摘要：目的 探討分別以替加環(huán)素和多黏菌素B為基礎的聯(lián)合藥敏對預防KPC型碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）對替加環(huán)素和多黏菌素B耐藥能力的研究。方法 篩選2018年1月1日—2019年2月28日某院檢驗科臨床分離的KPC型碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌17株，選擇5株，采用體外抗生素聯(lián)合傳代培養(yǎng)方法，以評價替加環(huán)素和多黏菌素B的MIC（最小抑菌濃度）變化情況。結果 聯(lián)合用藥能夠降低菌株的替加環(huán)素或多黏菌素B的MIC，與用藥前相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。聯(lián)合用藥可預防多黏菌素B耐藥，第一周時，替加環(huán)素聯(lián)合利福平均延緩了替加環(huán)素的MIC增長，單獨低劑量使用替加環(huán)素或多黏菌素B，在第一周時有4株菌耐藥。結論 早期聯(lián)合治療可抑制KPC型CRKP的生長，隨著抗生素暴露時間的延長，細菌易耐藥，應加強院感防控和抗生素合理使用，防止細菌進一步耐藥。

關鍵詞：聯(lián)合用藥；碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌；抗菌組合；替加環(huán)素；多黏菌素；最小抑菌濃度

中圖分類號：R978.1" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）04-0248-05

Study on Prevention of CRKP Resistance by Combination Regimen Based on Tigacycline and Polymyxin B

Hou Li-xia，" "Lu Guo-ping

（Department of Laboratory Medicine，F(xiàn)uyang Hospital of Anhui Medical University，F(xiàn)uyang" " Anhui" "236000）

Abstract： Objective To investigate the effect of combined drug sensitivity based on tigacycline and polymyxin B on the prevention of KPC carbapenase-resistance of Klebsiella pneumoniae to tigacycline and polymyxin B. Methods A total of seventeen strains of KPC carbapenemase-resistant Klebsiella pneumoniae were screened after being isolated from a hospital's clinical laboratory between January 1， 2018， and February 28， 2019. In vitro， the antibiotic combined culture method was used to evaluate the minimum inhibitory concentration（MIC） changes of tigecycline and polymyxin B. Results Combined medication could reduce the MIC of tigecycline or polymyxin B， and the difference was statistically significant compared with prior treatment（Plt;0.05）. Polymyxin B resistance can be avoided with combination treatment. In the first week， tigecycline combined with rifampicin all delayed the increase of MIC of tigecycline. 4 strains were resistant to tigecycline or polymyxin B at low doses alone in the first week. Conclusions Early combination therapy can inhibit the growth of" KPC-producing Klebsiella pneumoniae. Bacteria are more resistant to antibiotics with longer exposure times. To stop germs from developing additional medication resistance， hospital infection prevention and control as well as the prudent use of antibiotics should be strengthened.

Key words： combination therapy; carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae; antimicrobial combinations; tigecycline; polymyxin; minimum inhibitory concentration

耐碳青霉烯類腸桿菌（Carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE）在全世界范圍內(nèi)出現(xiàn)和傳播，特別是產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，已經(jīng)對公眾健康構成嚴重威脅[1]。據(jù)2021年中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CHINET）調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率從2005年到2018年，其耐藥率上升幅度高達8倍多[2]，雖然2019年至2021年三年間肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率呈穩(wěn)定下降趨勢，但其檢出率仍高達23%以上[3]。到目前為止，只有少數(shù)藥物如替加環(huán)素，黏菌素和氨基糖苷類藥物對CRE具有良好的體外活性[4-5]?，F(xiàn)階段一些研究者推薦對產(chǎn)碳青霉烯酶（KPC）肺炎克雷伯菌感染的患者采用聯(lián)合治療，如對以磷霉素為基礎的聯(lián)合用藥以及替加環(huán)素聯(lián)合多黏菌素，替加環(huán)素聯(lián)合氨基糖苷類（阿米卡星），多黏菌素聯(lián)合阿米卡星做出突變選擇窗的評價[6]，但對聯(lián)合用藥方案預防耐藥性突變的研究較少。而預防耐藥性是我們現(xiàn)在必須要考慮的公共衛(wèi)生問題，如果產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素和多黏菌素產(chǎn)生耐藥，臨床治療上將無藥可選。因此本實驗分別以替加環(huán)素和多黏菌素B為基礎聯(lián)合阿米卡星、利福平和亞胺培南，預防KPC型碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）對替加環(huán)素和多黏菌素B耐藥能力進行評估，這是當前迫切需要解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌來源

收集2018年1月1日—2019年2月28日安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科臨床分離的非重復CRKP菌株共17株。

1.1.2 實驗儀器

恒溫搖床；酶標儀（Tecan）；梯度聚合酶鏈式反應（PCR）儀（德國Biome Tra）；電泳設備和凝膠成像儀（美國BioRad）。

1.1.3 實驗試劑

Mueller-Hinton Broth瓊脂和藥敏紙片（英國Oxoid），無水氯化鈣和六水氯化鎂（上海生工），多黏菌素硫酸鹽和利福平（Sigma公司），替加環(huán)素（阿拉丁公司），阿米卡星（索萊寶公司），亞胺培南（MSD公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

煮沸法提取菌株DNA，采用普通PCR方法檢測17株菌的blaKPC基因，采用ERIC-PCR（腸桿菌目基因間重復共有序列）方法對菌株進行同源性分析，引物序列、擴增條件及凝膠電泳分析參考相關文獻[7-8]。

1.2.2 菌株原始最低抑菌濃度（MIC）測定

從17株菌中挑選出5株菌（挑取原則為：選取耐藥性廣泛的，除多黏菌素B和替加環(huán)素敏感外，對亞胺培南、利福平和阿米卡星均耐藥的菌株，同源性分析不相同的，以及涵蓋高黏性的菌株），重新分別編號為1、2、3、4、5，采用微量肉湯稀釋法檢測5株菌的替加環(huán)素、多黏菌素B、利福平、阿米卡星和亞胺培南的最低抑菌濃度（MIC），重復試驗三次。

1.2.3 選擇聯(lián)合試驗抗生素濃度

取過夜搖的菌液，并新鮮配制陽離子調(diào)節(jié)M-H肉湯（CAMHB）稀釋，調(diào)菌液濁度至光密度值（OD620）在0.08～0.13之間，然后取50 μL菌液至預先加有抗生素的CAMHB肉湯中，總體積為5 mL，抗生素濃度為分別以多黏菌素B和替加環(huán)素的1/2MIC和1/4MIC聯(lián)合抗生素（阿米卡星、利福平、亞胺培南、多黏菌素B和替加環(huán)素）血清穩(wěn)定濃度和1/2血清穩(wěn)定濃度進行聯(lián)合實驗，37 ℃ 160 r/min過夜搖，18～24 h觀察菌液生長情況，綜合5株菌生長情況選擇傳代培養(yǎng)適合的抗生素濃度，菌液渾濁即為有細菌生長，菌液澄清表示無細菌生長[9]。

1.2.4 體外聯(lián)合用藥傳代培養(yǎng)試驗

采用上步聯(lián)合培養(yǎng)方法，抗生素濃度為上步篩選的菌生長的最高抗生素濃度，菌株編號1、2和5暴露在多黏菌素B為主的抗生素中，菌株編號3和4暴露在替加環(huán)素為主的抗生素中，37 ℃ 160 r/min過夜搖，第二日取過夜搖菌液50 μL至預先加有抗生素的新鮮CAMHB肉湯中，如此傳代培養(yǎng)28 d。在d7、14、21、28時分別調(diào)整替加環(huán)素和多黏菌素B的量為之前的一倍，其中作為輔助抗生素如阿米卡星、利福平、亞胺培南、多黏菌素B和替加環(huán)素的量整個過程中保持不變[9]，并且在d7、14、21、28時分別檢測菌株暴露在替加環(huán)素和多黏菌素B后，其MIC值和拉絲試驗的變化情況，整個過程嚴格無菌操作。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0進行統(tǒng)計學分析，MIC值比較采用配對t檢驗，Plt;0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KPC結果

17株菌中有兩株KPC陰性，即1號和2號菌株陰性，3～17號菌株陽性，所選5株菌的KPC結果均為陽性。

2.2 腸道細菌基因間重復序列（ERIC-PCR）結果

腸道細菌基因間重復序列（ERIC-PCR）結果顯示，菌株編號1、2、4、6、7、11DNA條帶一致，菌株編號3、5、8、10、12、13、14、15、16DNA條帶一致，菌株編號9、17DNA條帶不太一致，結合藥敏結果、KPC及同源性分析結果從來自血液標本中選取6、3、15號菌株，分別重新編號為1、2、5號菌株，從來自痰液標本中選取8、10號菌株，分別重新編號為3、4號菌株，其中2號和3號菌株為高黏性菌株，即菌株拉絲實驗陽性（輕輕挑取單個菌落，若拉絲長度≥5 mm則為拉絲實驗陽性）[10]，結果見圖1。

2.3 5株菌的抗生素原始MIC結果

5株菌的替加環(huán)素、多黏菌素B、利福平、阿米卡星和亞胺培南的原始MIC結果如表1。

2.4 聯(lián)合試驗結果

5株菌聯(lián)合用藥前后相比，多黏菌素B和替加環(huán)素的MIC降低了0～2個稀釋梯度（表2），聯(lián)合用藥前后MIC結果見表2。

表2提示在多黏菌素B的聯(lián)合用藥中，除了2號和5號菌多黏菌素B聯(lián)合阿米卡星無效外，其余聯(lián)合中多黏菌素B的MIC均降低了1個稀釋梯度。4號菌替加環(huán)素聯(lián)合用藥后其MIC值降低了2個稀釋梯度。

2.5 體外傳代培養(yǎng)4周MIC變化情況

5株菌經(jīng)體外聯(lián)合用藥4周，其替加環(huán)素或多黏菌素B的MIC變化情況如圖2，5株菌中第5號菌株，聯(lián)合用藥時，阿米卡星和利福平能夠延緩多黏菌素B的耐藥性。第一周時，替加環(huán)素聯(lián)合利福平均延緩了替加環(huán)素的MIC增長。亞胺培南與替加環(huán)素或多黏菌素B聯(lián)用均不能延緩其MIC的增長。單獨低劑量使用替加環(huán)素或多黏菌素B，在第一周時有4株菌耐藥。

2.6 拉絲實驗結果

2號組菌株孵育后菌落的拉絲實驗結果均為陰性。3號D組菌株d14、21、28時有不黏的菌落出現(xiàn)，1、4和5號菌株的菌落拉絲實驗結果均為陰性。

3 討論

產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的耐藥現(xiàn)象已非常普遍，特別是KPC型碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌。雖然目前臨床治療產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌感染可以選擇替加環(huán)素和多黏菌素B，但這兩種藥也存在一些不足。比如多黏菌素B常引起腎臟和神經(jīng)方面副作用[11]；替加環(huán)素血液和腦脊液濃度較低[12]，故不推薦用于血流感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。而開發(fā)新的治療藥物所需的時間較長，所以用現(xiàn)有藥物維持其治療、預防進一步耐藥顯得尤為重要。隨著研究的不斷發(fā)現(xiàn)，頭孢他啶/阿維巴坦作為一種新藥，對治療CRKP具有較好療效[13]。

實驗結果顯示聯(lián)合用藥能夠有效降低多重耐藥菌的MIC，與李佳慧等[14]結果相似。實驗中單獨使用均為耐藥的阿米卡星、利福平和亞胺培南的菌株，與多黏菌素B或替加環(huán)素聯(lián)合使用均可抑制細菌生長，可能是因為不同抗菌藥物聯(lián)合治療能夠有效降低CRKP的耐藥突變選擇窗和選擇性指數(shù)，增強對碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的殺菌能力[15]。本次實驗所選菌株均為除對替加環(huán)素和多黏菌素B敏感外，對其他藥物耐藥的多重耐藥菌，聯(lián)合用藥初期，均顯示有較好的效果，可見對于多重耐藥的KPC型CRKP依然可以嘗試聯(lián)合用藥治療。實驗中早期利福平對預防多黏菌素B和替加環(huán)素耐藥均有一定的效果，與文獻相比[9]，本次替加環(huán)素、多黏菌素B和輔助抗生素藥量均減小了，因為聯(lián)合用藥初期肺炎克雷伯菌不生長，所以減量了，也反映了聯(lián)合用藥是有效的。但是同類實驗未達到金黃色葡萄球菌治療效果[9]，分析原因可能為革蘭陰性菌與革蘭陽性菌細胞壁有差異，藥物作用機制不同，耐藥機制也不同等。多黏菌素B的作用機制為增加細胞膜的通透性[16]，使外膜膨脹，黏性降低，故2號組和3號D組菌落拉絲實驗轉(zhuǎn)為陰性。

本實驗結果雖然對預防耐藥性突變的發(fā)生不太理想，但也從另一個角度說明，單獨使用低劑量多黏菌素B和替加環(huán)素易產(chǎn)生耐藥，使用一周即可導致細菌耐藥，聯(lián)合治療的周期不應過長，應及時停藥。本次實驗僅限于體外環(huán)境和所測試的抗生素濃度，而且菌株數(shù)偏少，需后期擴大樣本量，繼續(xù)研究，但它提供了一種在多種菌株中多種抗生素分別與替加環(huán)素和多黏菌素B聯(lián)合使用的評估方法。

參 考 文 獻

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