成分的天然高分子化合物，與合成橡膠相比天然橡膠性能更加優(yōu)良，在很多方面具有不可替代性，可用于生產飛機輪胎、手套等數(shù)萬種橡膠制品，在軍事、醫(yī)療、運輸?shù)刃袠I(yè)起著非常重要的作用[15]，中國是目前為止世界上最大的天然橡膠消費國，年消費量占全世界總消費量的40%以上，但自給率不足為15%[16]。理論預測，以及生產上出現(xiàn)的高產橡膠樹單株都顯示出巴西橡膠樹還具有巨大的產膠潛能[17-18]。目前已知的2500余種產膠植物中橡膠樹表現(xiàn)出優(yōu)異的產膠能力，推測與橡膠樹中高豐度表達的橡膠延伸因子/小橡膠粒子蛋白（REF/SRPP）基因家族發(fā)生擴增有關[19]。已有研究表明，REF/SRPP基因[20]、HbNN2基因[21]、蔗糖轉運蛋白HbSUT3[22]對橡膠樹產膠具有重要作用。生產上，割膠和乙烯刺激都能顯著提高膠乳產量，表明激素和傷害信號的傳遞與橡膠生物合成關系密切。鈣離子是植物細胞內重要的信號傳遞因子，在植物應對生物和非生物脅迫方面具有重要功能，而目前關于鈣離子泵ACA/ECA家族在橡膠樹中的研究卻未見報道。本研究以已發(fā)表植物ACA/ECA蛋白序列為探針從橡膠樹轉錄組和基因組中鑒定出橡膠樹ACA/ECA家族的全體成員，并從理化性質、系統(tǒng)進化和表達模式等方面進行了全面系統(tǒng)的分析。研究結果將為進一步研究ACA/ECA基因在橡膠樹乳管鈣離子信號的傳遞，以及橡膠樹生長發(fā)育和逆境脅迫應答等方面的功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試材料均來自于海南省儋州市中國熱帶農業(yè)科學院試驗基地。用于表達分析的不同組織材料（葉片、樹皮、膠乳、種子、雄花、雌花等6種組織）均來自于正常開割2年的熱研7-33-97橡膠樹。由于生產上開割樹多為嫁接苗，根部并非熱研7-33-97品種，因而本研究選用熱研7-33-97組培苗的根作為根材料。為了分析乙烯刺激對基因表達的影響，對正常開割2年的熱研7-33-97橡膠樹（未涂抹過乙烯利，割膠頻率為3d1刀）進行乙烯利刺激試驗，提前0、3、12、24h將1.5%的乙烯利涂抹在橡膠樹割面，然后在同一時間點采集膠乳樣品。為了進一步研究割膠對ACA/ECA基因表達的影響，選取相鄰2個林段，PR107品系和熱研8-79的未開割橡膠樹，同時進行3d1刀割膠，分別在第1、3、5、7、9刀采集膠乳樣品。利用試劑盒提取以上樣品的RNA，送往北京百邁克公司進行二代illumina轉錄組測序。

1.2方法

1.2.1橡膠樹ACA/ECA家族成員鑒定及理化性質分析根據(jù)文獻[6]的方法，從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載模式植物擬南芥的ACA/ECA蛋白序列，以擬南芥蛋白序列作為探針，通過本地服務器進行blastp比對（參數(shù)e值為1e-4），得到候選橡膠樹ACA/ECA家族成員。利用在線軟件CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）對候選ACA/ECA家族成員所包含的結構域進行進一步鑒定分析，得到橡膠樹ACA/ECA家族成員。利用在線軟件Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）和Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對橡膠樹ACA/ECA基因家族成員的氨基酸分子量、蛋白長度、理論等電點以及亞細胞定位進行分析。

1.2.2構建系統(tǒng)進化樹以及基因結構圖在NCBI網(wǎng)站通過blastp比對檢索并下載水稻、楊樹和木薯的ACA/ECA蛋白序列，使用多序列比對軟件在線mafft（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software/）對擬南芥、水稻、楊樹、橡膠樹和木薯5種植物的蛋白序列進行比對，使用MEGA6.0[23]軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)bootstrap設置為1000，利用在線軟件Figtree（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）對進化樹進行調整；利用基因組序列和基因組注釋GFF3文件對橡膠樹ACA/ECA基因家族進行基因結構分析，通過GSDS（http：//gsds.gao-lab.org/）[24]在線軟件結合系統(tǒng)進化樹繪制出橡膠樹ACA/ECA基因結構圖。

1.2.3橡膠樹ACA/ECA家族成員染色體定位分析利用Tbtools[25]軟件，根據(jù)橡膠樹GFF3文件相關信息繪制出橡膠樹ACA/ECA基因家族的染色體定位圖；利用MCscanX軟件對橡膠樹基因組進行共線性分析，繪制染色體之間的共線性連線[26]。

1.2.4橡膠樹ACA/ECA家族成員表達模式分析利用本實驗室轉錄組數(shù)據(jù)，對ACA/ECA家族成員在不同組織中、乙烯利處理不同時間點以及割膠處理條件下的表達進行分析[27]。將測序得到的轉錄組數(shù)據(jù)上傳到本地服務器，利用RSEM[28]軟件包進行表達分析得到每個基因的FPKM值，利用Tbtools軟件中的HeatMap小程序繪制熱圖。

2結果與分析

2.1橡膠樹ACA/ECA家族成員鑒定及理化性質分析

利用已發(fā)表模式植物擬南芥的ACA/ECA蛋白序列[6]，通過BLAST比對篩選橡膠樹ACA/ECA基因家族候選成員，并利用在線軟件CD-Search對候選成員的蛋白結構域進行進一步鑒定，最終鑒定得到45個ACA/ECA基因家族成員，其中包含38個ACA和7個ECA亞家族成員，分別命名為HbACA1～HbACA38和HbECA1～HbECA7。橡膠樹ACA/ECA基因編碼的蛋白分子量在10048.04Da（HbACA26）～125412.75Da（HbACA36）之間，理論等電點在5.18（HbACA18）～9.21（HbACA26）之間，45個成員中30個成員等電點均小于7，說明大多屬于酸性蛋白。亞細胞定位結果顯示，橡膠樹ACA/ECA基因家族成員大多定位于細胞膜（表1）。

2.2系統(tǒng)進化樹的構建及基因結構分析

為了比較擬南芥（Arabidopsisthaliana，At）、木薯（Manihotesculenta，Me）、楊樹（Populustrichocarpa，Pt）、水稻（Oryzasativa，Os）4種植物和橡膠樹（Heveabrasiliensis，Hb）ACA/ECA蛋白在進化上的相互關系，利用mafft軟件對5種植物蛋白序列進行多序列比對，并用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，然后用Figtree軟件對進化樹進行修飾。從進化樹可以看出（圖1），ACA/ECA基因家族成員分別聚于ACA和ECA兩個不同分支，橡膠樹與木薯的ACA/ECA成員聚在一起，這與系統(tǒng)進化上木薯與橡膠樹的親緣關系較近是一致的；其中HbACA13、HbACA12、HbACA11、HbACA10、HbACA9、HbACA8和HbACA35聚集在同一個小分支，并且這7個成員均位于LGO2號染色體上，推測這7個成員是通過串聯(lián)復制進化而來。

利用基因組GFF3注釋文件對橡膠樹ACA/ECA基因家族成員進行基因結構分析，并通過GSDS軟件結合進化樹繪制內含子-外顯子結構圖（圖2）。在橡膠樹45個ACA/ECA基因家族成員中，35個成員含有內含子，包括26個ACA和7個ECA成員，橡膠樹ACA/ECA家族成員內含子數(shù)量在0～33之間，存在明顯差異。同一分支上的成員在內含子數(shù)目和位置方面相對一致，除HbACA12、HbACA24、HbACA20、HbACA22、ACA25、HbACA15和HbACA16等12個成員無內含子外，其他成員均存在1～33個內含子；部分成員出現(xiàn)了較大數(shù)目的內含子，如HbACA31、HbACA34、HbACA38和HbECA1的內含子數(shù)目在30～33之間。

2.3橡膠樹ACA/ECA基因家族成員染色體定位分析

從45個ACA/ECA基因家族染色體定位圖可看出（圖3），45個成員分布在14條染色體上，LG02和LG09號染色體上分布有最多的成員，均為11個，LG16染色體上有4個成員，LG08染色體分布有3個成員，LG07、LG03、LG12、LG05、LG14染色體上均有2個成員，LG06、LG01、LG10、LG13、LG11染色體上分布最少，均為1個成員，另外，contig上也有1個成員。進一步分析發(fā)現(xiàn)，LG02和LG09號染色體上的成員大部分成簇分布，LG08、LG12、LG14和LG16四條染色體上有成員成對分布，這些成員可能是通過串聯(lián)重復復制而來，表明這些ACA/ECA家族成員蛋白序列具有較高的相似性，可能具有類似的生物學功能。藍色線連接表明成員之間具有共線性，在進化過程中通過染色體加倍或大片段復制形成。

2.4橡膠樹ACA/ECA基因家族表達分析

利用本實驗室轉錄組數(shù)據(jù)對45個橡膠樹ACA/ECA基因家族成員在不同組織（膠乳、樹皮、葉片、種子、根、雌花和雄花）、乙烯利和割膠處理下的膠乳的表達情況進行分析并繪制熱圖。從橡膠樹ACA/ECA基因家族成員在不同組織中的表達可以看出（圖4），HbACA1、HbACA3、HbACA36、HbECA1、HbECA6和HbECA7功能較為保守，在各組織中均有表達；HbACA2在膠乳中特異高表達，而在其他組織中低表達或不表達，表現(xiàn)出組織特異性。另外，除HbACA2外，HbACA36、HbACA38和HbECA7四個成員在膠乳中的表達豐度也比較高，其中HbACA36在膠乳表達豐度最高；在葉片中，HbECA6、HbECA7、HbACA1、HbACA31和HbACA36表達豐度相對較高，其中HbACA31表達豐度最高；在樹皮中，HbECA6、HbECA7、HbACA1、HbACA31、HbACA36、HbACA26和HbACA3表達豐度較高。HbECA7在葉片、樹皮和根等多種組織中都有相對較高的表達，說明該成員可能在橡膠樹鈣離子運輸方面具有重要功能。

乙烯利刺激是橡膠生產中常用的一種增產手段，為了進一步研究橡膠樹ACA/ECA基因在乙烯利刺激后膠乳中的表達，本課題組在乙烯利處理后的4個不同時間點（0、3、12、24h）對ACA/ECA基因家族成員在膠乳中的表達進行了分析（圖5）。經(jīng)乙烯利處理后HbACA2、HbACA36、HbACA38、HbECA7四個成員表達呈上升趨勢，其中HbACA36在乙烯利處理24h后呈現(xiàn)高豐度表達，并且在處理前后相對于其他成員都處于較高表達水平，這和之前不同組織表達分析的結果一致。HbACA3在乙烯利處理后上調表達，HbECA5在膠乳中低表達或不表達但經(jīng)乙烯利刺激24h后上調表達。結合染色體定位圖來看，HbACA36和HbACA38有較高同源性，但在表達上卻存在差異，HbACA36表達豐度更高，并且乙烯利刺激后表達變化也更明顯，推測HbACA36在乳管鈣離子運輸方面起主要作用。研究結果表明，部分成員乙烯利刺激后在膠乳中的表達呈明顯的上升趨勢，推測這些成員可能在乳管膠乳再生方面發(fā)揮重要作用。

在橡膠生產中發(fā)現(xiàn)，割膠能夠促進橡膠樹產膠。為了進一步分析割膠對橡膠樹ACA/ECA基因家族成員表達的影響，選用2種不同產量水平的未開割橡膠樹品種進行割膠試驗，包括相對低產的PR107和高產品種熱研8-79；同時對2個品種的已開割橡膠樹進行割膠試驗，通過轉錄組測序對基因的表達進行分析。由圖6可以看出，在割膠過程中ACA/ECA基因家族成員在PR107和熱研8-79中的表達趨勢整體一致，如HbECA6、HbECA7、HbACA1、HbACA2、HbACA3、HbACA36、HbACA37和HbACA38在2個品種的割膠過程中均有表達。其中HbACA36在PR107和熱研8-79割膠過程中均處于較高的表達水平，這與前面不同組織以及乙烯利處理的試驗結果一致。但是HbACA36在熱研8-79割膠過程的表達表現(xiàn)出明顯的上升趨勢（第1、3、5、7、9刀的FPKM值分別為206.19、221.96、281.45、353.36、355.59），而HbACA36在PR107中的表達則表現(xiàn)出先下降后上升再下降的表達趨勢（第1、3、5、7、9刀的FPKM值分別為212.89、160.28、209.92、205.15、159.48），HbACA36在熱研8-79中的整體表達水平高于PR107，這可能與熱研8-79的高產具有一定的相關性。此外，HbACA18和HbACA19經(jīng)割膠處理后僅在熱研8-79中表達，再次說明橡膠樹ACA/ECA基因家族成員在2個品種中的表達存在一定差異。

3討論

Ca2+-ATPase（ACA/ECA）在植物逆境脅迫應答和生長發(fā)育等方面起重要作用[28]，目前，在擬南芥[6]、大白菜[8]、茄科植物[9]等多種植物中鑒定得到ACA/ECA家族成員，并對部分家族成員的功能進行了系統(tǒng)分析，而關于ACA/ECA基因在橡膠樹中的功能的研究還未見報道。天然橡膠是重要的戰(zhàn)略物質，在工業(yè)和國防等方面發(fā)揮著重要作用，橡膠樹作為生產天然橡膠的唯一來源，其種植和生產一直備受關注[29]，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，天然橡膠的消耗也不斷增長，出現(xiàn)供不應求[30]，因而提高橡膠產量顯得尤為重要，鈣離子信號在乙烯刺激和割膠過程中的傳遞對增加膠乳產量促使乳管膠乳再生至關重要，因此探明ACA/ECA基因家族在橡膠樹中的功能有重要研究意義。本研究鑒定得到橡膠樹中45個ACA/ECA基因家族成員，包括38個ACA成員，7個ECA成員，其中ACA成員明顯多于ECA成員，這與其他植物的研究結果一致。從系統(tǒng)進化樹來看有2個明顯分支，在2個分支中橡膠樹與木薯ACA/ECA聚在一起，這與橡膠樹和木薯在系統(tǒng)進化上有較近的親緣關系是一致的。從染色體定位圖看，有成員成對或者成簇存在，其中2號和9號染色體上的部分成員聚在一起，結合進化樹可以看出，相對于楊樹和木薯等其他植物，橡膠樹ACA/ECA成員在部分分支上出現(xiàn)了擴張，并且擴張主要由串聯(lián)復制產生的。在表達方面，部分ACA/ECA成員在不同組織中的表達表現(xiàn)出組織特異性，如：HbACA2在膠乳中表達豐度較高，HbACA12在種子中表達豐度較高，而在其他組織中表達豐度很低或不表達；在膠乳中，HbACA2、HbACA36、HbACA38和HbECA7四個成員表達豐度相對較高，其中HbACA36在膠乳中表達豐度最高，并且明顯高于其他3個成員，推測HbACA36在乳管鈣離子轉運方面具有重要作用。乙烯利刺激和割膠是橡膠樹生產中最主要的2種增產手段，乙烯利處理后，HbACA36在膠乳中表達呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，在高產品種熱研8-79割膠過程中HbACA36的表達也表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，表明HbACA36在橡膠樹乳管中可能具有重要功能并且和橡膠樹的產量具有一定的相關性。綜上表明，HbACA36在橡膠樹乳管的信號傳遞方面起重要作用，進而影響橡膠樹乳管中的橡膠生物合成。本研究相關結果為進一步研究ACA/ECA基因的生物學功能，及其在乙烯刺激橡膠樹增產過程中的重要作用奠定了基礎。