摘要：目的 采用高效液相色譜法建立銅綠假單胞菌代謝物綠膿菌素測定方法，并對綠膿菌素含量表達進行分析。方法 采用Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分離，柱溫40 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL，流動相為0.01%甲酸水—乙腈梯度洗脫，檢測波長為268 nm。結果 綠膿菌素在0.20～10.00 μg/mL范圍內線性關系良好；綠膿菌素方法檢出限為0.10 μg/mL，方法定量限為0.20 μg/mL；在0.22～0.66 μg/mL和1.10～3.30 μg/mL的添加范圍內，綠膿菌素的回收率（n=3）為94.85%～113.67%，方法精密度（RSD）小于0.61%。通過該方法初步測定，發(fā)現(xiàn)較低濃度左氧氟沙星對銅綠假單胞菌分泌綠膿菌素起促進作用，可能與其耐藥機制有關。結論 該方法簡便、準確，精密度和回收率良好，可用于綠膿菌素的檢測，對進一步研究銅綠假單胞菌耐藥機制和綠膿菌素分泌量的關系具有一定的指導意義。

關鍵詞： 銅綠假單胞菌；綠膿菌素；高效液相色譜法；左氧氟沙星；表達分析

中圖分類號：R978.1" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）04-0277-07

Expression Analysis of Pyocyanin by High Performance Liquid Chromatography

Hu Xiao-ai1， Long Shan-shan2， Zhang Dan2， Qie Zhen-zhen2， Li Xiang-yi2， Yang Chen2， Ren Feng-ying2

（1 Jingning Hospital of Traditional Chinese Medicine， Jingning，743400;

2 Key Laboratory of Medicinal and Edible Plant Resources Development of Sichuan Education Department，

Sichuan Institute of Antimicrobial Industry，" College of Pharmacy， Chengdu University，" "Chengdu" " 610106 ）

Abstract： Objective A method for the determination of Pseudomonas aeruginosa metabolite was established by high performance liquid chromatography， and the expression of pyocyanin content was analyzed. Method Using Inertsil ODS-SP （4.6 mm×250 mm， 5 μm） Chromatographic column separation， column temperature 40 ℃， flow rate 1.0 mL/min， sample injection amount 20 μL. The mobile phase was 0.01% formic acid water acetonitrile gradient elution with a detection wavelength of 268 nm. Results Pseudomonas aeruginosa had a detection limit of 0.10 μg and a quantitative limit of 0.20 μg under optimized conditions. The method's precision （RSD） was less than 0.80% in the addition range of 0.22-0.66 μg/mL and 1.10-3.30 μg/mL， and the target compound was linearly good in the linear range of 0.20-10.00 μg/mL. Preliminary tests using this method show that low quantities of levofloxacin promote Pseudomonas aeruginosa's secretion of pyocyanin， which may be connected to the bacterium's drug resistance mechanism. Conclusion The method is simple， accurate， with good precision and recovery， and can be used for the detection of pyocyanin. It has a certain guiding significance for further research on the relationship between the drug resistance mechanism of Pseudomonas aeruginosa and the secretion of pyocyanin.

Key words： Pseudomonas aeruginosa;" "Pyocyanin;" "HPLC;" "levofloxacin;" "expression analysis

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）在自然界中廣泛存在，條件致病菌，現(xiàn)已成為醫(yī)院內感染的主要致病菌之一，可引起全身各部位感染，除顯示出抗生素多重耐藥外，還可能引起高發(fā)病率與死亡率[1-2]，很多文獻報道了PA的分布及耐藥機制[3-7]。通常在PA生長進入固定期時可產生綠膿菌素，該化合物屬于吩嗪類[8]，為PA主要代謝產物之一，見圖1。

綠膿菌素具有氧化還原活性，使PA培養(yǎng)物具有藍綠色特征，是銅綠假單胞菌的毒力因子和群體感應信號分子[9-10]。它可以調節(jié)氧化還原循環(huán)，能夠產生引起氧化應激的活性氧，從而影響鈣穩(wěn)態(tài)[11-12]。它可以抑制細胞呼吸，消耗細胞內環(huán)磷酸腺苷和三磷酸腺苷（ATP），從而影響由ATP驅動的構象變化控制的氯離子通道[13-14]。近年來研究證實綠膿菌素相關生理作用，如作為信號化合物調節(jié)銅綠假單胞菌的基因表達[15-16]，是一系列群體感應調節(jié)子上基因的生理誘導物，能作為銅綠假單胞菌喹諾酮信號（PQS）的下游信號介導刺激，從而促進生物被膜的形成[17-18]；同時研究還發(fā)現(xiàn)綠膿菌素對其他細菌和真菌表現(xiàn)出廣譜抗菌活性[19-20]。

目前對綠膿菌素定性定量檢測分析大多都采用培養(yǎng)基測定，該方法靈敏度較低，且測定過程需要消耗較長的時間和大量的勞動力成本[21]。另外，研究人員雖采用高效液相色譜法[22-28]、液質聯(lián)用[29-30]和氣質聯(lián)用[31-32]分離純化檢測綠膿菌素和吩嗪類化合物，但并未對其測定方法進行方法學驗證，測定方法缺乏通用性；同時，由于檢測樣品含有復雜基質容易導致測定結果缺乏準確性，無法對銅綠假單胞菌中綠膿菌素進行精確量化。因此，為發(fā)現(xiàn)PA生長過程中代謝物綠膿菌素表達規(guī)律，本文采用高效液相色譜儀對其進行檢測，開發(fā)出分離效果好、精密度和準確度高的檢測方法，對研究PA感染指標和預防診斷具有重要指導意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器

Altus A10 PDA高效液相色譜儀（美國珀金埃爾默公司）、AS5150A超聲儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）、TGL-16B離心機（上海安亭科學儀器廠）、XS205精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）、ZHWY-100B恒溫恒濕振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.1.2 試劑

綠膿菌素標準品（上海阿拉丁試劑有限公司，含量≥98%）；乙腈（美國Fisher公司，色譜純）、甲酸（天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純）、LB液體培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，生物試劑）；左氧氟沙星注射液（浙江醫(yī)藥，規(guī)格：250 mL：0.5 g）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術有限責任公司，生物試劑）；0.9%氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）；耐藥PA907菌株由成都大學四川抗菌素工業(yè)研究所臨床致病菌庫提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液的準備

取耐藥PA907菌株于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基的瓊脂板上，置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～24 h。從平板上挑取生長狀態(tài)良好的單個菌落于5 mL的肉湯（LB）培養(yǎng)基中，用無菌生理鹽水稀釋成600 nm處光密度（OD）值為1.0的菌液備用。

1.2.2 最低抑菌濃度（MIC）的確定

采用微量肉湯二倍稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）。先將左氧氟沙星以一定量的液體培養(yǎng)基在96孔板內進行連續(xù)稀釋，每管內再加入一定量供試菌菌液，培養(yǎng)后，觀察細菌生長情況，與空白對照比較，以肉眼觀察培養(yǎng)基清亮且未見細菌生長的最低濃度為0.5 μg/mL，判定該濃度為左氧氟沙星對耐藥PA907菌株的最低抑菌濃度。

1.2.3 綠膿菌素的提取

樣品組包括空白對照組，菌對照組和給藥組；在2.5 mL LB培養(yǎng)基中，加入1/2×MIC左氧氟沙星藥液，作為空白對照組（不含菌）；在4.6 mL LB培養(yǎng)基中，加入菌液0.4 mL，作為菌對照組；在2.3 mL LB培養(yǎng)基中，加入1/2×MIC左氧氟沙星藥液和0.4 mL菌液，作為給藥組。每組各重復制備6根試管，37 ℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)，分別在第24、29、31、33、48、56 h于每組中不同試管中各取菌液1 mL。收集1 200 r/min，3 min PA培養(yǎng)物的上清液，菌液用無水生理鹽水洗滌1次。向培養(yǎng)液中加入氯仿（5：3，v/v），劇烈震蕩1 min待靜置分層后，收集下層溶液并揮干，用于后續(xù)分析。

1.2.4 檢測方法

色譜條件：色譜柱采用Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.01%甲酸水（pH 3.0）為流動相A，乙腈為流動相B；按表1進行梯度洗脫，檢測波長為268 nm，柱溫為40 ℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

1.2.5 標準儲備液的配制

取綠膿菌素標準品適量，精密稱定，加入乙腈超聲溶解后，稀釋至濃度為0.1 mg/mL的標準儲備液。

1.2.6 供試品溶液的制備

取上述1.2.3項下綠膿菌素提取樣品，加入0.6" "mL乙腈超聲溶解，以轉速1 200 r/min，離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

1.3 方法學考察

1.3.1 檢測波長的選擇

精密量取適量標準儲備液，用流動相稀釋至濃度為2.5 μg/mL的綠膿菌素標準溶液，進行紫外掃描，結果見圖2。綠膿菌素在268 nm附近具有最大吸收波長，因而試驗選擇268 nm作為檢測波長。

1.3.2 專屬性考察

取空白對照組樣品、綠膿菌素標準品、給藥組樣品，按供試品溶液制備方法照上述色譜條件進行檢測。綠膿菌素保留時間為17.6 min，所用溶劑在待測物保留時間處無干擾，結果見圖3。

1.3.3 線性范圍、定量限及檢出限

取上述標準儲備液適量，配制為六種梯度濃度的標準溶液，分別為0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10 μg/mL，以峰面積Y為縱坐標，質量濃度c（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得出線性回歸方程。其回歸系數(shù)為0.9998，線性關系良好，以3倍基線噪音計算方法的檢出限為0.1 μg/mL，以10倍基線噪音計算方法的定量限為0.2 μg/mL。

將數(shù)據(jù)擬合，得線性回歸方程為y=66798x-13371，R2=0.9998，表明在0.2～10 μg/mL濃度范圍內，峰面積與質量濃度具有良好的擬合度，所有測得數(shù)據(jù)代入回歸方程進行濃度計算。

1.3.4 精密度及回收率考察

試驗采用空白樣品中添加標準溶液的方法，對綠膿菌素樣品進行加標回收試驗。分別添加6個溶液濃度水平（0.22 μg/mL、0.44 μg/mL、0.66 μg/mL、1.10 μg/mL、2.20 μg/mL及3.30 μg/mL）的標樣溶液，按照以上設定的試驗方法進行3次重復試驗，通過試驗結果計算出加標回收率和相對標準偏差（RSD）值。如表2所示，6種濃度樣品的平均回收率為94.85%～113.67%，RSD為0.69%～1.51%，結果顯示該方法準確度良好，符合相關標準要求。另取1份上述濃度為0.22 μg/mL的樣品溶液，重復進樣六次計算儀器精密度，其 RSD 值為0.61%，其RSD 值為0.61%，表明精密度良好。

1.3.5 重復性考察

取培養(yǎng)31 h菌對照組溶液6份，照 1.2.2項中方法平行測定綠膿菌素峰面積，代入回歸方程計算得到各對照溶液中綠膿菌素濃度，結果為2.03 μg/mL 、2.01 μg/mL 、2.04 μg/mL 、2.05 μg/mL 、2.04 μg/mL 和2.01 μg/mL ，RSD值為0.89%，表明方法的重復性良好。

1.3.6 穩(wěn)定性考察

取培養(yǎng)31 h菌對照組溶液，在0、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h進樣，測定綠膿菌素的峰面積，代入回歸方程計算得到樣品溶液中綠膿菌素的濃度，結果為2.07 μg/mL 、2.09 μg/mL 、2.11 μg/mL 、2.05 μg/mL 、2.12 μg/mL和1.99 μg/mL，RSD為2.21%，表明樣品在72 h內穩(wěn)定性良好。

1.3.7 PA代謝物綠膿菌素測定

耐藥PA907菌株在不同培養(yǎng)時間下代謝出綠膿菌素濃度變化結果見表3，圖4。菌對照組與亞抑菌濃度1/2×MIC左氧氟沙星給藥組在56 h內綠膿菌素濃度變化趨勢相似，在31 h綠膿菌素代謝濃度最高。但與菌對照組比較，給藥組中31 h后綠膿菌素濃度緩慢下降，在33 h和48 h時綠膿菌素代謝濃度高于菌對照組，這說明綠膿菌素是PA907菌株產生耐藥性的原因。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

本實驗采用四因素三水平正交設計，試驗計劃表如表4，通過對表4中各因素的極差大小進行比較，可以得出各因素的影響大小為：B（柱溫）＞A（樣品盤溫度）＞D（流速）＞C（pH值）；由k值大小可以得出最優(yōu)色譜條件為A2B3C1D2，即柱溫為40 ℃，流速1.0 mL/min，流動相A的pH值為3.0，樣品盤溫度為15 ℃，因此確定色譜條件為1.2.4項下為最終色譜條件。

2.2 亞抑菌濃度左氧氟沙星對耐藥PA菌株的影響

綠膿菌素作為耐藥PA菌重要的代謝產物，同時也是重要的毒力因子，其氧化還原性能破壞宿主細胞平衡，影響生物大分子功能從而導致細胞死亡。從上述研究結果看出，耐藥PA菌株在亞抑菌濃度左氧氟沙星給藥31 h后，綠膿菌素代謝濃度出現(xiàn)緩慢下降趨勢，這說明綠膿菌素使細菌對抗生素產生了一定抵抗作用，提示可能是綠膿菌素作為群體感應調節(jié)子上的基因生理誘導物，促使耐藥PA菌生物被膜的形成，從而綠膿菌素代謝濃度出現(xiàn)緩慢下降。同時，綠膿菌素也可抑制細菌鞭毛的運動，使其活動頻率減少，從而抑制其對耐藥PA菌的消除，使得宿主長期感染[33]。

3 結論

本研究采用高效液相色譜法建立一種高靈敏度、高可靠性的綠膿菌素定量方法，并對耐藥PA菌生長過程中產生的綠膿菌素進行檢測。通過本實驗方法研究發(fā)現(xiàn)，耐藥PA菌在對照組與加入亞抑菌濃度左氧氟沙星給藥組比較，耐藥PA菌分泌出的毒力因子綠膿菌素濃度變化曲線在31 h內均呈增長趨勢并達到峰值，31 h后給藥組綠膿菌素代謝濃度下降趨勢較對照組緩慢，這表明耐藥PA菌在左氧氟沙星亞抑菌濃度下能通過綠膿菌素緩慢釋放使得感染時間延長。因此，深入研究綠膿菌素生理功能，對分析PA產生耐藥性的原因，預防PA感染具有重要意義。

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