摘要 目的： 探討醒腦開(kāi)竅針刺法治療結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練改善缺血性卒中急性期大鼠神經(jīng)損傷的效應(yīng)及與Toll樣受體（TLRs）通路相關(guān)的機(jī)制。 方法： 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）組，術(shù)后根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分將符合條件的MCAO大鼠再分為模型組和治療組。治療組于造模后24 h給予針刺治療及康復(fù)訓(xùn)練，連續(xù)14 d。采用Zausinger評(píng)分評(píng)價(jià)動(dòng)物的神經(jīng)功能，行為學(xué)測(cè)試評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能，氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法檢測(cè)腦梗死體積，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)梗死邊緣區(qū)內(nèi)TLR4/胞內(nèi)髓樣分化蛋白88（MyD88）/ 核因子κB（NF-κB）通路mRNA和蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)同區(qū)域內(nèi)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。 結(jié)果： 治療組24 h的神經(jīng)功能評(píng)分最低，其后逐漸升高，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.01）；從第3天開(kāi)始，治療組神經(jīng)功能評(píng)分與同期模 型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，造模后24 h，治療組轉(zhuǎn)棒成績(jī)和模型組無(wú)明顯差異，而與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）；其后各時(shí)間點(diǎn)，治療組成績(jī)逐漸提高，從造模后3 d開(kāi)始，與同期模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。模型組腦梗死體積大于假手術(shù)組（ P ＜0.01）；治療組腦梗死體積低于模型組（ P ＜0.01）。模型組TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平以及IL-1β、TNFα水平較假手術(shù)組升高（ P ＜0.05）；治療組mRNA、蛋白表達(dá)及炎性因子水平降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。 結(jié)論： 針刺治療結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練能夠能下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB通路活性及相關(guān)炎性因子水平，進(jìn)而改善神經(jīng)元存活微環(huán)境，減輕神經(jīng)缺血損傷。

關(guān)鍵詞 "缺血性卒中；醒腦開(kāi)竅針刺法；康復(fù)訓(xùn)練；炎癥；Toll樣受體；核因子-κB

doi： "10.12102/j.issn.1672-1349.2023.14.013

Effect of Acupuncture Combined with Rehabilitation Training on Nerve Injury in Rats with Acute Ischemic Stroke and its Mechanism Related to TLR4 Pathway

QUAN Hongjuan， HE Xuli， XIA Mingwan， HE Yong

First People′s Hospital of Chenzhou， Chenzhou 423000， Hunan， China， E-mail： 752551351@qq.cm

Abstract Objective： To explore the effect of Xingnao Kaiqiao acupuncture combined with rehabilitation training on improving nerve injury in rats with acute ischemic stroke and the mechanism related to Toll like receptor（TLR4） pathway. "Methods： ：The rats were randomly divided into sham operation group and middle cerebral artery occlusion（MCAO） group.After operation，the eligible MCAO rats were divided into model group and treatment group according to neurological function scores.The rats in treatment group were given acupuncture treatment and rehabilitation training 24 hours after modeling for 14 consecutive days.The Zausinger score was used to evaluate neurological function.The behavioral test was used to evaluate the motor function.The triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining was used to detect the cerebral infarct volume.Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） and Western Blot methods were used to detect TLR4/myeloid differentiation protein 88（MyD88）/nuclear factor kappa-B（NF-κB） pathway mRNA and protein expression in the marginal area of infarction.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） method was used to detecte interleukin-1β（IL-1β） and tumor necrosis factor-α（TNF-α） levels in the same area. ""Results： The neurological function score of the treatment group was the lowest at 24 hours，and then gradually increased.The difference within the group was significant（ P ＜0.01）; from day 3，the neurological function score of the treatment group was significantly different "the model group in the same period（ P ＜0.05 ）.The behavioral test results showed that 24 hours after modeling，the performance of the treatment group was not significantly different compared with that of the model group，but was significantly different from the sham operation group;thereafter，at each time point，the performance of the treatment group gradually improved，from 3 days after modeling，compared with the model group during the same period，the difference was significant（ P ＜0.05 ）.The volume of cerebral infarction in the model group was significantly larger than that in the sham operation group，and the difference between the groups was significant（ P ＜0.01）; the volume of cerebral infarction，in the treatment group was smaller than that in the model group（ P ＜0.01）.The expression levels of TLR4，MyD88，NF-κB mRNA and protein in the model group，as well as the levels of IL-1β and TNF-α were higher "than those in the sham operation group（ P ＜ 0.05 ）.The levels of the above-mentioned mRNA，protein and inflammatory factors in the treatment group was lower than those in the model group（ P ＜0.05）. "Conclusion： Acupuncture combined with rehabilitation training can down-regulate the activity of TLR4/MyD88/NF-κB pathway and the level of related inflammatory factors，thereby improving the microenvironment of neuron survival and reducing nerve ischemia injury.

Keywords "ischemic stroke;Xingnao Kaiqiao acupuncture method; rehabilitation training; inflammation; Toll like receptor; nuclear factor kappa-B

腦缺血誘發(fā)的中樞免疫炎癥反應(yīng)是腦卒中重要的病理特征之一。Toll樣受體（Toll like receptor，TLRs）是一類(lèi)參與免疫炎癥反應(yīng)的模式識(shí)別受體，在調(diào)控炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞存活和增殖、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用。其中Toll樣受體4（TLR4）廣泛分布于腦室周?chē)軈病⑿∧z質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上，其在缺血損傷后活化，與細(xì)胞內(nèi)髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MyD88）結(jié)合后，將信號(hào)傳遞至核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），促進(jìn)其下游炎性因子轉(zhuǎn)錄并大量釋放，引起神經(jīng)元凋亡、壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷［1］。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在腦缺血海馬神經(jīng)元死亡過(guò)程中作用關(guān)鍵，敲除TLR4的小鼠腦水腫程度、腦梗死體積、神經(jīng)元損傷程度都明顯低于野生型，且NF-κB抑制蛋白（I-κB）磷酸化水平和NF-κB激活程度均比野生型低、炎性因子表達(dá)也較野生型少［2］。

醒腦開(kāi)竅針刺法是臨床治療腦卒中并發(fā)癥、后遺癥的有效手段，能有效改善卒中病人的肢體運(yùn)動(dòng)功能，提高生活自理能力，療效獲得病人和家屬的認(rèn)可［3-4］。康復(fù)訓(xùn)練能促進(jìn)卒中病人神經(jīng)功能重建，有利于病人肢體運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［5］。目前，國(guó)內(nèi)外提倡腦血管病病人在生命體征穩(wěn)定后盡早給予治療，以防止出現(xiàn)卒中后肌痙攣，并改善患肢肌力和活動(dòng)能力，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度等。前期采用醒腦開(kāi)竅針刺法結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療缺血性卒中病人的肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙，觀(guān)察到病人血清C反應(yīng)蛋白（CRP）在治療后降低，CRP水平與腦卒中的嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)，提示針刺結(jié)合康復(fù)治療可能對(duì)腦卒中后機(jī)體的炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用［3-4］。本研究從腦缺血后神經(jīng)炎癥角度入手，觀(guān)察針刺治療結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral "artery occlusion，MCAO）大鼠腦內(nèi)TLR4/MyD88/NF-κB 通路的調(diào)節(jié)作用，以闡明針刺治療結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司（批號(hào)CW0535）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)CW0741S）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自GeneCopoeia公司（批號(hào)QP016）；引物由上海生工生物有限公司合成。兔源TLR4多抗（批號(hào)ab13867）、兔源MyD88多抗（批號(hào)ab131071）、兔源NF-κB P65多抗（批號(hào)ab16502）、兔源NF-κB p65（磷酸化位點(diǎn)S536）單抗（批號(hào)ab76302）、兔源β-actin單抗（批號(hào)ab115777）購(gòu)自Abcam公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自Millipore公司（批號(hào)IPVH00010）；RIPA裂解液（批號(hào)R0010）、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)PC0020）、二抗（批號(hào)SE134）、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（批號(hào)SW2020）等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（批號(hào)20200105SR）及白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（批號(hào)20200120SR）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購(gòu)自德國(guó)IBL公司。紫外分光光度計(jì)為T(mén)hermo SCIENTIFIC 公司NANODROP 8000；酶標(biāo)儀為Bio-Tek880；PCR擴(kuò)增儀為T(mén)ECHNE TC-412；凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司ChemiDoc XRS。

1.2 動(dòng)物分組與造模

動(dòng)物分組：健康雄性無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)Wistar大鼠30只，由郴州 市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量190～ 210 g，飼養(yǎng)在完全相同的條件下，溫度（23±2）℃，相 對(duì)濕度40%～70%，自由取食和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（10只）和手術(shù)組（20只）。手術(shù)組采用Zea Longa腔內(nèi)線(xiàn)栓法阻滯大鼠右 側(cè)大腦中動(dòng)脈，制作MCAO（Middle cerebral artery occlusion， ）模型，尼龍線(xiàn)直徑為0.205 mm［6］。假手術(shù)組僅鈍性分離血管但不結(jié)扎，亦不插線(xiàn)，余處理同手術(shù)組。造模24 h后，采用Zausinger六 分法標(biāo)準(zhǔn)［7］對(duì)手術(shù)組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，保留 1～3分的大鼠，并隨機(jī)將符合條件的大鼠再次分為模型組和治療組，每組10只。

1.3 治療

針刺治療：造模24 h后，治療組給予醒腦開(kāi)竅針刺法治療，內(nèi)關(guān)、水溝、三陰交穴后的定位根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的動(dòng)物針灸穴位圖譜，其中水溝穴斜刺1 mm，內(nèi)關(guān)穴直刺1 mm，三陰交穴直刺3 mm。每天針刺1次，連續(xù)14 d。其他組大鼠采用同樣方法抓取，但不給予針刺治療。

康復(fù)訓(xùn)練：造模24 h后進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練。1）滾筒訓(xùn)練：采用網(wǎng)狀滾筒進(jìn)行訓(xùn)練，滾筒長(zhǎng)1 m、直徑0.6 m，中間分成4格，可同時(shí)訓(xùn)練4只鼠，訓(xùn)練時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)一側(cè)的手搖柄，5 r/min。 動(dòng)物在滾筒內(nèi)可進(jìn)行抓握、攀爬等四肢肌肉運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。2）轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練：轉(zhuǎn)棒長(zhǎng)1.5 m、直徑4.5 cm， 中點(diǎn)固定于3 r/min的轉(zhuǎn)動(dòng)器上，順、逆時(shí)針交替轉(zhuǎn)動(dòng)；訓(xùn)練中如果動(dòng)物掉下，需將其重新放上轉(zhuǎn)棒。轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練主要增強(qiáng)動(dòng)物體能和耐力，以及鍛煉感覺(jué)運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)能力。3）平衡木訓(xùn)練：平衡木長(zhǎng)1.7 m、寬2.0 cm，下有支架高7.0 cm，平放于地面，讓動(dòng)物在上面爬行。平衡木訓(xùn)練主要增強(qiáng)動(dòng)物的平衡能力。以上訓(xùn)練每天訓(xùn)練1次，每次10 min，連續(xù)訓(xùn)練14 d。其他組不予任何針對(duì)性訓(xùn)練。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 神經(jīng)功能評(píng)分檢測(cè)

根據(jù)Zausinger六分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別于0 h、24 h、48 h、3 d、 7 d、14 d訓(xùn)練結(jié)束后，對(duì)各組動(dòng)物的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分越低提示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重［7］。

1.4.2 行為學(xué)測(cè)試

分別于0 h、24 h、48 h、3 d、7 d和14 d訓(xùn)練結(jié)束后，對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，以評(píng)價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的改善情況。疲勞轉(zhuǎn)棒測(cè)試：將動(dòng)物放于靜止的轉(zhuǎn)棒 上5 min，待適應(yīng)后，啟動(dòng)轉(zhuǎn)棒，在5 "min內(nèi)勻加速?gòu)?10 r/min 至40 r/min，記錄掉落的時(shí)間，每只動(dòng)物測(cè)3次，間隔5 min，取均值進(jìn)行分析。抓力測(cè)試：讓大鼠前肢抓住金屬三角桿，緩慢向后拖拽尾巴，當(dāng)大鼠前肢松開(kāi)時(shí)記錄最高值即為抓力，每只大鼠測(cè)3次，取均值進(jìn)行分析。

1.4.3 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法檢測(cè)梗死體積百分比

治療結(jié)束后，各組取3只大鼠，麻醉后斷頭取 腦，－20 ℃冰凍腦組織20 min后，自腦前極與視交叉連線(xiàn)中點(diǎn)處向后行冠狀連續(xù)切片，片厚2 mm，共切6片。將切片置于2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育20 min，再在4%多聚甲醛液中固定2 h。拍照，以Image Pro-plus 6.0 軟件計(jì)算腦片總面積及梗死面積，將面積之和乘以厚度（2 mm），得出腦片總體積和梗死體積，由此計(jì)算出梗死體積百分比。

1.4.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）法檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB等的mRNA表達(dá)

治療后，每組取3只大鼠，麻醉后，用冰冷的1×PBS緩沖液經(jīng)心灌注，沖去體內(nèi)血液，冰上快速取缺血半暗帶腦組織，液氮凍存，用于RT-qPCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）的檢測(cè)。取100 mg腦組 織，Trizol法提取總RNA，取2 μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA、正向反向引物、熒光染料等加入反應(yīng)體系中，RT-qPCR法檢測(cè)。引物由蘇州金維智公司合成。TLR4引物序列為正向5′-TGAGCAGTCGTGCTGGTATC-3′ "和反向5′-CAGCAGGGCTTTTCTGAGT-3′；MyD88引物序列為正向5′GCAGTTTGTTGGATGCCTGG-3′和反向5′-TTCTGGCAGTCCTCCTCGAT-3′；p65（NF-κB亞基）引物序列為正向5′-CACCTCAATGGCTACACAGGACCA-3′和反向5′-ATCTTGAGCTCGGCAGTGTT-3′；GAPDH引物序列 為正向5′-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT-3′和反 向5′-CCCCACTTGATTTTGGAGGGA-3′。 PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性15 "min；94 ℃ 15 s、59 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，用2－△△CT法分析結(jié)果，計(jì)算目的基因相對(duì)于管家基因GAPDH的表達(dá)情況。

1.4.5 Western Blot法檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)

取液氮凍存的缺血半暗帶腦組織100 mg，加入 "1 mL RIPA裂解液，冰上勻漿，勻漿液于4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min， 取上清，BCA法行蛋白濃度檢測(cè)。蛋白提取液經(jīng)10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，再與TLR4（1∶2 000）、MyD88（1∶1 000）、總p65（t-p65，1∶1 000）和磷酸化 p65（p-p65，1∶1 000）的一抗雜交，4 "℃孵育過(guò)夜。 1×TBST洗膜3次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h；1×TBST洗膜3次，每次5 min；膜用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶光密度值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次，取均值分析。實(shí)驗(yàn)以β-actin（1∶2 000）作為內(nèi)參照物。

1.4.6 ELISA檢測(cè)腦內(nèi)炎性因子水平

取缺血半暗帶腦組織，依ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)制作組織勻漿，采用酶標(biāo)儀于450 nm檢測(cè)其中TNF-α及IL-1β水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x "± s ）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法（方差齊）/Dunnett′s T3法（方差不齊）；重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，以分組作為組間因素，不同時(shí)間點(diǎn)作為組內(nèi)因素。以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

造模前，所有實(shí)驗(yàn)大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分均為5.0 分；假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分也為5.0分。模型組24 h 的評(píng)分最低，其后的時(shí)間點(diǎn)逐漸升高，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。治療組各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分也逐漸升高，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.01）。從第3天開(kāi)始，治療組神經(jīng)功能評(píng)分與同期模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響

行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)前各組成績(jī)均等，具有可比性。造模后24 h，模型組的轉(zhuǎn)棒和抓力成績(jī)低于假手術(shù)組（ P ＜0.05）；其后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組成績(jī)均維持較為穩(wěn)定，提示造模成功。造模后24 h，治療組的轉(zhuǎn)棒成績(jī)和模型組無(wú)明顯區(qū)別，而與假手術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其后各時(shí)間點(diǎn)，治療組成績(jī)逐漸提高，從造模后3 d開(kāi)始，與同期模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05），說(shuō)明針刺治療結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練促進(jìn)了缺血后運(yùn)動(dòng)功能損傷的修復(fù)。詳見(jiàn)表2、表3。

2.3 對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響

治療結(jié)束，采用TTC染色檢測(cè)各組大鼠腦梗死體積，發(fā)現(xiàn)模型組腦梗死體積大于假手術(shù)組（ P ＜0.01）；治療組經(jīng)針刺治療結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練可降低腦梗死體積，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.01）。詳見(jiàn)圖1、表4。

2.4 各組TLR4/MyD88/NF-κB通路mRNA和蛋白的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果表明，模型組TLR4、MyD88、p65 mRNA表達(dá)較假手術(shù)組升高（ P ＜0.01）。治療組TLR4、MyD88、p65 mRNA表達(dá)較模型組下調(diào)（ P ＜0.05或 P ＜0.01）。詳見(jiàn)圖2。

Western Blot結(jié)果表明，各組β-actin表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示各組上樣量均等，具有可比性（見(jiàn)圖3）。模型組TLR4、MyD88、t-p65、p-p65表達(dá)較假 手術(shù)組升高（ P ＜0.05）。 治療組TLR4、MyD88、t-p65、 p-p65表達(dá)較模型組下調(diào)（ P ＜0.05）。

2.5 對(duì)缺血半暗帶炎性因子水平的影響

模型組IL-1β、TNF-α水平較假手術(shù)組增高（ P ＜ "0.05），治療組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜ 0.05）； 表明針刺治療結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練能降低炎性因子水平。詳見(jiàn)表5。

3 討 論

醒腦開(kāi)竅針刺法是由石學(xué)敏院士創(chuàng)立的用于治療腦卒中的方法。其中內(nèi)關(guān)、水溝、三陰交穴為醒腦開(kāi)竅針刺法的主穴，針刺內(nèi)關(guān)可寧心安神、疏通氣血；針刺水溝可調(diào)督脈、開(kāi)竅啟閉以醒腦安神；針刺三陰交可激發(fā)三陰氣血、養(yǎng)血安神。臨床研究證實(shí)，醒腦開(kāi)竅針?lè)▽?duì)腦卒中急性期、恢復(fù)期均有療效，能降低病人肌張力，緩解肌肉痙攣，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度，促進(jìn)病人運(yùn)動(dòng)功能及神經(jīng)功能的恢復(fù)［3-4］。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是腦卒中后康復(fù)訓(xùn)練方法中的重要手段，已被美國(guó)心臟協(xié)會(huì)推薦作為中風(fēng)預(yù)防和治療策略的一部分［8］。而積極的早期康復(fù)訓(xùn)練是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者較為提倡的方法。日本一項(xiàng)針對(duì)1 588例腦卒中病人早期康復(fù)的研究表明，腦卒中后24 h開(kāi)始康復(fù)的病人，其功能獨(dú)立性測(cè)試（functional independence measure，F(xiàn)IM）評(píng)分增 高［9］。Yang等［10］采用MCAO大鼠，觀(guān)察MCAO后24 h、 MCAO后1周開(kāi)始訓(xùn)練對(duì)缺血損傷的改善效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCAO后24 h訓(xùn)練對(duì)減少梗死體積、改善神經(jīng)功能方面具有顯著作用；但在MCAO后1周組中未觀(guān)察到類(lèi)似結(jié)果。提示盡早進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練有助于促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)。

腦缺血后過(guò)度激活的免疫和炎癥反應(yīng)促進(jìn)了神經(jīng)損傷的進(jìn)展。TLR4作為模式識(shí)別受體，已被證明廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用。TLR4在缺血損傷后活化，識(shí)別并募集MyD88，二者結(jié)合后將信號(hào)傳至下游的NF-κB，促使NF-κB入核，引起IL-1β等多種炎性因子的釋放，而炎性因子的增多又可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞活化，進(jìn)一步釋放活性氧、一氧化氮等神經(jīng)毒性物質(zhì)，造成腦內(nèi)瀑布式級(jí)聯(lián)放大的炎癥效應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷。Zhao等［11］發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注大鼠的腦梗死體積較大，TLR4和NF-κB表達(dá)增強(qiáng)。抑制TLR4/NF-κB通路活性則腦梗死體積減??；而增強(qiáng)TLR4 /NF-κB通路活性則梗死體積增大。提示TLR4/NF-κB表達(dá)與腦缺血損傷程度相關(guān)，可以通過(guò)抑制TLR4 /NF-κB信號(hào)通路來(lái)減輕腦缺血再灌注損傷。

研究顯示，針刺治療后MCAO大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化減少、缺血半暗帶組織中NF-κB表達(dá)水平下調(diào)、 炎性因子白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、 TNF-α含量下降［12-13］。此外，電針治療能夠降低MCAO小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度，下調(diào)TLR4 mRNA及促炎因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)［14］。小膠質(zhì)細(xì)胞激活與TLR4/NF-κB通路密切相關(guān)［15］，同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞還是腦內(nèi)分泌促炎因子IL-1β、TNF-α等的主要細(xì)胞，提示針刺治療可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路而減輕腦內(nèi)神經(jīng)炎癥。

循環(huán)單核細(xì)胞是表達(dá)TLR4的主要外周細(xì)胞，臨床研究發(fā)現(xiàn)，定期運(yùn)動(dòng)后外周單核細(xì)胞數(shù)量下降［16］；TLR4在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練受試者的外周血表達(dá)較非運(yùn)動(dòng)受試者低，且同一受試者在運(yùn)動(dòng)后TLR4的表達(dá)較運(yùn)動(dòng)前低［17］。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組受試者的外周血在脂多糖（LPS）刺激下，其TLR4及IL-6、IL-1、TNF-α的表達(dá)較非運(yùn)動(dòng)組低［18］，以上均提示運(yùn)動(dòng)能抑制TLR4的表達(dá)。動(dòng)物研究也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能降低腦缺血大鼠血腦屏障的開(kāi)放程度、減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。血腦屏障緊密性增加有助于減少外周炎性細(xì)胞及炎性因子對(duì)中樞的侵?jǐn)_，起到腦保護(hù)的作用［19］。

本研究中，TTC染色結(jié)果提示治療后腦缺血損傷大鼠腦梗死體積減小，RT-PCR和Western Blot結(jié)果 提示腦缺血損傷后缺血半暗帶處TLR4、MyD88、NF-κB "p65 mRNA和蛋白表達(dá)上升，而治療后各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)降低。特別是針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練降低了NF-κB、p65的磷酸化水平及相關(guān)炎性因子的表達(dá)，提示盡早治療抑制了TLR4/MyD88/NF-κB通路活性，減少了腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，降低了腦組織的損傷程度。本研究結(jié)果與Zhu等［20］的研究結(jié)果一致，上述研究結(jié)果也證明運(yùn)動(dòng)能減少缺血再灌注大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路活性。但Zhu等［20］研究是對(duì)腦缺血大鼠給予運(yùn)動(dòng)預(yù)處理，而本課題組研究的治療時(shí)機(jī)則是缺血后24 h，如此訓(xùn)練的依據(jù)是一方面更符合臨床實(shí)際情況，另一方面則是有研究結(jié)果提示，腦卒中病人早期常規(guī)訓(xùn)練（腦卒中后24～48 h內(nèi)接受訓(xùn)練）的預(yù)后優(yōu)于超早期訓(xùn)練（腦卒中后24 h內(nèi)接受訓(xùn)練）［21］。

腦缺血可激活MCAO大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為T(mén)LR4/MyD88/NF-κB通路活性增高，促炎因子IL-6和TNF-α水平增加。針刺治療結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練能下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB通路活性及相關(guān)炎性因子水平，進(jìn)而改善神經(jīng)元存活微環(huán)境，減輕神經(jīng)缺血損傷。

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（收稿日期：2022-09-20）

（本文編輯 王雅潔）