摘 要：通過(guò)半胱氨酸（Cys）氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)探究不同高壓處理（200 MPa/500 MPa、18 ℃、15 min）灘羊（4 ℃冷藏1、3、7 d）肌肉蛋白半胱氨酸的氧化修飾與應(yīng)力松弛特性之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：200 MPa和500 MPa高壓處理的肌肉硬度和彈性顯著高于對(duì)照（NT）組（P＜0.05）；高壓處理組應(yīng)力松弛特性指標(biāo)普遍高于NT組，貯藏期間，500 MPa高壓處理組羰基含量顯著高于200 MPa高壓處理組，而總巰基含量顯著低于200 MPa高壓處理組（P＜0.05）；半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，3 組樣本中共鑒定出388 個(gè)顯著差異氧化位點(diǎn)（significantly differential oxidation sites，SDOS），其中，15 個(gè)SDOS與至少1 個(gè)應(yīng)力松弛特性指標(biāo)呈顯著相關(guān)性（P＜0.05、P＜0.01），這些位點(diǎn)涉及肌聯(lián)蛋白（Cys32705、Cys29171、Cys26405、Cys32358）、伴肌動(dòng)蛋白（Cys5628）、肌球蛋白結(jié)合蛋白H（Cys481）、肌球蛋白重鏈8（Cys403）、膜聯(lián)蛋白（Cys292）、肌球蛋白重鏈11（Cys701）、L-乳酸脫氫酶（Cys315）、糖原磷酸化酶（Cys496）、磷酸葡萄糖變位酶1（Cys407、Cys134）、丙酮酸激酶（Cys510）及鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶（Cys651）。綜上所述，高壓處理可誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白的部分氧化位點(diǎn)發(fā)生氧化修飾，使蛋白變性和聚集，進(jìn)而降低蛋白本身的降解程度，誘導(dǎo)灘羊肉貯藏期間的硬度增加。

關(guān)鍵詞：高壓處理；灘羊肉；應(yīng)力松弛特性；蛋白質(zhì)氧化；半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)

Effect of High-Pressure Treatment on Stress Relaxation Characteristics of Refrigerated Tan Sheep Muscle Investigated by Cysteine Oxidative Modification Proteomics

GAO Yurong1， BU Ningxia2， ZHANG Rui1， WANG Suye1， LIU Dunhua1，*

（1. College of Food Science and Engineering， Ningxia University， Yinchuan 750021， China;

2. College of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： The current study used cysteine oxidative modification proteomics to investigate the correlation between oxidative modification of cysteine （Cys） and stress relaxation characteristics in Tan sheep muscle subjected to high-pressure （HP） treatments at 200 or 500 MPa for 15 min at 18 ℃ and stored for 1， 3 and 7 days at 4 ℃. The results showed that muscle hardness and elasticity were significantly higher following HP treatments compared to the non-treated （NT） group （P lt; 0.05）. Most stress relaxation indexes were higher in the HP-treated groups than in the CN group. During all storage periods， the carbonyl value of the 500 MPa treated group was significantly higher， and the total sulfhydryl content was significantly lower than that of the 200 MPa treated group （P lt; 0.05）. A total of 388 significantly differential oxidation sites were identified， of which 15 were significantly correlated with at least one indicator of stress relaxation （P lt; 0.05）， involving myosin （Cys32705， Cys29171， Cys26405， and Cys32358）， concomitant actin （Cys5628）， myosin binding protein H （Cys481）， myosin heavy chain 8 （Cys403）， membrane-associated protein （Cys292）， myosin heavy chain 11 （Cys701）， L-lactate dehydrogenase （Cys315）， glycogen phosphorylase （Cys496）， phosphoglucose translocase 1 （Cys407 and Cys134）， pyruvate kinase （Cys510）

and calcium transporter ATPase （Cy651）. Therefore， high-pressure treatment induces oxidative modification of some oxidation sites of structural proteins in sheep muscle and consequent protein denaturation and aggregation， in turn reducing the degradation of proteins and inducing a decrease the hardness of Tan sheep meat.

Keywords： high-pressure processing; Tan sheep; stress relaxation characteristics; protein oxidation; cysteine oxidative modification proteomics

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240428-097

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.1 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）06-0009-10

引文格式：

高鈺茸， 卜寧霞， 張瑞， 等. 基于半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究高壓處理對(duì)冷藏灘羊肉應(yīng)力松弛特性的影響[J].

肉類(lèi)研究， 2024， 38（6）： 9-18. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240428-097. " "http：//www.rlyj.net.cn

GAO Yurong， BU Ningxia， ZHANG Rui， et al. Effect of high-pressure treatment on stress relaxation characteristics of refrigerated Tan sheep muscle investigated by cysteine oxidative modification proteomics[J]. Meat Research， 2024， 38（6）： 9-18. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240428-097. " "http：//www.rlyj.net.cn

灘羊作為寧夏地區(qū)的特色畜種之一，其鮮肉及相關(guān)制品（手抓羊肉、鹵羊肉和風(fēng)干羊肉等）廣受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。當(dāng)下灘羊在農(nóng)場(chǎng)屠宰后多經(jīng)冷卻、排酸后直接進(jìn)入市場(chǎng)，肉的嫩度、持水性難以進(jìn)一步改善，且微生物指標(biāo)難以控制。此外，由于內(nèi)源性酶的自溶降解作用，肉的質(zhì)構(gòu)特征在貯藏過(guò)程中會(huì)不可避免地發(fā)生劣變，從而導(dǎo)致品質(zhì)下降[2]。

高壓處理是一種冷處理方式，其最大優(yōu)勢(shì)在于滅活微生物、延長(zhǎng)食品貨架期的同時(shí)可較好地保留食品原有的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味[3]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)高壓處理技術(shù)對(duì)海產(chǎn)品[4-5]、各類(lèi)畜產(chǎn)品包括羊肉[1，6]、牛肉[7]及豬肉[8-9]等肉類(lèi)食品品質(zhì)特性的影響作用進(jìn)行了廣泛研究。適當(dāng)?shù)母邏禾幚碛欣谔岣呷馄返哪鄱?，但過(guò)度高壓處理會(huì)引起僵直后期質(zhì)構(gòu)特性的劣變。高壓處理主要通過(guò)介導(dǎo)肌肉蛋白氧化特性對(duì)肉品質(zhì)產(chǎn)生影響，適度蛋白氧化有利于肉質(zhì)改善，而過(guò)度蛋白氧化會(huì)造成肉質(zhì)劣變[10]。因此，探究高壓處理對(duì)僵直后期肌肉蛋白的氧化效應(yīng)及機(jī)制對(duì)調(diào)控肉品質(zhì)、指導(dǎo)高壓處理工藝非常重要。半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)是闡明蛋白質(zhì)氧化還原調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵技術(shù)。半胱氨酸氧化位點(diǎn)、氧化形式鑒定及高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用有助于闡明蛋白質(zhì)氧化還原機(jī)制及其相關(guān)下游代謝網(wǎng)絡(luò)。如Fu Qingquan等[11]利用氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究了體外氧化對(duì)牛肉肌纖維分離蛋白生化特性的影響。

在肉品的質(zhì)構(gòu)特性中，硬度是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)欲望最關(guān)鍵的指標(biāo)之一。應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)是測(cè)定樣品黏彈特性最重要的評(píng)價(jià)方法之一，可用于高壓處理肉類(lèi)的質(zhì)構(gòu)特性評(píng)價(jià)，具有快速、穩(wěn)定和無(wú)損的特點(diǎn)，該方法所得結(jié)果已被證明與質(zhì)地剖面分析實(shí)驗(yàn)確定的結(jié)構(gòu)蛋白變化和質(zhì)構(gòu)特性具有一致性，可作為監(jiān)測(cè)肌肉品質(zhì)變化的方法[12]。

盡管一些研究報(bào)道了高壓處理對(duì)海鮮和肉類(lèi)產(chǎn)品貯藏期間質(zhì)構(gòu)特性的影響[13]，卻很少有研究通過(guò)應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)羊肉貯藏過(guò)程中的微觀(guān)質(zhì)構(gòu)變化，并從蛋白質(zhì)氧化和半胱氨酸氧化修飾位點(diǎn)角度進(jìn)一步建立加壓肉質(zhì)特性與半胱氨酸氧化修飾位點(diǎn)的相關(guān)性。因此，本研究以僵直后期灘羊背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，借助半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定高壓處理誘導(dǎo)僵直后期肌肉蛋白的半胱氨酸氧化修飾位點(diǎn)概況，尋找決定其貯藏過(guò)程中品質(zhì)特性形成的關(guān)鍵蛋白氧化修飾位點(diǎn)，并通過(guò)鑒定肌肉蛋白氧化修飾強(qiáng)度、修飾位點(diǎn)與肉質(zhì)構(gòu)特性的相關(guān)性，了解高壓處理誘導(dǎo)灘羊肉僵直后期蛋白氧化變化與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長(zhǎng)肌采集于69 只中國(guó)寧夏鹽池縣新海牧場(chǎng)公灘羊（約8 月齡）。

乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylene glycol bis （2-aminoethyl ether） tetraacetic acid，EGTA）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（分析純）

北京博潤(rùn)萊特科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（分析純） 生工生物科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（分析純） 美國(guó)Sigma公司；Tris-HCl、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、乙酸乙酯、鹽酸胍、甘氨酸、尿素、脫氧膽酸鈉、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB）（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白酶抑制劑、N-乙基順丁烯二酰亞胺（N-ethylmaleimide，NEM）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、三（2-羧乙基）膦（tris（2-chloroethyl）phosphate，TCEP）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、3-吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、葉酸（folic acid，F(xiàn)A）（均為分析純）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP-600超高壓處理設(shè)備 包頭科發(fā)有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀（配備Exponent 5.1.2.0軟件） 英國(guó)Stable Micro Systems公司；Q-Exactive HF-X質(zhì)譜儀、Reprosil-Pur C18色譜柱（75 μm×150 mm，3 μm）

美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；GL-10C低溫離心機(jī)

上海安亭科學(xué)儀器有限公司；722N紫外分光光度計(jì)

上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

在屠宰3 h內(nèi)從左半胴體上取背最長(zhǎng)肌，在保鮮膜包裹下用冰袋于2 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。剔除多余結(jié)締組織及可見(jiàn)脂肪后，將處于僵直后期的背最長(zhǎng)肌分割、修剪為大小、質(zhì)量基本一致的長(zhǎng)方體肉塊（長(zhǎng)×寬×高約為2.0 cm×5.5 cm×6.5 cm），總共189 塊，并將其隨機(jī)分為3 組（n＝63），從每組中隨機(jī)抽取3 塊肉，真空包裝。

參考本課題前期研究結(jié)果[14]，以150 MPa、15 min為樣品硬度顯著劣化的臨界壓力條件，450 MPa、15 min為質(zhì)構(gòu)特性不再隨壓力呈明顯遞增效應(yīng)的邊界條件，基于此，最終選定200 MPa、15 min及500 MPa、15 min為本研究的壓力閾值。參照Marcos等[15]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。以5 MPa/s的上升速率達(dá)到預(yù)設(shè)壓力200 MPa和500 MPa，維持15 min，釋放壓力時(shí)間為10 s，傳壓介質(zhì)為蒸餾水，壓力溫度設(shè)置為18 ℃。以未高壓處理的空白組（NT）為對(duì)照。所有樣品在（4±1）℃下保存，在相應(yīng)貯藏期（1、3 d）取樣，后在－80 ℃超低溫冰箱保存。在貯藏7 d時(shí)，將剩余樣品從4 ℃冰箱取出，分為2 份，一份迅速裝入凍存管并放置在－80 ℃超低溫冰箱貯存，用于半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析，另一份用于應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)和蛋白氧化測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 應(yīng)力松弛實(shí)驗(yàn)

參照Peleg[16]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，使用質(zhì)構(gòu)分析儀以垂直于肌纖維方向從不同背最長(zhǎng)肌樣品中切出厚度為（20±1）mm的切片，用36 mm鋁圓筒探針以1 mm/s的十字頭速率壓縮30%。將肉塊樣品壓縮面垂直于肌纖維方向放置，保持壓縮60 s，使應(yīng)力達(dá)到平衡。每種處理?xiàng)l件（NT、200 MPa、500 MPa）下分析5 個(gè)肉塊樣品。采用Maxwell模型的修正版本進(jìn)行力-時(shí)間關(guān)系擬合，

如式（1）所示：

（1）

式中：δ（t）表示給定時(shí)間的應(yīng)力/N；Ci表示應(yīng)力松弛常數(shù)/N；δ0表示平衡應(yīng)力/N；τi表示麥克斯韋元素的

松弛時(shí)間/s；i表示第i個(gè)松弛過(guò)程；n表示模型中松弛過(guò)程的總數(shù)。

δ0值越高，硬度與彈性越低；Ci值越高，彈性越低；

τi值越高，硬度與彈性越高。

1.3.3 肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）定量測(cè)定

參考Peng Zeyu等[17]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。每個(gè)樣品中加入適量含4 g/100 mL SDS的1×PBS（pH 7.4）及100×蛋白酶抑制劑的PBS，冰浴超聲破碎2 min，1 000×g離心15 min，取上清液。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。

1.3.4 羰基含量測(cè)定

參照Shah等[18]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。取1 mL MP溶液（4 mg/mL）于20 mL試管中，加入1 mL 10 mmol/L

的DNPH溶液（溶解于2 mol/L HCl），室溫下反應(yīng)1 h，期間每隔20 min渦旋振蕩1 次，再加入1 mL 20 g/100 mL TCA溶液，混勻，4 ℃、10 000×g離心5 min，棄去上清液，沉淀中加入1 mL乙酸乙酯和乙醇的混合液（1∶1，V/V）進(jìn)行清洗，重復(fù)清洗3 次直至完全脫色，之后加入3 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液，在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，使沉淀全部溶解，反應(yīng)液中的部分雜質(zhì)或輕微不溶解物質(zhì)通過(guò)10 000 r/min離心5 min去除，測(cè)定所得上清液在370 nm波長(zhǎng)處的吸光度。羰基含量

按式（2）計(jì)算：

（2）

式中：A表示370 nm波長(zhǎng)處吸光度；n表示稀釋倍數(shù)；ε表示摩爾吸光系數(shù)（22 000 L/（mol·cm））；ρ表示MP溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 總巰基含量測(cè)定

參考Peng Zeyu等[17]的方法并略作修改。取1 mL 1 mg/mL

MP溶液，加入8 mL反應(yīng)緩沖溶液（含86 mmol/L

Tris、90 mmol/L甘氨酸、8 mol/L尿素和4 mmol/L EDTA，pH 8.0），然后將上述混合物在10 000×g離心15 min，取上清液4.5 mL，加入500 μL 10 mmol/mL的DTNB-Tris-Gly緩沖液（pH 8.0），25 ℃攪拌1 h，然后以12 000×g離心10 min，測(cè)定上清液在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度，總巰基含量按式（2）計(jì)算，式中ε為

13 600 L/（mol·cm）。

1.3.6 消化和標(biāo)記

參照Liang Longhui等[19]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)由上海拜譜生物蛋白組學(xué)公司進(jìn)行。MP溶液加入NEM，60 ℃封閉半胱氨酸30 min，采用TCA-丙酮沉淀法去除NEM后，將蛋白沉淀復(fù)溶于含4 g/100 mL SDS的PBS（pH 7.4）中，加入TCEP，50 ℃下還原氧化位點(diǎn)1 h，再采用TCA-丙酮沉淀法去除TCEP。

取樣品復(fù)溶，25 ℃下孵育3 h，經(jīng)過(guò)5 kDa超濾管濃縮蛋白，沉淀過(guò)夜，清洗干燥，冰浴超聲后，再次復(fù)溶，加入碳酸氫銨和胰蛋白酶過(guò)夜酶解，酶解后的肽段使用C18 Cartridge脫鹽，真空凍干得到肽段。

1.3.7 氧化肽段富集

參照Tao Yingmei等[20]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。各取1 mg肽段，加入適量上樣/洗脫緩沖液（含0.1 g/100 mL SDS、0.5 g/100 mL脫氧膽酸鈉和150 mol/L

NaCl）充分溶解，分別加入100 μL高濃度鏈霉親和素Beads，室溫混勻3 h；用1 mL上樣/洗脫緩沖液清洗Beads 1 次，PBS清洗Beads 4 次；100 μL洗脫緩沖液（50 mol/L

NH4CO3，pH 8.2）、100 μL 5 mol/L TCEP溶液洗脫肽段；重復(fù)洗脫1 次，合并洗脫液，加入IAA，使其終濃度為20 mol/L，室溫避光反應(yīng)1 h；干燥后脫鹽，真空濃縮，加入10 μL 0.1 g/100 mL FA溶液溶解，用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析。

1.3.8 LC-MS/MS分析

參考Parvin等[21]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，取各組樣品的適量肽段進(jìn)行LC-MS/MS分析，通過(guò)Easy nLC 1200色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，緩沖液A和B分別為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液和含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈溶液。95%的緩沖液A用于色譜柱平衡，待肽段樣品進(jìn)樣到補(bǔ)集柱后，在色譜分析柱中以300 nL/min流速進(jìn)行梯度分離。待肽段分離完成后，在質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)依賴(lài)性采集模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin Pro2018軟件對(duì)應(yīng)力松弛曲線(xiàn)進(jìn)行Levemberg-Marquardt回歸分析擬合，對(duì)蛋白差異氧化位點(diǎn)氧化強(qiáng)度與應(yīng)力松弛特性指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析；蛋白氧化組學(xué)采用的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索軟件為MaxQuant 1.6.17.0，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為UniProt_Ovis_aries （Sheep）-28115-20200506.fasta；利用基因本體論（gene ontology，GO）（http：//geneontology.org/）對(duì)差異氧化蛋白進(jìn)行功能注釋?zhuān)镁┒蓟蚺c基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genome.jp/kegg/）對(duì)差異氧化蛋白生物學(xué)路徑進(jìn)行分析；Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)用于評(píng)估數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性，對(duì)于不同組的質(zhì)量參數(shù)，采用SPSS 25.0軟件對(duì)平均值進(jìn)行單因素方差分析。所有樣品均采用3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓處理對(duì)灘羊肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

應(yīng)力松弛特性可表征灘羊肌肉的質(zhì)構(gòu)特性，擬合結(jié)果中，最大相對(duì)差（maximum relative difference，MRD）＜5%和決定系數(shù)（R2）＞0.99表明模型的擬合能力較好，可用于后續(xù)分析。Ci作為Maxwell模型的衰變力，代表彈性分量，可以作為原料彈性的度量參數(shù)。如表1所示，貯藏7 d后，NT組的Ci（C1、C2和C3）顯著低于貯藏1 d（P＜0.05），500 MPa處理組Ci沒(méi)有顯著變化（P＞0.05），而200 MPa高壓處理組Ci較貯藏1 d顯著上升（P＜0.05）。貯藏7 d后，200、500 MPa處理組的Ci均顯著高于NT組（P＜0.05），而2 個(gè)高壓處理組Ci差異不顯著（P＞0.05）。τi表示麥克斯韋元素的松弛時(shí)間，也可以用來(lái)衡量肌肉的硬度和彈性[22]，除τ3以外，τ1和τ2未受到高壓處理和冷藏的顯著影響（P＞0.05）。結(jié)果表明，僵直后的灘羊肉在冷藏7 d后會(huì)出現(xiàn)彈性降低、質(zhì)地劣化、軟化的問(wèn)題，而200、500 MPa高壓處理的羊肉在冷藏后仍保持較高的硬度和彈性，這可能是因?yàn)楦邏禾幚砟軌蛘T導(dǎo)MP變性和聚集，從而增加肌肉硬度[23]。Campus等[24]

利用δ0的三元Maxwell模型評(píng)估高壓處理后鯛魚(yú)肌肉的應(yīng)力松弛特性變化，其結(jié)果與本研究一致。

綜上，200、500 MPa高壓處理的灘羊肉冷藏7 d后，其Ci和τi普遍高于NT組樣品，表明高壓處理可提高灘羊肉貯藏過(guò)程中的彈性和硬度。

2.2 高壓處理對(duì)灘羊肉MP氧化的影響

如圖1A所示，各處理組的羰基含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。500 MPa高壓處理樣品的羰基含量顯著高于其他處理樣品（P＜0.05）。羰基含量的增加代表蛋白氧化程度增加、氧化穩(wěn)定性減弱，提示樣品中MP的交聯(lián)和斷裂[25]。高壓處理誘導(dǎo)的蛋白氧化增強(qiáng)與自由基的潛在形成有關(guān)[26]。MP在高壓處理下變性，肌肉系統(tǒng)Fe2＋釋放量增加，繼而促進(jìn)賴(lài)氨酸、精氨酸、脯氨酸和蘇氨酸殘基側(cè)鏈中特定位置的金屬催化氧化，形成羰基衍生物[27]。這與Wang Yang等[28]研究結(jié)果一致。

如圖1B所示，各貯藏期樣品總巰基含量均隨處理壓強(qiáng)增加而降低。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，除NT組之外，高壓處理樣品在貯藏7 d后的總巰基含量均顯著低于貯藏1 d（P＜0.05）。蛋白質(zhì)巰基含量的降低與巰基對(duì)高壓處理的敏感性有關(guān)，MP在高壓作用下發(fā)生變性，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，內(nèi)部巰基暴露，并氧化形成二硫鍵，使MP中的總巰基含量減少[29]。這與Shang Xiaolan等[30]研究結(jié)果一致。表明在貯藏7 d后，高壓處理增加了肌肉的氧化程度。

2.3 半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析

上述結(jié)果表明，貯藏7 d時(shí)高壓處理組的應(yīng)力松弛特性及氧化程度與NT組差異顯著（P＜0.05），故對(duì)貯藏7 d樣本進(jìn)行半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析。由表2可知，從3 組處理樣品中共鑒定到蛋白742 個(gè)、肽段3 007 個(gè)、氧化修飾蛋白602 個(gè)、氧化修飾肽段2 235 個(gè)及氧化修飾位點(diǎn)總數(shù)1 537 個(gè)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)篩選樣本組內(nèi)非空值數(shù)據(jù)，以上調(diào)倍數(shù)大于1.5或下調(diào)倍數(shù)小于0.7、P＜0.05為條件篩選顯著差異氧化位點(diǎn)（significantly differential oxidation sites，SDOS）。如圖2所示，200 MPa vs. NT組共篩選到169 個(gè)SDOS，其中上調(diào)131 個(gè)，下調(diào)38 個(gè)；500 MPa vs. NT組共篩選到266 個(gè)SDOS，其中上調(diào)205 個(gè)，下調(diào)61 個(gè)；500 MPa vs. NT組中的SDOS數(shù)量遠(yuǎn)高于200 MPa vs. NT組，表明500 MPa高壓處理樣本貯藏7 d后蛋白氧化程度高于200 MPa高壓處理樣本。

如圖3所示，為了更好地可視化分析高壓處理與對(duì)照組之間蛋白質(zhì)豐度的差異，對(duì)氧化位點(diǎn)進(jìn)行層次聚類(lèi)分析，圖中不同顏色代表SDOS在樣品中的豐度，紅色代表高豐度和高氧化水平，藍(lán)色代表低豐度和低氧化水平，3 個(gè)不同處理組顏色分布差異明顯，表明高壓處理組與NT組蛋白位點(diǎn)氧化程度存在差異。從3 個(gè)處理組中共鑒定到388 個(gè)重疊SDOS，這些SDOS對(duì)應(yīng)的蛋白有望成為高壓處理灘羊肉冷藏期間品質(zhì)調(diào)控的潛在生物標(biāo)記蛋白。

2.4 SDOS的生物信息學(xué)分析

根據(jù)基因或基因產(chǎn)物，GO將388 個(gè)重疊SDOS所對(duì)應(yīng)蛋白的功能特性鑒定為生物過(guò)程、分子功能及細(xì)胞成分。如圖4A所示，蛋白質(zhì)主要參與產(chǎn)生前體代謝物途徑、氧化還原酶活性、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、小分子結(jié)合、細(xì)胞質(zhì)部分及細(xì)胞外區(qū)域部分。

肌肉細(xì)胞內(nèi)不同通路互相協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為。以KEGG通路為單位，以所有定性蛋白質(zhì)為背景，通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算各個(gè)通路蛋白質(zhì)富集度的顯著性水平，從而確定受到顯著影響的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。由圖4B可知，388 個(gè)SDOS共映射到102 條生物學(xué)通路，其中39 條通路顯著富集（P＜0.05），包括碳代謝、氨基酸生物合成、糖酵解/糖醛酸生成、丙酮酸代謝、氧化磷酸化、檸檬酸循環(huán)及半胱氨酸和蛋氨酸代謝。

2.5 SDOS與灘羊肉應(yīng)力松弛特性的相關(guān)性分析

將388 個(gè)重疊SODS對(duì)應(yīng)蛋白中的未標(biāo)記蛋白及蛋白片段剔除后，共計(jì)篩選到360 個(gè)重疊SODS，將其氧化豐度與應(yīng)力松弛特性指標(biāo)（δ0、C1、C2、C3、τ1、τ2、τ3）

進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，獲得4 個(gè)重疊SODS與C2、τ3呈顯著及極顯著正相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），1 個(gè)重疊SODS與τ2呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），11 個(gè)重疊SODS與δ0、C1、C3呈顯著或極顯著正負(fù)相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），其SODS對(duì)應(yīng)的蛋白包含6 種結(jié)構(gòu)蛋白、5 種代謝酶類(lèi)和1 種其他蛋白。

2.5.1 結(jié)構(gòu)蛋白SODS與應(yīng)力松弛特性的相關(guān)性分析

本研究在高壓處理樣本中鑒定到大量肌聯(lián)蛋白（titin，TTN）氧化位點(diǎn)，該蛋白氧化位點(diǎn)與品質(zhì)指標(biāo)呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)與特定殘基氧化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)代謝和收縮特性有關(guān)[20]。如表3所示，TTN在Cys29171殘基的氧化與樣本C3值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而TTN在Cys32358殘基的氧化與樣本C1和C3值呈顯著及極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），TTN在Cys32705、Cys26405殘基的氧化與樣本τ3值呈顯著及極顯著正相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01），表明盡管TTN在貯藏過(guò)程中發(fā)生了氧化降解，但不同位點(diǎn)處的氧化修飾程度與肉品質(zhì)特性的關(guān)聯(lián)性存在差異。Huff-Lonergan等[31]通過(guò)雙向電泳研究宰后成熟時(shí)間、動(dòng)物年齡和性別對(duì)TTN的影響，發(fā)現(xiàn)TTN降解產(chǎn)生的一些新條帶與肌肉硬度的變化直接相關(guān)。在生理?xiàng)l件下，伴肌動(dòng)蛋白（nebulin，NEB）與影響肌肉收縮的肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白相互作用密切相關(guān)[32]，

該蛋白在Cys5628殘基的氧化與樣本δ0值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。MP中，TTN和NEB是維持肌纖維結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白，分別位于肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白附近，它們的降解會(huì)破壞粗絲和細(xì)絲的完整性及Z線(xiàn)、M線(xiàn)和肌絲之間的連接，進(jìn)而影響宰后肉的硬度與彈性[33]。

此外，相關(guān)研究報(bào)道顯示，膜聯(lián)蛋白（annexins，ANXA11）和TNN可用于養(yǎng)殖鮭魚(yú)的質(zhì)構(gòu)預(yù)測(cè)[34]，這與本研究結(jié)果一致。ANXA11在Cys292殘基的氧化與樣本C1和C3值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

MYBPH是骨骼肌粗絲的組成部分，對(duì)肌球蛋白有很強(qiáng)的親和力[17]，通過(guò)C端結(jié)構(gòu)域與肌原纖維粗絲A帶中的肌球蛋白相關(guān)聯(lián)[35]。據(jù)報(bào)道，在雞和兔骨骼肌中，MYBPH主要與快速收縮肌纖維有關(guān)[36]。本研究中，MYBPH在Cys481殘基的氧化與樣本C1和C2值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），張瑞等[37]研究發(fā)現(xiàn)，不同貯藏溫度（－2、－18、4 ℃）灘羊肉MYBPH在Cys451殘基的氧化與肌肉硬度呈顯著正相關(guān)性（P＜0.05），與本研究結(jié)果一致。

肌球蛋白是骨骼肌纖維的主要成分，在骨骼肌纖維的收縮特性中發(fā)揮著重要作用。肌球蛋白分子由6 條鏈組成，包括2 條重鏈和4 條輕鏈，肌球蛋白輕鏈和MYH的完整性是肌肉功能的必要條件[36]。本研究中，MYH8在Cys403殘基的氧化與樣本C1和C3值呈顯著及極顯著正相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01）。Tao Yingmei等[20]研究也發(fā)現(xiàn)，MYH8在Cys403殘基的氧化與不同溫度貯藏灘羊肉剪切力和咀嚼性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與本研究結(jié)果一致。

2.5.2 代謝酶SODS與應(yīng)力松弛特性的相關(guān)性分析

如表4所示，磷酸葡萄糖變位酶1（phosphoglucomutase 1，PGM1）在Cys407殘基的氧化與樣本δ0值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而PGM1在Cys134殘基的氧化與樣本τ2值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。這可能是因?yàn)镻GM1活性增加可促進(jìn)葡萄糖-1-磷酸向葡萄糖-6-磷酸的轉(zhuǎn)化，糖酵解速率加快，從而影響肌肉嫩度[38]。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PKM）在Cys510殘基的氧化也與樣本δ0值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），L-乳酸脫氫酶（L-lactate dehydrogenase，LDHA）在Cys315殘基的氧化與樣本τ3值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Kim等[39]研究表明，豬胸腰最長(zhǎng)肌不同區(qū)域的LDHA與剪切力（P＜0.05）、滴水損失（P＜0.01）和蒸煮損失（P＜0.01）呈極顯著正相關(guān)。糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，PYGM）在Cys496殘基的氧化與樣本δ0值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這可能與PYGM在該位點(diǎn)氧化修飾介導(dǎo)的酶活變化有關(guān)。Chen Lijuan等[40]報(bào)道，PYGM的高磷酸化水平會(huì)導(dǎo)致酶活性降低，繼而延遲結(jié)構(gòu)蛋白的水解并影響肌肉硬度，而B(niǎo)ai Yuqiang等[41]報(bào)道，體外4 ℃孵育期間，羊肉PYGM磷酸化會(huì)促進(jìn)其活性。由此可見(jiàn)，PYGM對(duì)一些特殊的酶學(xué)修飾尤為敏感，其酶活特性也易受此影響，從而影響肌肉硬度。

2.5.3 其他蛋白SODS與應(yīng)力松弛特性的相關(guān)性分析

鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶（calcium-transporting ATPase，ATP2A2）水解ATP并產(chǎn)生肌肉收縮力，對(duì)穩(wěn)定肌球蛋白的結(jié)構(gòu)、完整性和功能起重要作用[42]。如表5所示，ATP2A2在Cys651殘基的氧化與樣本δ0值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這可能與高壓處理誘導(dǎo)位于肌球蛋白頭部催化中心的活性巰基氧化有關(guān)。肌球蛋白構(gòu)象的變化，如基于巰基氧化形成二硫交聯(lián)，可導(dǎo)致ATP2A2活性降低[42]。

3 討 論

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，高壓處理顯著改善了灘羊肉的質(zhì)構(gòu)特性。Ma Hanjun等[43]研究表明，隨著高壓處理水平從200 MPa提高到400 MPa，高壓處理僵直后期牛肉硬度顯著高于未處理牛肉（P＜0.05）。Shao Ying等[44]研究表明，高壓處理（200～500 MPa/5 min）小龍蝦肌肉硬度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。Melody等[45]認(rèn)為，宰后肌肉的糖酵解速率與肌肉蛋白氧化穩(wěn)定性是影響宰后肉品質(zhì)形成的2 個(gè)關(guān)鍵因素。Huang Caiyan等[46]認(rèn)為，高壓介導(dǎo)的蛋白氧化在糖酵解酶結(jié)構(gòu)、功能、信號(hào)傳導(dǎo)及活性調(diào)節(jié)中起調(diào)控作用。同時(shí)，高壓處理誘導(dǎo)MP關(guān)鍵組分顯著氧化，使蛋白的結(jié)構(gòu)破壞，造成肌肉硬度增加，質(zhì)構(gòu)特性劣變。因此，高壓處理誘導(dǎo)的蛋白半胱氨酸氧化修飾可能一方面通過(guò)誘導(dǎo)僵直后期灘羊背最長(zhǎng)肌骨架蛋白、糖酵解酶及抗應(yīng)激蛋白氧化，使肌肉結(jié)構(gòu)蛋白變性，繼而誘導(dǎo)貯藏期肌肉硬度增加，另一方面降低了內(nèi)源性蛋白酶系活力，阻礙宰后成熟水解進(jìn)程，間接劣化肉品質(zhì)。

4 結(jié) 論

研究高壓處理對(duì)灘羊肉貯藏期品質(zhì)及MP氧化的影響，利用半胱氨酸氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)鑒定其半胱氨酸氧化修飾位點(diǎn)，并進(jìn)一步與應(yīng)力松弛特性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：確定了15 個(gè)（10 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白、4 個(gè)代謝酶和1 個(gè)其他蛋白）SODS對(duì)應(yīng)的蛋白與至少1 個(gè)應(yīng)力松弛特性指標(biāo)顯著相關(guān)（P＜0.05、P＜0.01）；其中NEB、TTN是介導(dǎo)高壓處理質(zhì)構(gòu)特性變化的關(guān)鍵骨架蛋白，PGM1、LDHA是介導(dǎo)高壓處理樣本質(zhì)構(gòu)特性變化的關(guān)鍵糖酵解酶；高壓處理誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白的部分氧化位點(diǎn)發(fā)生氧化修飾，使蛋白變性和聚集，進(jìn)而降低蛋白本身的降解程度，肌肉硬度與彈性隨著降解程度的變化而變化，從而使硬度與彈性增加。本研究結(jié)果可為高壓處理誘導(dǎo)灘羊肉僵直后期蛋白氧化變化與機(jī)制研究提供理論支持，為高壓處理在肉類(lèi)中的實(shí)際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

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收稿日期：2024-04-28

基金項(xiàng)目：寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021AAC03013；2022AAC02021）；

寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展與生態(tài)保護(hù)科技創(chuàng)新示范項(xiàng)目（NGSB-2021-6-05）

第一作者簡(jiǎn)介：高鈺茸（2000—）（ORCID： 0009-0009-3754-593X），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與健康。

E-mail： 2968598057@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：劉敦華（1964—）（ORCID： 0000-0001-5872-2661），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工及食品營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量控制。E-mail： ldh320@nxu.edu.cn