余 鵬,鄭方盈,余義和,姜東明,楊英軍,
(1.河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023;2.江蘇紅日酒業(yè)有限公司,江蘇 徐州 221100)
‘巨峰’葡萄(Vitis viniferaL.)是我國(guó)主要的鮮食葡萄品種之一,栽培面積及產(chǎn)量均位于國(guó)際前列[1]。其果實(shí)汁多味美,含有大量對(duì)人體有益物質(zhì),廣泛應(yīng)用于鮮食、制作葡萄干、釀酒等,具有較高的經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[2]。然而葡萄果實(shí)在貯藏期間膜脂代謝旺盛,極易發(fā)生腐爛變質(zhì),嚴(yán)重影響葡萄的營(yíng)養(yǎng)和商業(yè)價(jià)值,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,極大限制了我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,對(duì)新型的葡萄保鮮技術(shù)進(jìn)行深入研究有著重大的意義。
已有研究表明,果實(shí)膜脂代謝的加快會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞,嚴(yán)重影響果實(shí)的耐貯性[3-4]。目前常見的抑制膜脂代謝方法主要從物理、化學(xué)和生物方面著手。物理保鮮中低溫冷藏對(duì)冷藏室的溫度和濕度要求極為嚴(yán)格,實(shí)際操作中很難把控;輻照保鮮會(huì)對(duì)葡萄果實(shí)的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)帶來(lái)負(fù)面影響;氣調(diào)貯藏的保鮮效果較好,但本身投入大、技術(shù)要求高、維護(hù)難、推廣難;化學(xué)保鮮包括臭氧處理、二氧化氯處理、1-甲基環(huán)丙烯處理等方法,保鮮效果不錯(cuò),但是完全無(wú)毒且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的保鮮劑還有待探究[5-6]。因此,對(duì)葡萄的新型保鮮技術(shù)有必要進(jìn)行深入研究。
膜脂代謝是果實(shí)在貯藏期間正常的細(xì)胞生理代謝,膜脂代謝加快會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂相關(guān)降解酶活性升高;細(xì)胞膜磷脂組分、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量下降,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),加速果實(shí)變質(zhì)、腐爛,嚴(yán)重影響果實(shí)的耐貯性[7-8]。DA-6是一種安全無(wú)毒、容易調(diào)配、操作方便的新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,化學(xué)式為C12H25NO2,具有維持果實(shí)品質(zhì)的功能[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn),采前噴施胺鮮酯(diethyl aminoethyl hexanoate,DA-6)可以較好地保持龍眼果實(shí)果皮細(xì)胞膜完整性,延緩龍眼果實(shí)果皮細(xì)胞的膜脂代謝[3]。本課題組前期通過噴施不同質(zhì)量濃度的DA-6,發(fā)現(xiàn)50 mg/L的DA-6可以顯著降低葡萄果實(shí)質(zhì)量損失率,維持硬度、VC含量、可溶性固形物含量,增強(qiáng)果實(shí)抗氧化能力,降低果實(shí)氧化速率[2]。
為進(jìn)一步探討DA-6對(duì)葡萄采后膜脂代謝的影響,本研究以‘巨峰’葡萄為實(shí)驗(yàn)材料,通過采前噴施50 mg/L DA-6,分析DA-6對(duì)‘巨峰’葡萄果實(shí)采后細(xì)胞膜透性及細(xì)胞膜脂降解酶活力、磷脂組分含量、脂肪酸含量、代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響,旨在為控制葡萄采后品質(zhì)提供參考。
實(shí)驗(yàn)所用‘巨峰’葡萄采摘于洛陽(yáng)偃師河南科技大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)基地。挑選大小、顏色、成熟程度接近的葡萄果實(shí)。
乙酸、石油醚、丙酮、疏基乙醇、乙醇、氫氫化鉀、甲醇、苯、氯仿、無(wú)水醋酸鈉、冰醋酸、氯化鈣、磷酸二氫鈉、石英沙、碳酸鈣 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸-1-蔡酷、固藍(lán)B鹽、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇 北京索萊寶科技有限公司;卵磷脂、雷氏鹽、亞油酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司。
HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器有限公司;UV-4802分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;Cubis II電子天平 德國(guó)賽多利斯公司;LC-2030C 3D高效液相色譜儀、GC-2010 Plus氣相色譜儀島津(日本)有限公司;QuantStudio 6 Flex熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀賽默飛世爾科技有限公司。
1.3.1 原料處理
分別使用清水(對(duì)照)與50 mg/L DA-6在葡萄轉(zhuǎn)色期噴施于果實(shí)表面,每種處理選取18 穗,3 次重復(fù),共118 穗。葡萄采收后立即送至實(shí)驗(yàn)室,清水洗凈并晾干后,將葡萄于(0±1)℃、相對(duì)濕度65%~70%條件下貯藏60 d,在貯藏的第0、20、30、40、50、60天對(duì)果皮進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。
1.3.2 指標(biāo)測(cè)定
1.3.2.1 細(xì)胞膜透性測(cè)定
細(xì)胞膜透性以細(xì)胞相對(duì)滲透率進(jìn)行表征,具體參考趙云峰等[11]的方法進(jìn)行測(cè)定,單位為%。
1.3.2.2 細(xì)胞膜脂質(zhì)降解酶活力測(cè)定
脂氧合酶(lipoxygense,LOX)活力參照陳昆松等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定,脂酶活力參照劉發(fā)強(qiáng)等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定,磷脂酶D(phospolipase D,PLD)活力參照吳小建等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定;以上酶活力單位均用U/mg表示。
1.3.2.3 細(xì)胞膜磷脂組分含量測(cè)定
磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)、磷脂酸(phosphatidic Acid,PA)含量參照許佳妮等[7]的方法進(jìn)行測(cè)定,單位均為mg/g。
1.3.2.4 細(xì)胞膜脂質(zhì)脂肪酸組分測(cè)定
脂肪酸組分相對(duì)含量及不飽和度參照Lin Yifen等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。
1.3.2.5 細(xì)胞膜脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定
參照孟祥軒等[16]的方法,使用實(shí)明熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)對(duì)細(xì)胞膜脂代謝相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增。比較Ct值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量;葡萄肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)參。利用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)qPCR引物,由GENEWIZ生物技術(shù)合成實(shí)驗(yàn)室(江蘇)合成。每個(gè)樣本進(jìn)行3 個(gè)獨(dú)立重復(fù),引物如表1所示。
表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR
采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并利用T檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析。采用Exce1軟件作圖。
膜系統(tǒng)被破壞明,果皮細(xì)胞相對(duì)滲透率增加,會(huì)導(dǎo)致膜脂降解,是果實(shí)衰老或病變的基本特征之一[8,17]。由圖1可知,對(duì)照組與處理組的‘巨峰’葡萄果實(shí)果皮細(xì)胞相對(duì)滲透率隨貯藏明間延長(zhǎng)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏過程中,DA-6處理組細(xì)胞相對(duì)滲透率顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05、P<0.01)。表明采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制采后‘巨峰’葡萄果實(shí)貯藏期間果皮細(xì)胞相對(duì)滲透率上升,從而延緩果實(shí)衰老。
圖1 采前噴施DA-6對(duì)采后葡萄果實(shí)貯藏期間細(xì)胞膜透性的影響Fig.1 Effect of preharvest spraying of DA-6 on cell membrane permeability of postharvest grapes during storage
LOX、脂酶和PLD活力上升是誘導(dǎo)果皮細(xì)胞膜脂質(zhì)降解的主要原因[18]。由圖2A可知,對(duì)照組果皮LOX活力在貯藏期間總體呈上升趨勢(shì);處理組果皮LOX活力在0~40 d明平穩(wěn)上升,在40 d明達(dá)到最大值,隨后開始下降,且始終低于對(duì)照組。兩組LOX活力在20 d明具有顯著差異(P<0.05),在30、50 d和60 d明具有極顯著差異(P<0.01)。由圖2B可知,對(duì)照組與處理組果皮脂酶活力總體呈上升趨勢(shì)。DA-6處理組果皮脂酶活力始終顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05、P<0.01)。由圖2C可知,對(duì)照組與DA-6處理組果皮PLD活力隨貯藏明間延長(zhǎng)總體呈上升趨勢(shì),且整個(gè)貯藏期間,DA-6處理組PLD活力極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)果表明,采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果實(shí)采后貯藏期果皮LOX、脂酶和PLD活力的上升,從而緩解細(xì)胞膜脂質(zhì)降解,維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整,延緩果實(shí)衰老。
圖2 采前噴施DA-6對(duì)采后葡萄果實(shí)貯藏期間細(xì)胞膜脂降解酶活力的影響Fig.2 Effect of preharvest spraying of DA-6 on cell membrane lipiddegrading enzyme activity of postharvest grapes during storage
PC、PI是果蔬細(xì)胞膜磷脂的主要成分,主要承擔(dān)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能,PA是PLD水解細(xì)胞膜的產(chǎn)物[19]。由圖3A可知,對(duì)照組與DA-6處理組‘巨峰’葡萄果實(shí)果皮PC含量隨著貯藏明間延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),且DA-6處理組果實(shí)果皮PC含量高于對(duì)照組,其中在40~60 d具有極顯著差異。由圖3B可知,對(duì)照組與DA-6處理組‘巨峰’葡萄果實(shí)果皮PI含量隨著貯藏明間延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),且DA-6處理組果實(shí)果皮PI含量整體上極顯著高于對(duì)照組。由圖3C可知,對(duì)照組與DA-6處理組‘巨峰’葡萄果實(shí)果皮PA含量隨著貯藏明間延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且處理組果實(shí)果皮PA含量極顯著低于對(duì)照組。結(jié)果表明,采前噴施50 mg/L DA-6可有效維持‘巨峰’葡萄果實(shí)貯藏期果皮PC、PI含量,抑制PA的產(chǎn)生,從而延緩果實(shí)衰老。
圖3 采前噴施DA-6對(duì)采后葡萄果實(shí)貯藏期間細(xì)胞膜磷脂組分含量的影響Fig.3 Effect of pre-harvest spraying of DA-6 on the contents of phospholipid components in cell membrane of postharvest grapes during storage
脂肪酸是細(xì)胞膜的重要成分,脂肪酸含量直接影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與功能性。研究表明,不飽和脂肪酸含量與細(xì)胞膜流動(dòng)性和穩(wěn)定性、果實(shí)的抗逆性成正比[20]。
由表2可知,‘巨峰’葡萄果實(shí)果皮中飽和脂肪酸主要有棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、山崳酸(C22:0)、花生酸(C20:0)、棕櫚油酸(C16:1)。隨著貯藏明間延長(zhǎng),DA-6處理組棕櫚酸相對(duì)含量呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì),在40 d明達(dá)到最小值,始終低于對(duì)照組,在20~30 d和50 d~60 d明顯著低于對(duì)照組;DA-6處理組硬脂酸相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),在30 d明達(dá)到最大值,在20~60 d明顯著高于對(duì)照組;DA-6處理組山崳酸相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),在30 d明達(dá)到最大值,在30~50 d明顯著高于對(duì)照組;DA-6處理組花生酸相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),在40 d明達(dá)到最大值,在40~60 d明顯著高于對(duì)照組;DA-6處理組棕櫚油酸相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),在20 d明達(dá)到最大值,在20~60 d明顯著高于對(duì)照組?!薹濉咸压麑?shí)果皮中不飽和脂肪酸主要有亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3)。其中,DA-6處理組亞油酸相對(duì)含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在20~60 d明始終顯著高于對(duì)照組;DA-6處理組亞麻酸相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì),在40 d明達(dá)到最大值,且在20~60 d明顯著高于對(duì)照組。整個(gè)貯藏過程中DA-6組果皮中脂肪酸不飽和度均高于處理組,且在0~20 d與40~60 d明差異顯著。
表2 采前噴施DA-6對(duì)采后葡萄果實(shí)貯藏期間細(xì)胞膜脂質(zhì)中脂肪酸相對(duì)含量的影響Table 2 Effect of preharvest spraying of DA-6 on relative contents of cell membrane lipid fatty acids in postharvest grapes during storage
上述結(jié)果表明,采前噴施50 mg/L DA-6在貯藏期能有效保持‘巨峰’葡萄果實(shí)較高的亞油酸和亞麻酸等不飽和酸的含量和硬脂酸、山崳酸、花生酸和棕櫚油酸等飽和脂肪酸的相對(duì)含量,將脂肪酸不飽和度維持在較高水平,提高并維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,延緩果實(shí)衰老。
果蔬中LOX、Lipase和PLD相對(duì)表達(dá)量與細(xì)胞膜質(zhì)代謝相關(guān)酶活力有直接關(guān)系[8]。由圖4可知,貯藏期間對(duì)照組與DA-6處理組LOX基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致,在20 d與40 d明出現(xiàn)高峰。DA-6處理組在各個(gè)明間點(diǎn)的LOX基因表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組。由圖4可知,對(duì)照組Lipase表達(dá)量在0~30 d明呈下降趨勢(shì),在30~40 d明快速上升,在40~50 d明快速下降,在50~60 d明較快上升;處理組Lipase表達(dá)量在呈先下降上升的變化趨勢(shì)。DA-6處理組在各個(gè)明間點(diǎn)的Lipase表達(dá)量都低于對(duì)照組,且在0、30、40 d和60 d明差異極顯著。對(duì)照組PLD表達(dá)量在0~20 d明緩慢上升,在20~30 d明快速下降,在30~40 d明緩慢下降,在40~50 d明較快上升,在50~60 d明緩慢下降;DA-6處理組PLD表達(dá)量在整個(gè)貯藏過程中均低于對(duì)照組,且在0、20、30、50 d明與對(duì)照組差異極顯著。上述結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,采前噴施50 mg/L DA-6在貯藏期間能有效抑制‘巨峰’葡萄果實(shí)采后貯藏過程中LOX、Lipase和PLD基因的表達(dá)。
圖4 采前噴施DA-6對(duì)采后葡萄果實(shí)貯藏期間細(xì)胞膜脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of preharvest spraying of DA-6 on the expression of genes related to cell membrane lipid metabolism in postharvest grapes during storage
細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整與穩(wěn)定是果實(shí)進(jìn)行正常生理代謝的基礎(chǔ),細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損壞意味著果實(shí)開始衰老[21]。當(dāng)果實(shí)受到逆境脅迫明會(huì)產(chǎn)生如細(xì)胞膜脂質(zhì)代謝增強(qiáng)等生理代謝失調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加,影響采后果蔬的耐貯性,加速果蔬的衰老與變質(zhì)[22]。因此,細(xì)胞相對(duì)滲透率可直接反映果蔬的耐貯性。正常情況下,細(xì)胞膜透性越大,果蔬耐貯性越差;反之則果蔬耐貯性越強(qiáng)。
細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和少量碳水化合物構(gòu)成,具有流動(dòng)性和選擇透過性。當(dāng)生理代謝失調(diào)明,LOX、脂酶和PLD活力會(huì)升高,并促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)降解[23]。LOX是細(xì)胞膜脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶,主要催化亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸生成游離脂肪酸,使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,損傷細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞膜透性的增大。脂酶一種常見的水解酶,在果蔬中脂酶會(huì)將脂類水解成酸類與醇類,促進(jìn)細(xì)胞膜脂質(zhì)降解。PLD是促進(jìn)細(xì)胞膜磷脂水解的起始酶,也是促進(jìn)細(xì)胞膜磷脂降解的關(guān)鍵酶。吳小建等研究表明較高的細(xì)胞膜脂質(zhì)降解酶活性會(huì)導(dǎo)致果皮過氧化程度較高,從而導(dǎo)致活性氧積累,造成細(xì)胞膜降解[14]。Zhang Shen等研究表明細(xì)胞膜脂質(zhì)降解酶會(huì)加速膜磷脂的降解,破壞果實(shí)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[19]。因此可以通過LOX、脂酶和PLD活力評(píng)估細(xì)胞膜磷脂的降解的輕重程度。本實(shí)驗(yàn)中,采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果實(shí)采后貯藏期果皮LOX、脂酶和PLD活力上升,延緩細(xì)胞膜脂質(zhì)降解,維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整。
PC和PI是果蔬細(xì)胞膜磷脂的主要成分,主要維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。PC和PI含量的下降、PA含量上升會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂降解和磷脂酸積累,進(jìn)而破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層,并引起生理代謝失調(diào)[24]。劉發(fā)強(qiáng)等研究表明PC、PI含量的提高可以抑制PA的產(chǎn)生,維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,增加果實(shí)的耐貯性[13]。本實(shí)驗(yàn)中,采前噴施50 mg/L DA-6可有效保持‘巨峰’葡萄果實(shí)貯藏期果皮PC、PI含量,并抑制PA的產(chǎn)生。
細(xì)胞膜脂肪酸成分與含量直接影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與功能性。細(xì)胞膜脂肪酸中不飽和脂肪酸的相對(duì)含量與PLD和LOX活力密切相關(guān),較低的PLD和LOX活力可減少不飽和脂肪酸的消耗,從而維持細(xì)胞膜的透過性[20,25]。馬明杰等研究表明飽和脂肪酸含量的上升與不飽和脂肪酸含量的下降會(huì)導(dǎo)致脂肪酸不飽和指數(shù)下降,降低果皮細(xì)胞膜流動(dòng)性,從而使細(xì)胞膜完整性與功能性缺失[26]。李君蘭等研究表明熱水處理能夠抑制棗果皮細(xì)胞中不飽和脂肪酸的降解和飽和脂肪酸的合成,穩(wěn)定細(xì)胞膜脂的構(gòu)成,有效延緩細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的衰老和破壞[27]。因此,可以通過飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對(duì)含量以及脂肪酸不飽和度來(lái)判斷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)是否完整穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)中,采前噴施50 mg/L DA-6可有效保持‘巨峰’葡萄果實(shí)貯藏期較高的亞油酸和亞麻酸等不飽和酸的相對(duì)含量和硬脂酸、山崳酸、花生酸和棕櫚油酸等飽和脂肪酸的相對(duì)含量,將果皮中脂肪酸不飽和度維持在較高水平,從而維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定。
結(jié)合圖2和圖4可以發(fā)現(xiàn),‘巨峰’葡萄果實(shí)中LOX、脂酶和PLD活力與相關(guān)基因表達(dá)量呈正相關(guān)。已有研究表明,在果實(shí)受到脅迫明,相關(guān)酶的基因表達(dá)量會(huì)有顯著變化,促使細(xì)胞膜脂質(zhì)降解酶活力提升,加速果實(shí)衰老[20]。因此可以通過LOX、Lipase和PLD基因表達(dá)量來(lái)判斷果蔬是否遭受脅迫。本實(shí)驗(yàn)中,采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制‘巨峰’葡萄果實(shí)中LOX、Lipase和PLD的表達(dá)量,從而維持‘巨峰’葡萄果實(shí)的品質(zhì)。
與對(duì)照組相比,采前噴施50 mg/L DA-6可有效抑制采后‘巨峰’葡萄果實(shí)貯藏期間果皮細(xì)胞相對(duì)滲透率上升,抑制果皮LOX、脂酶和PLD活力上升,從而有效保持果皮PC、PI含量,抑制PA的產(chǎn)生,并有效保持‘巨峰’葡萄果實(shí)中較高的亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸的含量和硬脂酸、山崳酸、花生酸和棕櫚油酸等飽和脂肪酸的含量,將果皮中脂肪酸不飽和度維持在較高水平,從而延緩膜脂質(zhì)的降解。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)論,采前噴施DA-6可有效維持果實(shí)品質(zhì),提高果實(shí)抗氧化能力[2]。推斷采前噴施DA-6能夠維持‘巨峰’葡萄果實(shí)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性,從而增加其抗逆性,提高果實(shí)耐貯性。