摘 要：采用高壓-超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白，對(duì)比遺傳算法-反向傳播（genetic algorithm-back propagation，GA-BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和響應(yīng)面模型的優(yōu)化效果，確定最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明：GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在模型擬合和預(yù)測(cè)方面表現(xiàn)優(yōu)于響應(yīng)面模型；最佳提取參數(shù)為高壓時(shí)間23 min、超聲時(shí)間22 min、酶添加量3.2%、酶解時(shí)間222 min，羊皮膠原蛋白提取率達(dá)到（80.5±1.6）%，較傳統(tǒng)的木瓜蛋白酶法提高40%；紫外-可見吸收光譜和傅里葉變換紅外光譜結(jié)果顯示，此條件下提取的羊皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)完整，高壓-超聲-酶解法對(duì)膠原蛋白的破壞較小。

關(guān)鍵詞：羊皮；羊皮膠原蛋白；高壓-超聲-酶解法；遺傳算法-反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；響應(yīng)面法

Optimization of High-Pressure Ultrasound-Assisted Enzymatic Extraction of Collagen from Sheep Skin Using Genetic Algorithm-Back Propagation Neural Network

ZHU Ming1，2， ZHANG Dequan2， LI Shaobo2， CHEN Li2， HOU Chengli2， CHENG Chengpeng2， YU Jiangying2， GUAN Wenqiang1，*

（1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， School of Biotechnology and Food Science， Tianjin University of Commerce，

Tianjin 300134; 2. Key Laboratory of Agricultural Product Quality， Safety， Storage， Transportation and Control， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Agricultural Product Processing， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193）

Abstract： This study compared the effectiveness of genetic algorithm-back propagation neural network （GA-BPNN） and response surface methodology （RSM） in optimizing the high-pressure ultrasound-assisted enzymatic extraction of collagen from sheep skin to determine the optimal process parameters. The results showed that GA-BPNN had superior performance in model fitting and prediction compared to RSM. The optimal extraction parameters were as follows： high pressure holding time of 23 min， ultrasound time of 22 min， enzyme dosage of 3.2%， and hydrolysis time of 222 min. Under these conditions， the extraction rate of collagen from sheep skin was （80.5 ± 1.6）%， which is 40% higher than that of the traditional papain method. The results of ultraviolet-visible （UV-Vis） spectroscopy and Fourier transform infrared （FTIR） spectroscopy demonstrated that the structure of the extract collagen was complete.

Keywords： sheep skin; sheep skin collagen; high-pressure ultrasound-assisted enzymatic extraction; genetic algorithm-back propagation neural network; response surface methodology

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240510-111

中圖分類號(hào)：TS251.92 " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2024）06-0042-09

引文格式：

朱明， 張德權(quán)， 李少博， 等. 基于遺傳算法-反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化高壓-超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白工藝[J]. 肉類研究，

2024， 38（6）： 42-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240510-111. " "http：//www.rlyj.net.cn

ZHU Ming， ZHANG Dequan， LI Shaobo， et al. Optimization of high-pressure ultrasound-assisted enzymatic extraction of collagen from sheep skin using genetic algorithm-back propagation neural network[J]. Meat Research， 2024， 38（6）： 42-50.

（in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240510-111. " "http：//www.rlyj.net.cn

我國(guó)作為全球最大的羊肉生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，2023年羊肉產(chǎn)量達(dá)到531萬(wàn) t，比2013年增加30.12%，高于同期世界羊肉平均增長(zhǎng)水平。伴隨著羊肉產(chǎn)量的增加，羊皮等加工副產(chǎn)物也隨之增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約產(chǎn)出3億 張羊皮，但羊皮加工率不足10%，造成極大的資源浪費(fèi)[1]。羊皮主要成分為水、蛋白質(zhì)、少量脂肪和礦物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量超過30%，且以膠原蛋白為主[2]。膠原蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及良好的親水性、生物相容性和生物降解性等，還具有保護(hù)細(xì)胞、促進(jìn)傷口愈合、抑制血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶活性等功效[3]，可作為肉凍、糖果的增稠劑、改善冰淇淋口感的發(fā)泡劑，也可加工成可降解薄膜材料等[4]，在食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，膠原蛋白提取方法主要包括酸法、堿法、熱水法和酶法等[5]。傳統(tǒng)的酸、堿法提取方式存在破壞膠原蛋白結(jié)構(gòu)、影響其生物活性和功能性，提取過程中產(chǎn)生的廢液污染環(huán)境等問題；酶解法因具有良好的反應(yīng)選擇性、對(duì)膠原蛋白破壞較小、提取產(chǎn)品純度高而被廣泛采用。單一酶解法存在提取率低、提取時(shí)間長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)，常與化學(xué)方法相結(jié)合，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)提取方法的不足[6-7]。高壓可通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)促進(jìn)膠原蛋白展開，從而提高提取率。已有較多高壓提取蛋白方法的報(bào)道，如高壓提取鯰魚肌原纖維蛋白、高壓輔助超聲提取紅巨藻藻紅蛋白等[8]。超聲波通過在液體中產(chǎn)生強(qiáng)烈的湍流，從而增強(qiáng)傳質(zhì)，提高化學(xué)反應(yīng)速率，進(jìn)而提高提取率，縮短提取時(shí)間[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，堿可能會(huì)削弱膠原中的氫鍵并破壞部分共價(jià)鍵，因此在堿處理過程中，超聲輔助會(huì)破壞膠原結(jié)構(gòu)[9]。傳統(tǒng)酶法獲得的膠原蛋白產(chǎn)量較低，但木瓜蛋白酶可以裂解端肽區(qū)域的肽，可在一定程度上提高膠原蛋白產(chǎn)量[5]。超聲輔助酶法可有效提高膠原蛋白產(chǎn)量和純度，縮短提取時(shí)間。在超聲輔助胃蛋白酶提取牛肌腱膠原時(shí)，與僅使用酶法相比，超聲輔助提取效率和所得膠原質(zhì)量均有所提高[9]。

反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是應(yīng)用最廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型之一，但其運(yùn)行具有一定的隨機(jī)性，每次運(yùn)行結(jié)果存在差異。遺傳算法（genetic algorithm，GA）是一種模擬生物進(jìn)化過程的優(yōu)化算法，通過模擬自然選擇、交叉和變異過程搜索最優(yōu)解[10-11]。為進(jìn)一步提升BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)性能，采用GA對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)權(quán)重和偏置進(jìn)行優(yōu)化，使BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最終預(yù)測(cè)值的均方誤差（mean square error，MSE）最小化，從而獲得最優(yōu)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型。GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和響應(yīng)面法均可用于優(yōu)化生產(chǎn)工藝。綜上，本研究擬采用高壓-

超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白，以高壓（121 ℃、100 kPa）時(shí)間、超聲（4 ℃、140 W）時(shí)間、酶添加量、酶解時(shí)間為因素，以膠原蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比分析GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和響應(yīng)面模型在羊皮膠原蛋白提取工藝優(yōu)化中的效果，確定羊皮膠原蛋白的最佳提取參數(shù)，以期為羊皮膠原蛋白的提取和開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊皮源于云南省云上黑山羊，采集后置于－80 ℃冷凍柜保存?zhèn)溆谩?/p>

木瓜蛋白酶（300 000 U/g）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量檢測(cè)試劑盒、MD1444-5m 透析袋（截留分子質(zhì)量14 000 Da） 北京索萊寶科技有限公司；乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HV-501高壓蒸汽滅菌器 日本Hirayama公司；Powersonic 520超聲波清洗機(jī) 韓國(guó)HST公司；LGJ-12A真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)起航科技有限公司；EMS-19磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；UV-1700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；FT/IR-4100分光光度計(jì) 日本Jasco公司；Spectra Max 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；PL2002電子天平

梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Sorvall Lynx 6000超速離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；FCR1000-UF-E超純水機(jī) 青島富勒姆科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊皮膠原蛋白制備

1.3.1.1 羊皮預(yù)處理

去除羊皮樣品表面毛發(fā)和皮下脂肪，將其剪成1 cm×1 cm小塊，35 ℃蒸餾水清洗2 次，5 倍體積脫脂溶液（40 ℃溫水和1 mol/L碳酸鈉（2∶1，V/V））浸泡10 min，再次用蒸餾水清洗，重復(fù)此步驟2 次，即可得脫脂羊皮樣品，真空冷凍干燥。稱取10 g干燥后的羊皮樣品，在4 ℃、體積分?jǐn)?shù)1.5%鹽酸中浸泡5 h，料液比1∶5（g/mL）[11-12]。

1.3.1.2 高壓-超聲-酶解法和傳統(tǒng)酶解法提取羊皮膠原蛋白

高壓-超聲-酶解法（聯(lián)合處理組）提取羊皮膠原蛋白：參考王艷茹[8]、Sun Man[9]等的方法并修改，采用1 mol/L氫氧化鈉溶液將1.3.1.1節(jié)酸提液pH值調(diào)節(jié)至6，高壓（121 ℃、100 kPa）處理，冷卻后進(jìn)行超聲處理（4 ℃、140 W）。然后按照酶解溫度51 ℃、pH 6.0、木瓜蛋白酶添加量4%、酶解時(shí)間240 min進(jìn)行酶解[13-14]。將上清液轉(zhuǎn)移至透析袋（14 000 Da），將透析袋放入10 倍體積蒸餾水中，持續(xù)攪拌透析48 h，每4 h換1 次水，最后進(jìn)行冷凍干燥，從而得到羊皮膠原蛋白[15]。

傳統(tǒng)酶解法（對(duì)照組）提取羊皮膠原蛋白：采用1 mol/L氫氧化鈉溶液將1.3.1.1節(jié)酸提液pH值調(diào)節(jié)至6，

木瓜蛋白酶添加量4%、酶解溫度51 ℃、酶解時(shí)間240 min[11-12]。其余過程同上。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在超聲時(shí)間30 min、酶添加量4%、酶解時(shí)間240 min條件下，考察高壓時(shí)間（15、20、25、30、35 min）對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響；在高壓時(shí)間20 min、酶添加量4%、酶解時(shí)間240 min條件下，考察超聲時(shí)間（15、20、25、30、35 min）對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響；在高壓時(shí)間20 min、超聲時(shí)間30 min、酶解時(shí)間240 min條件下，考察酶添加量（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響；在高壓時(shí)間20 min、超聲時(shí)間30 min、酶添加量4%條件下，考察酶解時(shí)間（150、180、210、240、270 min）對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)4因素3水平的組合試驗(yàn)，以提取率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平如表1所示。

1.3.4 羊皮膠原蛋白提取率測(cè)定

稱取約0.2 g羊皮膠原蛋白凍干樣品于玻璃管，將組織盡量剪碎以便消化，蓋子稍松不密閉。加入2 mL 6 mol/L鹽酸溶液，煮沸2～6 h，消化至沒有大的可見團(tuán)塊，冷卻后用10 mol/L NaOH溶液（約1 mL）調(diào)節(jié)pH值至6～8，蒸餾水定容至4 mL，25 ℃、10 000×g離心20 min。首先，上清液加入0.1 mL氧化劑溶液（7 g/100 mL氯胺T和乙酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液的混合物，1∶4（V/V），pH 6），充分混合[16-17]；然后加入1.3 mL Ehrlich試劑溶液（2 g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于3 mL 60%（V/V）高氯酸溶液，按照體積比3∶13與異丙醇混合）；最后將混合物于60 ℃水浴加熱20 min，不斷攪拌，然后在自來水中冷卻2～3 min。酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為560 nm，以HYP質(zhì)量濃度（0.2～30.0 μg/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為

y＝0.018 5x＋0.001 6，以羊皮、凍干樣品吸光度計(jì)算其HYP含量，單位為μg/g，由HYP含量計(jì)算膠原蛋白含量[18]。

羊皮膠原蛋白提取率按照下式計(jì)算：

式中：m1為提取的膠原蛋白質(zhì)量/g；m0為羊皮中膠原蛋白質(zhì)量/g。

1.3.5 紫外-可見光譜測(cè)定

將羊皮膠原蛋白凍干樣品溶解于0.3 mol/L乙酸溶液，配制成2 mg/mL膠原蛋白溶液，置于1 cm比色皿中，在200～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行掃描[19]。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

將羊皮膠原蛋白凍干樣品與干燥的溴化鉀以1∶100（m/m）混合，研磨并壓成顆粒，將樣品置于樣品室，紅外光譜掃描范圍400～4 000 cm－1，分辨率1 cm－1?；邗０稩帶峰（1 600～1 700 cm－1）的積分面積，使用二階導(dǎo)數(shù)和反卷積計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[20]。

1.3.7 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析

GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)合了GA和BP算法，GA用于優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，BP算法用于對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練[21]。

基于Matlab R2018b軟件，將響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，建立包含輸入層、隱含層和輸出層的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。利用GA確定最佳隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)，以提高模型的預(yù)測(cè)性能[22-23]。以相關(guān)系數(shù)（R2）、平均絕對(duì)誤差（mean absolute error，MAE）、MSE、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、平均絕對(duì)百分比誤差（mean absolute percentage error，MAPE）為模型性能評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇合適的模型進(jìn)行提取工藝條件優(yōu)化[24-25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

提取率測(cè)定設(shè)置3 次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示為±s。采用Excel 2022、IBM SPSS 20、GraphPad Prism 10.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、單因素方差分析、Duncan多重檢驗(yàn)和圖形繪制，采用Design Expert 8.0軟件對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析。使用Matlab R2018b軟件訓(xùn)練優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 高壓時(shí)間對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1A可知，隨高壓時(shí)間延長(zhǎng)，羊皮膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，高壓處理20 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值（64.4%）。這可能是因?yàn)槎虝r(shí)間高壓處理可有效破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)膠原蛋白提取，而長(zhǎng)時(shí)間高壓處理則可能導(dǎo)致膠原蛋白結(jié)構(gòu)凝聚，從而抑制后續(xù)的酶解反應(yīng)，降低膠原蛋白提取率。有研究表明，超高壓處理對(duì)牛蛙皮膠原蛋白特性有顯著影響，低壓水平下膠原蛋白分子的熱穩(wěn)定性增加，但高壓水平下的結(jié)果相反[15，17]。因此，選擇高壓時(shí)間15～25 min進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1B可知，隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)，羊皮膠原蛋白提取率迅速增加，在20 min時(shí)達(dá)到最大值（67.5%），隨后提取率開始下降。研究表明，適當(dāng)?shù)某曁幚砜梢蕴岣叩鞍踪|(zhì)提取率，但過長(zhǎng)的超聲時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白提取率降低，這可能是由于超聲空化作用增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面活性位點(diǎn)暴露或破壞，從而阻礙了進(jìn)一步的酶水解反應(yīng)[16，26]。此外，超聲波的機(jī)械作用和熱效應(yīng)會(huì)引起膠原蛋白變性和降解，從而導(dǎo)致膠原蛋白提取率進(jìn)一步下降[27]。因此，選擇超聲時(shí)間15～25 min進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 酶添加量對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1C可知，酶添加量從2.0%增加到3.0%時(shí)，膠原蛋白提取率顯著提高（P＜0.05），在酶添加量3.0%時(shí)，提取率達(dá)到最大值（70.38%）。這可能是因?yàn)槊柑砑恿康陀?.0%時(shí)，隨著木瓜蛋白酶的增加，底物與酶之間充分結(jié)合，提高了膠原蛋白提取率[28]；當(dāng)酶添加量超過3.0%時(shí)，膠原蛋白與酶的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，因此隨著酶添加量的進(jìn)一步增加，膠原蛋白提取率不再增加?？紤]到成本問題，選擇酶添加量2.5%～3.5%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1D可知，酶解時(shí)間從150 min延長(zhǎng)到240 min時(shí)，膠原蛋白提取率顯著提高（P＜0.05），在酶解時(shí)間240 min時(shí)，提取率達(dá)到最大（73.31%）。當(dāng)酶解時(shí)間小于240 min時(shí)，底物與酶充分結(jié)合，酶促反應(yīng)充分，提取率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而提高；酶解時(shí)間240～270 min時(shí)，膠原蛋白與酶結(jié)合趨于飽和，提取率隨酶解時(shí)間緩慢下降，而且，酶解時(shí)間過長(zhǎng)，膠原蛋白結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，生成小分子多肽。因此，綜合考慮時(shí)間成本和膠原蛋白提取率，選擇酶解時(shí)間210～270 min進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，各組試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。使用Design Export 8.0分析得到提取條件和膠原蛋白提取率的回歸方程：Y＝74.56－3.34A－0.87B＋1.39C－3.33D＋0.99AB＋1.32AC＋3.10AD＋4.22BC－0.01BD－2.61CD－8.91A2－13.42B2－11.03C2－9.51D2。

由表3可知，模型P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項(xiàng)P＝0.436 5＞0.05，表明該模型顯著[29]。

R2＝0.971 5，表明膠原蛋白提取率受高壓時(shí)間、超聲時(shí)間、酶添加量和酶解時(shí)間的影響，R2接近1，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值較為吻合。變異系數(shù)為3.98，遠(yuǎn)小于10，說明模型離散度低，可信度高。校正決定系數(shù)R2Adj＝0.934 2，表明二次回歸模型適當(dāng)，能夠準(zhǔn)確描述不同參數(shù)對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的影響[30]。

根據(jù)表3中的F值可知，高壓時(shí)間（A）、超聲時(shí)間（B）、酶添加量（C）、酶解時(shí)間（D）對(duì)羊皮膠原蛋白提取率影響顯著（P＜0.05），特別是高壓時(shí)間（A）和酶解時(shí)間（D）對(duì)提取率影響高度顯著（P＜0.000 1），4 個(gè)因素對(duì)提取率的影響程度順序?yàn)楦邏簳r(shí)間＞酶解時(shí)間＞酶添加量＞超聲時(shí)間。二次交互項(xiàng)AD、BC、CD的P＜0.05，說明高壓時(shí)間和酶解時(shí)間、超聲時(shí)間和酶添加量、酶添加量和酶解時(shí)間之間的交互作用對(duì)提取率影響顯著。

圖2為各因素之間的交互作用對(duì)提取率影響的三維響應(yīng)面圖，通過Design export 8.0分析，確定較佳工藝參數(shù)為高壓時(shí)間23.18 min、超聲時(shí)間20.05 min、酶添加量3.06%、酶解時(shí)間237.42 min。在此條件下，羊皮膠原蛋白提取率預(yù)測(cè)值為79.61%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)測(cè)值為（74.19±1.20）%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為7.3%。

2.3 GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化結(jié)果分析

利用Matlab R2018b軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，以高壓時(shí)間、超聲時(shí)間、酶添加量和酶解時(shí)間作為輸入神經(jīng)元，通過算法確定隱藏神經(jīng)元數(shù)，提取率作為輸出神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練和測(cè)試[31]。隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)代表神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化次數(shù)，將隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)代入神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行訓(xùn)練[32]，訓(xùn)練后的MSE如圖3所示，當(dāng)隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)為7時(shí)，訓(xùn)練集MSE最小，為0.049 1，因此，選擇隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)為7。

隨機(jī)選取Box-Behnken設(shè)計(jì)29 組數(shù)據(jù)中的80%用于訓(xùn)練，其余數(shù)據(jù)用于驗(yàn)證[33]。在訓(xùn)練過程中，將模型的學(xué)習(xí)率設(shè)置為1 000，經(jīng)過不斷迭代訓(xùn)練減小誤差，由圖4可知，當(dāng)?shù)螖?shù)為6時(shí)，總體的MSE最小，為0.033 1，此時(shí)的模型滿足訓(xùn)練誤差要求。

由圖5可知，經(jīng)過GA優(yōu)化后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型回歸圖的擬合程度提高，R2從0.889 5提高至0.998 2，根據(jù)Matlab R2018b分析可知，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性由88.79%提高至98.84%。

由圖6可知，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在訓(xùn)練、驗(yàn)證、測(cè)試和全部數(shù)據(jù)集上的R2分別為0.972 7、0.950 6、0.909 5和0.953 3，接近1，說明所構(gòu)建的GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有良好的擬合能力。因此，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。

為提高GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型性能和收斂速率，經(jīng)過多次迭代分析最優(yōu)和平均權(quán)重參數(shù)，得到最大適應(yīng)度值。通過對(duì)高壓時(shí)間、超聲時(shí)間、酶添加量和酶解時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，得到提取率的最高值和最低值[34]。如圖7所示，經(jīng)過59 次迭代，在第13次迭代模型獲得最大適應(yīng)度值，確定較佳工藝參數(shù)為高壓時(shí)間23.4 min、超聲時(shí)間22.3 min、酶添加量3.21%、酶解時(shí)間222.02 min，此條件下，提取率預(yù)測(cè)值為81.69%。

2.4 響應(yīng)面模型和GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)比分析

由圖8可知，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的R2較高，而MAE、MSE、RMSE和MAPE均低于響應(yīng)面模型，即GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)羊皮膠原蛋白提取率的預(yù)測(cè)能力更強(qiáng)，預(yù)測(cè)誤差更小。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，響應(yīng)面和GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取率與實(shí)際值之間的相對(duì)誤差分別為5.25%和1.21%，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型具有較高的準(zhǔn)確性。因此，選擇GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型作為最佳模型，最優(yōu)提取條件為高壓時(shí)間23.4 min、超聲時(shí)間22.3 min、酶添加量3.21%、酶解時(shí)間222.02 min，在此條件下，羊皮膠原蛋白提取率為（80.5±1.6）%。

2.5 羊皮膠原蛋白紫外可見光譜分析

根據(jù)紫外掃描光譜圖，不僅能判斷所提取膠原蛋白中是否含有酪氨酸等生色團(tuán)，還能判斷多肽鏈中非螺旋端肽的完整性[35]。如圖9所示，2 種提取方式下的膠原蛋白都表現(xiàn)出鐘形光譜，在240 nm處顯示出主要的吸收峰，與Tan Yuqing等[36]所研究的豬皮膠原蛋白（235 nm）、海參膠原蛋白（236.5 nm）、鱘魚皮膠原蛋白（235 nm）的最大吸收峰相近，符合I型膠原蛋白的最大紫外吸收特征。2 種提取方式下的膠原蛋白在280 nm處均無吸收峰。Zinchenko等[37]的研究表明，酪氨酸和苯丙氨酸是敏感的發(fā)色團(tuán)，能夠吸收280 nm處的紫外線，當(dāng)膠原蛋白被提取和純化時(shí)，該特性用于表征非螺旋端肽和其他蛋白質(zhì)污染物的完整性。以上結(jié)果顯示，最優(yōu)工藝條件下，高壓和超聲處理未破壞膠原蛋白的完整性，聯(lián)合處理組和對(duì)照組提取的膠原蛋白均符合I型膠原蛋白的紫外吸收特征。

2.5 羊皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

由圖10可知，對(duì)照組和聯(lián)合處理組的酰胺A帶分別為3 307 cm－1和3 240 cm－1，高壓和超聲處理可能通過削弱氫鍵影響膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)[19]，與對(duì)照組相比，聯(lián)合處理組酰胺A帶出現(xiàn)紅移，這與氫鍵延伸振動(dòng)有關(guān)。當(dāng)氫鍵在NH和官能團(tuán)之間形成時(shí)，峰向低波數(shù)移動(dòng)。這一發(fā)現(xiàn)與Nan Jie等[15]報(bào)道的高壓處理后酰胺A帶位置變化的結(jié)果一致。酰胺B帶與—CH2的不對(duì)稱拉伸振動(dòng)有關(guān)，對(duì)照組和聯(lián)合處理組的膠原蛋白吸收峰分別為2 955 cm－1和2 923 cm－1，這表明高壓處理導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)減少[18]。酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）主要與參與羰基拉伸振動(dòng)的氫鍵強(qiáng)度有關(guān)[18]，結(jié)果表明，對(duì)照組在1 620 cm－1處觀察到峰帶，聯(lián)合處理組在1 639 cm－1處觀察到峰帶，即聯(lián)合處理幾乎沒有改變酰胺I帶波峰的位置。酰胺II帶（1 550～1 600 cm－1）與N—H彎曲和C—N振動(dòng)有關(guān)，酰胺III帶（1 210～1 230 cm－1）

與膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)，峰值強(qiáng)度比（酰胺III帶與1 450 cm－1附近吸收峰強(qiáng)度之比）為1.05～1.14，則膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)完整[35]。對(duì)照組與聯(lián)合處理組在1 210 cm－1與1 230 cm－1附近的峰值強(qiáng)度比分別為1.06和1.10，接近I型膠原蛋白的特征值1.0。由此可見，2 種方法提取的膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三螺旋結(jié)構(gòu)基本保持完整，與傳統(tǒng)的提取方法相比，復(fù)合法對(duì)膠原蛋白的破壞較小。

3 結(jié) 論

本研究采用高壓-超聲-酶解法提取羊皮膠原蛋白，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，獲取GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所需的訓(xùn)練、測(cè)試和驗(yàn)證數(shù)據(jù)。結(jié)果表明：GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型比響應(yīng)面模型具有更好的擬合和預(yù)測(cè)能力，最佳提取工藝條件為高壓時(shí)間23 min、超聲時(shí)間22 min、酶添加量3.2%、酶解時(shí)間222 min，在此條件下羊皮膠原蛋白提取率為（80.5±1.6）%，與模型預(yù)測(cè)值相近；通過紫外-可見吸收光譜和傅里葉變換紅外光譜確定了此條件下提取的羊皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)的完整性。相較于傳統(tǒng)的酶解提取法，高壓-超聲-酶解法將提取時(shí)間從傳統(tǒng)的5 d縮短至3 d，提取率從40%提升至80%[4，11]。而且，與傳統(tǒng)的提取方法相比，聯(lián)合法無需大量化學(xué)試劑，從根源上降低了污染物殘留風(fēng)險(xiǎn)。另外，GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型可有效應(yīng)用于羊皮膠原蛋白高壓-超聲-酶解提取工藝研究，為活性物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化提供技術(shù)支持。本研究結(jié)果可為羊皮資源的高值化利用提供參考。

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收稿日期：2024-05-10

基金項(xiàng)目：云南省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（202102AE090039）

第一作者簡(jiǎn)介：朱明（1999—）（ORCID： 0009-0002-5114-4867），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楦碑a(chǎn)物多元開發(fā)利用。

E-mail： zm147qwe@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：關(guān)文強(qiáng)（1974—）（ORCID： 0000-0001-8663-5725），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

E-mail： gwq18@163.com