摘要：目的 建立注射用米卡芬凈鈉中雜蛋白的檢測(cè)方法。方法 采用雙抗體夾心ELISA法分別檢測(cè)注射用米卡芬凈鈉中α-乳清蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白的含量，并對(duì)上述兩種檢測(cè)方法的線性、定量限和檢測(cè)限、專屬性和加標(biāo)回收率等進(jìn)行方法學(xué)研究。結(jié)果 采用α-乳清蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)制劑中的α-乳清蛋白含量，因制劑中活性成分米卡芬凈鈉對(duì)檢測(cè)有干擾，加標(biāo)回收率最高僅為11.8%，導(dǎo)致均未檢出。采用AgraQuant? β-乳球蛋白試劑盒檢測(cè)制劑中的β-乳球蛋白，方法的線性和專屬性良好，加標(biāo)回收率在90.9%～114.9%，方法可行。結(jié)論 制劑中的β-乳球蛋白建議采用雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，本方法準(zhǔn)確可靠，但制劑中的α-乳清蛋白含量建議通過輔料乳糖中α-乳清蛋白的含量進(jìn)行控制。

關(guān)鍵詞：注射用米卡芬凈鈉；雜蛋白；α-乳清蛋白；β-乳球蛋白；雙抗體夾心ELISA法

中圖分類號(hào)：R978.5" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " "文章編號(hào)：1001-8751（2024）04-0284-05

Study on the Detection Methods of Heteroprotein In Micafungin Sodium for Injection

Jin Yang-qiao， Zhao Yan， Gao hua， Li Ze-nan

（Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co. Ltd.， Hangzhou" 311400）

Abstract： Objective To establish a method for the detection of heteroprotein in micafungin sodium for injection.. Methods The double antibody sandwich ELISA method was utilized to detect the contents of alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin in micafungin sodium for injection， respectively. Methodological analysis was conducted to examine the linearity， quantitation and detection limits， specificity， and standard recovery rate of these two heteroprotein detection techniques. Results The alpha-lactalbumin detection kit was used to detect the content of alpha-lactalbumin. As micafingin sodium in the preparation interferes with the detection of alpha-lactalbumin， the added recovery rate of alpha-lactalbumin is only 11.8%， resulting in the non-detection of alpha-lactalbumin in the preparation. The AgraQuant? β-lactoglobulin kit was used to detect beta-lactoglobulin in the preparation， and the method was good in linearity and exclusivity， and the standard recovery rate was 90.9% to 114.9%， which was feasible. Conclusion Beta-lactoglobulin in the formulation is recommended to be detected by the double antibody sandwich ELISA method， which is accurate and reliable， but the content of alpha-lactalbumin in the formulation is recommended to be controlled by controlling the content of alpha-lactalbumin in the excipient lactose.

Key words： micafungin modium for injection; heteroprotein; alpha-lactalbumin; beta-lactoglobulin; double antibody andwhich elisa method

注射用米卡芬凈鈉是由日本安斯泰來公司研制的新型棘白菌素類抗真菌藥物，用于由曲霉菌和念珠菌引起的系列感染：如真菌血癥、呼吸道真菌病和胃腸道真菌病等。2002年10月8日注射用米卡芬凈鈉首次在日本上市（商品名：Mycamine?），并于2005年3月16日、2008年4月25日分別獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、歐盟EMA批準(zhǔn)上市。2006年原國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)注射用米卡芬凈鈉（商品名：Mycamine?、米開民?）的進(jìn)口藥品許可。目前該藥已在多個(gè)國家和地區(qū)獲準(zhǔn)上市，該藥具有較好的抗真菌作用，且安全性和耐受性良好。

原研進(jìn)口的注射用米卡芬凈鈉（商品名：米開民?，規(guī)格50 mg）說明書中明確列明其主要輔料為乳糖。近年來，有報(bào)道稱一些以乳糖為輔料的注射制劑在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)存在過敏反應(yīng)[1-2]，過敏原明確為乳糖中殘留的乳清蛋白。

乳糖來源于動(dòng)物乳清，因此可能會(huì)殘留有微量乳清蛋白[3]，而乳清蛋白主要中含有α-乳清蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白。針對(duì)注射劑乳糖中雜蛋白含量，Eda等[4]研究表明市售的甲潑尼龍琥珀酸鈉注射劑（40 mg，輝瑞）每瓶含有112.5 ng β-乳球蛋白，并在臨床使用過程中導(dǎo)致了兩例嚴(yán)重的過敏反應(yīng)病例，然而迄今中國藥典和各國藥典均無注射用乳糖檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，也對(duì)雜蛋白限度沒有法定要求。截至2023年6月，也尚無文獻(xiàn)報(bào)道注射用米卡芬凈鈉乳糖中雜蛋白導(dǎo)致過敏反應(yīng)的相關(guān)研究。為了保證用藥安全，需要嚴(yán)格控制注射用米卡芬凈鈉中的α-LA和β-乳球蛋白的含量。因此本文以此為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)比了本實(shí)驗(yàn)自制注射用米卡芬凈鈉和市售原研制劑中雜蛋白含量。因α-LA和β-乳球蛋白限度較低，本文設(shè)計(jì)采用靈敏度較高的α-LA檢測(cè)試劑盒和Agra Quant? β-乳球蛋白試劑盒來分別進(jìn)行α-LA和β-乳球蛋白含量檢測(cè)方法學(xué)研究。

1 材料與儀器

酶標(biāo)儀Spectra Max M5（美國Molecular Devices公司），恒溫箱 MB100-2A（杭州博日科技股份有限公司），純化水（自制）。

注射用米卡芬凈鈉，50 mg（浙江海正藥業(yè)有限公司自制3批，批號(hào)A、B、C），乳糖（浙江海正藥業(yè)有限公司自制1批，批號(hào)D），米卡芬凈鈉標(biāo)準(zhǔn)品（浙江海正藥業(yè)股份有限公司自制，批號(hào)P2001），注射用米卡芬凈鈉（商品名：米開民?、規(guī)格50 mg，批號(hào)028010、028020），α-LA檢測(cè)試劑盒（廠家Cloud-Clone-Corp，批號(hào)：L200702337，L200811649），Agra Quant? β-乳球蛋白試劑盒（Beta-Lactoglobulin" ELISA test kit，廠家Agra Quant Romer Labs，批號(hào)：100004358）。

2 方法和結(jié)果

2.1 檢測(cè)原理

2.1.1 α-LA檢測(cè)試劑盒原理

將α-LA抗體包被于96孔微板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中α-LA與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的α-LA抗體，在將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，再次徹底洗滌后加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化為最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的α-LA濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

2.1.2 Agra Quant? β-乳球蛋白試劑盒原理

Agra Quant? β-乳球蛋白試劑是一種夾心酶聯(lián)免疫吸收劑（ELISA）。抗體能物理性吸附于固相載體表面。將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入到孔中，β-乳球蛋白就會(huì)與抗體結(jié)合。在沖洗步驟之后，酶結(jié)合物與β-乳球蛋白特異性結(jié)合的產(chǎn)物殘留在孔壁，并進(jìn)行培養(yǎng)。在第二次的沖洗之后，加入酶底物，溶液顏色變成藍(lán)色。顏色變化的強(qiáng)烈程度與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中β-乳球蛋白的濃度成一定比例。然后再加入終止液，溶液顏色將從藍(lán)色變成黃色。將酶標(biāo)板放在450 nm和630 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀中讀取光密度，計(jì)算樣品濃度。

2.2 α-LA檢測(cè)方法和結(jié)果

2.2.1 檢測(cè)方法

（1）將100 μL標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液（乳糖1.56～50 ng/mL，其他0.39～25 ng/mL）、空白溶液（標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，濃度為0 pg/mL）和樣品溶液加到相應(yīng)的微孔中，均做2個(gè)復(fù)孔，覆膜密封，在37 ℃下培養(yǎng)1 h。

（2）棄去孔內(nèi)液體，每孔加檢測(cè)溶液A（生物素化的αLA抗體）工作液100 μL（臨用前配制，檢測(cè)稀釋液A稀釋100倍），酶標(biāo)板覆膜，37 ℃溫育1 h。

（3）棄去孔內(nèi)液體，每孔加入350 μL已稀釋后的洗滌液（超純水稀釋30倍）洗滌，浸泡1～2 min，在吸水紙上輕拍酶標(biāo)板來移除孔內(nèi)所有液體。重復(fù)洗板3次。

（4）每孔加檢測(cè)溶液B（HRP標(biāo)記的親和素）工作液100 μL（臨用前配制，檢測(cè)稀釋液B稀釋100倍），酶標(biāo)板覆膜，37 ℃溫育30 min。

（5）棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法步驟等同2.2.1項(xiàng)下（3）。

（6）每孔加TMB底物90 μL，酶標(biāo)板覆膜，37 ℃避光顯色約20 min。

（7）每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，充分混合后，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的OD值。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取一瓶標(biāo)準(zhǔn)品，加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1 mL，蓋好后室溫靜置大約10 min，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，得到濃度為200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1。先用適量標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1稀釋為50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液2后，再準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個(gè)EP管中加入400 μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，依次倍比稀釋成25 ng/mL（標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度），12.5 ng/mL，6.25 ng/mL，3.12 ng/mL，1.56 ng/mL， 0.78 ng/mL，0.39 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照試劑盒的操作方法測(cè)定，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的OD值，以相應(yīng)濃度為X，光密度值為Y，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。線性方程為Y=2.051X2+3.927X+0.430，R2=0.998。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)液在0.39～25 ng/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度值具有良好線性關(guān)系。

2.2.3 定量限和檢測(cè)限

根據(jù)試劑盒說明書，檢測(cè)限為0.35 ng/mL。根據(jù)純化水加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（即α-LA溶液濃度0.39 ng/mL，純化水加溶液中α-LA濃度：0.44 ng/mL，回收率112.8%），確認(rèn)定量限為0.39 ng/mL。

2.2.4 專屬性和回收率

取乳糖、注射用米卡芬凈鈉適量，精密稱定，分別配制乳糖加α-LA溶液，注射用米卡芬凈鈉加α-LA溶液，照2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見表1。

結(jié)果提示，乳糖溶液加標(biāo)回收率均在86.9%～114.5%，但注射用米卡芬凈鈉溶液加標(biāo)回收率0.0%～11.8%，回收率較低。為了調(diào)查干擾檢測(cè)的主要因素，后期采用米卡芬凈鈉標(biāo)準(zhǔn)品和純化水分別配制米卡芬凈鈉標(biāo)準(zhǔn)品加α-LA溶液和純化水加α-LA溶液，照2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果純化水的加標(biāo)回收率在112.8%，但米卡芬凈鈉加標(biāo)溶液均未檢出α-LA，由此說明活性成分米卡芬凈鈉是干擾注射用米卡芬凈鈉中α-LA檢測(cè)的主要因素。此方法專屬性和回收率均不行，方法不適用。

2.3 β-乳球蛋白檢測(cè)方法和結(jié)果

2.3.1 檢測(cè)方法

（1）將100 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液（400 ppb、100 ppb、40 ppb、10 ppb、0 ppb，均為試劑盒自帶）和樣品溶液加到相應(yīng)的微孔中，均作2個(gè)復(fù)孔，室溫（25 ℃）溫育20 min。

（2）棄去孔內(nèi)液體，每孔加入300 μL已稀釋后的（超純水稀釋10倍）洗滌液，浸泡1～2 min，在吸水紙上輕拍酶標(biāo)板來移除孔內(nèi)所有液體。重復(fù)以上步驟4次，共沖洗5次。

（3）每孔加結(jié)合物100 μL，室溫25 ℃溫育20 min。

（4）棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法步驟等同2.3.1項(xiàng)下（2）。

（5）每孔加底物100 μL，避光，室溫25 ℃溫育20 min。

（6）每孔加終止液100 μL，終止反應(yīng)，10 min內(nèi)將酶標(biāo)板放在酶標(biāo)儀中，選擇450 nm和630 nm波長(zhǎng)讀取光密度，記錄每個(gè)孔中的OD值。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照2.3.1檢測(cè)方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)曲校正值（標(biāo)準(zhǔn)品450 nm處OD值減去630 nm處OD值）為縱坐標(biāo)，做四參數(shù)方程。結(jié)果見圖2，線性方程見表2，相關(guān)系數(shù)R2=1.000。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)液在0～400 ppb范圍內(nèi)，濃度與吸光度值具有良好線性關(guān)系。

2.3.3 定量限和檢測(cè)限

按照試劑盒說明書，定量限為10 ppb。

檢測(cè)限：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔。在標(biāo)準(zhǔn)孔中依次加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品（400 ppb、100 ppb、40 ppb、10 ppb、0 ppb ），平行兩孔。樣品孔加樣品提取緩沖液，共10孔。按照2.3.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。結(jié)果：空白溶液10個(gè)復(fù)孔的平均OD值為0.053，CV為16.8%，小于20%，符合要求，故檢測(cè)限為0.094 ppb。

2.3.4 專屬性和回收率

取注射用米卡芬凈鈉適量，精密稱定，配制不同濃度的注射用米卡芬凈鈉加β-乳球蛋白溶液，照2.3.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見表4。

結(jié)果提示，注射用米卡芬凈鈉加標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率均在90.0%～114.9%，說明該方法的專屬性和回收率均良好。

2.3.5 樣品檢測(cè)

取3批自研和2批參比制劑適量，精密稱定，配制成一定濃度的樣品溶液，平行配制兩份，照2.3.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見表5。

結(jié)果提示，浙江海正藥業(yè)自制的3批注射用米卡芬凈鈉均未檢出β-乳球蛋白，參比制劑β-乳球蛋白含量約0.891～0.952 ppm。

3 結(jié)果與討論

3.1 α-LA含量結(jié)果與討論

米卡芬凈鈉干擾注射用米卡芬凈鈉中α-LA含量的檢測(cè)，故α-LA檢測(cè)試劑盒方法不適用于該制劑中α-LA含量的檢測(cè)。但采用此法檢測(cè)輔料乳糖中的α-LA含量方法的專屬性、線性和回收率均較好，故制劑中的α-LA含量建議通過控制輔料乳糖中α-LA的含量來進(jìn)行控制。

3.2 β-乳球蛋白含量結(jié)果與討論

本次實(shí)驗(yàn)自制的3批注射用米卡芬凈鈉均未檢出β-乳球蛋白，參比制劑檢出β-乳球蛋白含量約0.891～0.952 ppm。根據(jù)FDA已批準(zhǔn)的說明書，可知該產(chǎn)品的處方為每瓶含米卡芬凈50 mg（相當(dāng)于米卡芬凈鈉50.86 mg、乳糖200 mg等）。相關(guān)研究表明[4]，112.5 ng/d的β-乳球蛋白攝入量會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，本品的每日最大使用量為6瓶，由此可計(jì)算出β-乳球蛋白在注射用米卡芬凈鈉中的限值約為0.07 ppm。從理論上分析，控制使用量，在靜脈注射后不會(huì)產(chǎn)生由該雜蛋白所產(chǎn)生的過敏反應(yīng)。

3.3 總結(jié)

米卡芬凈鈉等棘白菌素類藥物能抑制細(xì)胞壁葡聚糖生物合成，是治療念珠病菌的首選藥物[5-6]，在國內(nèi)外市場(chǎng)上得到了廣泛的應(yīng)用。注射用米卡芬凈鈉中α-LA和β-乳球蛋白全部來源于乳糖，研究結(jié)果表明采用α-LA試劑盒檢測(cè)輔料乳糖的α-LA的方法具有良好的專屬性、靈敏度和回收率，輔料中嚴(yán)格控制乳糖中α-LA后，那么制劑中再檢測(cè)α-LA的意義不大，況且原料藥米卡芬凈鈉對(duì)檢測(cè)存在干擾；制劑采用Agra Quant? β-乳球蛋白試劑盒檢測(cè)β-乳球蛋白方法具有良好的專屬性、靈敏度和回收率，可直接用于控制制劑中β-乳球蛋白含量。

本研究通過對(duì)比研究，表明本次實(shí)驗(yàn)中注射用米卡芬凈鈉中雜蛋白含量較低，對(duì)那些乳糖有過敏反應(yīng)，需使用注射用米卡芬凈鈉的患者，可作為備選制劑，但具體用藥效果還需后續(xù)臨床數(shù)據(jù)證實(shí)。由于以乳糖為輔料的注射制劑在臨床使用中會(huì)出現(xiàn)過敏反應(yīng)，建議后續(xù)醫(yī)藥研究者可更深入研究注射制劑中乳糖中雜蛋白可能引起過敏反應(yīng)的限量。

參 考 文 獻(xiàn)

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