摘要 目的： 探討姜黃素（Cur）是否通過調(diào)控微小RNA-21（miR-21）影響病毒性心肌炎（VMC）心肌細(xì)胞的凋亡及炎癥反應(yīng)。 方法： 用柯薩奇病毒 B3（CVB3）感染心肌細(xì)胞建立VMC心肌細(xì)胞模型記為CVB3組，未經(jīng)任何處理的心肌細(xì)胞作為對照組。以不同濃度（0.25，0.50，1.00 μmol）的Cur處理心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）的含量；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測Cur對miR-21表達(dá)水平的影響；分別將anti-miR-con、anti-miR-21轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后使用CVB3處理，分別將miR-con、miR-21 mimics轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后使用Cur與CVB3處理，采用上述方法檢測細(xì)胞凋亡率及炎性因子的含量；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、核因子-κB（NF-κB）信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 與對照組比較，CVB3組心肌細(xì)胞凋亡率［（6.81±0.60）%與（21.38±1.92）%］升高（ P ＜0.05），miR-21［（1.00±0.05）與（1.84±0.12）］、 Cleaved Caspase-3表達(dá)水平［（0.31±0.01）與（1.21±0.08）］、TNF-α［（105.44±9.15）ng/mL與 （623.10±41.06）ng/mL］、IL-6［（89.01±6.11） pg/mL與（453.67±31.32）pg/mL］、MCP-1［（491.16±38.02）pg/mL與（1 803.11±82.01）pg/mL］水平升高（ P ＜0.05），Cur處理后能夠逆轉(zhuǎn)CVB3對VMC心肌細(xì)胞凋亡、炎性因子水平及NF-κB信號通路相 關(guān)蛋白表達(dá)的影響；干擾miR-21表達(dá)可降低細(xì)胞凋亡率及TNF-α、 IL-6、MCP-1水平（ P ＜0.05），抑制Cleaved Caspase-3過表達(dá)，miR-21能夠部分逆轉(zhuǎn)Cur對VMC心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)論： Cur可通過下調(diào)miR-21的表達(dá)緩解VMC心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)而對心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路活化及心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 "病毒性心肌炎；姜黃素；微小RNA-21；核因子-κB信號通路；細(xì)胞凋亡；炎性因子；實(shí)驗(yàn)研究

doi： "10.12102/j.issn.1672-1349.2023.14.011

Effects of Curcumin Regulating miR-21 on Cell Apoptosis， Inflammatory Response， and NF-κB Signaling Pathway in Viral Myocarditis

QIU Fengmei， DENG Li， ZHOU Xinyi

Jingmen Second People′s Hospital， Jingmen 448000， Hubei， China

Corresponding Author "ZHOU Xinyi， E-mail： 609470344@qq.com

Abstract Objective： To investigate curcumin（Cur） affects the apoptosis and inflammatory response of viral myocarditis（VMC） cells by regulating microRNA-21（miR-21）. "Methods： The VMC cardiomyocyte model was established by infecting cardiomyocytes with Coxsackievirus B3（CVB3），which was recorded as the CVB3 group，and the cardiomyocytes without any treatment were used as the control group.Cardiomyocytes were treated with Cur at different concentrations（0.25 μmol，0.50 μmol，1.00 μmol） for intervention，and the apoptosis rate was detected by flow cytometry.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin 6（IL-6），and monocyte chemoattractant-1（MCP-1）;quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to detect the effect of Cur on the expression level of miR-21.Cardiomyocytes were treated with CVB3，Cur and CVB3，respectively，after being transfected by anti-miR-con and anti-miR-21，respectively.to detect the apoptosis rate of cells and the content of inflammatory factors by the above method.Western Blot was used to detect the activated cysteine-containing aspartic acid proteolytic enzyme 3（Cleaved Caspase-3） and transcription factor-nuclear factor（NF-κB） signaling pathway-related protein expression. "Results： Compared with the control group，the apoptosis rate of cardiomyocytes in the CVB3 group［（6.81±0.60）% vs（21.38±1.92）%］ increased（ P ＜0.05）;miR-21［（1.00±0.05） vs（1.84 ±0.12）］，Cleaved Caspase-3 expression level［（0.31±0.01） vs（1.21±0.08）］，TNF-α［（105.44±9.15） ng/mL vs （623.10±41.06）ng/mL］，IL- 6［（89.01±6.11） pg/mL vs（453.67±31.32）pg/mL］，MCP-1 level［（491.16±38.02） pg/mL vs（1 803.11±82.01）pg/mL］ increased（ P ＜0.05）.Cur treatment could reverse the effects of CVB3 on VMC cardiomyocyte apoptosis，inflammatory factor levels，and NF-κB signaling pathway-related protein expression.Interference with miR-21 expression could reduce cell apoptosis rate，the levels of TNF-α，IL-6，and MCP-1（ P ＜0.05），and inhibit the overexpression of Cleaved Caspase-3.miR-21 can partially reverse the effects of Cur on VMC cardiomyocyte apoptosis，inflammatory response，and NF-κB signaling pathway-related protein expression. "Conclusion： Cur could protect cardiomyocytes by down-regulating the expression of miR-21 and alleviating the inflammatory response of VMC cardiomyocytes，and its mechanism might be related to the inhibition of NF-κB signaling pathway activation and cardiomyocyte apoptosis.

Keywords "viral myocarditis; curcumin; miR-21; nuclear factor-κB signaling pathway; cell apoptosis; inflammatory factors; experimenal research

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是指由柯薩奇病毒 B3（coxsackievirus B3，CVB3）等病毒感染引起的心肌炎性疾病，研究顯示VMC可發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病或心力衰竭［1-2］。但VMC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡 明。研究表明病毒感染可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB） 信號通路，激活線粒體途徑促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡［3］。姜黃素（curcumin，Cur）是中藥姜黃的主要成分，其具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種作用［4］。研究表明Cur可減輕心肌梗死大鼠的心肌缺血再灌注損傷［5］。但Cur是否能夠抑制VMC尚未可知。研究報(bào)道指出微小RNA-21（microRNA-21，miR-21）在VMC小鼠心肌 組織中呈高表達(dá)，并可能參與VMC發(fā)生過程［6］。miR-21 在VMC患兒血清中表達(dá)水平升高，其表達(dá)量與心肌損傷程度呈正相關(guān)［7］。本研究采用CVB3處理心肌細(xì)胞構(gòu)建VMC模型，探討Cur對VMC的作用機(jī)制，分析其對心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響，初步探究其是 否通過調(diào)控miR-21表達(dá)及NF-κB信號通路而發(fā)揮 作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 "Cur（美國Sigma公司）；CVB3（第三軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國Thermo Fisher公司）；大鼠心肌細(xì)胞H9c2（上海冠導(dǎo)生物工程有限公司）；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海潤成生物科技有限公司）；Trizol、反轉(zhuǎn)錄與SYBR Green熒光染料試劑盒（大連寶生物工程有限公司）； miR-21抑制劑（anti-miR-21）、陰性對照（anti-miR-con）、 miR-21模擬物（mimics）陰性對照 mimic NC 序列（miR-con）（廣州銳博生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）；兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、p-p65、p-IκBα一抗（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)處理與分組 "心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱，每2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長匯合至80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集第3代細(xì)胞，用含有1×103 TCID50CVB3病毒懸液（0.2 mL）的DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h，記為CVB3組，未經(jīng)任何處理的心肌細(xì)胞作為對照組［8］。用不同濃度的Cur處理CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì) 胞，分別為CVB3＋0.25 μmol Cur組、CVB3＋0.50 μmol "Cur組、CVB3＋1.00 μmol Cur組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將對數(shù)生長期心肌細(xì)胞分為CVB3＋anti-miR-con組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-con，用含有CVB3的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）、CVB3＋anti-miR-21組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-21， 用含有CVB3的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）、CVB3＋Cur＋miR-con 組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-con，用含有Cur與CVB3的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）、CVB3＋Cur＋miR-21組（細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimics，用含有Cur與CVB3的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）。

1.2.2 測定細(xì)胞中TNF-α、 IL-6 、MCP-1水平 ""采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，接種于6孔板 （2×105/mL）， 按照分組進(jìn)行處理，0.25%胰蛋白酶消化，4 ℃ 條件下12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6、MCP-1水平。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 "分別取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消 化，室溫條件下，4 ℃條件下12 000 "r/min轉(zhuǎn)速離心 6 min，棄上清，預(yù)冷PBS清洗，加入500 μL結(jié)合緩沖 液，依次加入5 μL Annexin V-FITC，充分混勻，加入 5 μL PI，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平 "收集各組細(xì)胞，按照Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，RNA溶解于無RNase水內(nèi)，應(yīng)用紫外分管光度計(jì)檢測RNA濃度，取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miR-21與U6引物序列見表1，引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 每孔10 μL，正反向引物每孔0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性45 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環(huán) 35次，miR-21以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-21 相對表達(dá)量。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測Cleaved-Caspase-3、NF-κB信號通路 p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá) "收集各組細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸法（BCA）法測定蛋白濃度，每個(gè)加樣孔加樣20 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（1∶1 000、4 ℃）搖床上孵育24 h，TBST洗滌，分別加入相應(yīng)二抗（1∶2 000、室溫條件下）搖床孵育1 h，TBST洗滌，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（ECL），暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 "采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 定量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及組間方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布及方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD- t 檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x "± s ）表 示；不符合正態(tài)分布、方差齊性分析的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis "H 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Cur對VMC心肌細(xì)胞凋亡的影響 "與對照組比較，CVB3組心肌細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高（ P ＜0.05）；當(dāng)予以Cur干預(yù)后，與CVB3組比較，CVB3＋0.25 μmol Cur組、CVB3＋0.50 μmol Cur組、CVB3＋1.00 μmol Cur組心肌細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均隨著Cur使用劑量的增加而降低 （ P ＜0.05），由于Cur濃度為0.50 μmol時(shí)作用效果較為顯著，0.50 μmol Cur組與1.00 μmol Cur組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因而選用0.50 μmol Cur進(jìn)行后續(xù)研究。詳見圖1、表2。

2.2 Cur對VMC心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 "與對照組比較，CVB3組心肌細(xì)胞中TNF-α、 IL-6、MCP-1水平升高（ P ＜0.05）；當(dāng)予以0.50 μmol Cur干預(yù)后，TNF-α、 IL-6 、MCP-1水平降低（ P ＜0.05）。詳見表3。

2.3 Cur調(diào)控miR-21 mRNA的表達(dá) "RT-qPCR檢測心肌細(xì)胞中miR-21 mRNA的表達(dá)，與對照組比較，CVB3組心肌細(xì)胞中miR-21 mRNA（1.00±0.12與1.89±0.18）表達(dá)水平升高（ P ＜0.05）； 而當(dāng)予以Cur干預(yù)后，可降低miR-21 mRNA（1.89± 0.18與1.20±0.12）的表達(dá)水平（ P ＜0.05）。

2.4 干擾miR-21表達(dá)對VMC心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響 ""與CVB3＋anti-miR-con組比較，CVB3＋anti-miR-21 組心肌細(xì)胞凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白 表達(dá)水平及TNF-α、IL-6、MCP-1水平均降低（ P ＜ 0.05）。詳見表4、圖2

2.5 miR-21高表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)Cur對VMC心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響（Cur為0.5 μmol） "實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于CVB3＋Cur＋miR-con組， "CVB3＋Cur＋miR-21組心肌細(xì)胞凋亡率升高（ P ＜0.05）， Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（ P ＜0.05），TNF-α、 IL-6 、MCP-1水平升高（ P ＜0.05）。詳見圖3、表5。

2.6 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)（Cur為0.5 μmol） "檢測結(jié)果顯示，與CVB3組比較，CVB3＋Cur組 心肌細(xì)胞中p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)量減低（ P ＜ "0.05）；相對于CVB3＋Cur＋miR-con組，CVB3＋Cur＋ miR-21組心肌細(xì)胞中p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)量增加（ P ＜0.05）。詳見圖4、表6。

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡異常可促進(jìn)VMC發(fā)生，研究表明抑制心肌細(xì)胞凋亡可減緩VMC等心臟疾病的發(fā)生［9-11］。因而深入探究VMC發(fā)病機(jī)制對尋找有效治療VMC藥物具有重要意義。Cur可能通過上調(diào)AcSOD水平及沉默信息調(diào)節(jié)因子3（SIRT3）表達(dá)而增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化能力從而保護(hù)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷［12］。研究表明Cur可能通過抑制NF-κB入核表達(dá)從而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞分化［13］。本研究結(jié)果顯示CVB3處理心肌細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率升高，提示VMC模型構(gòu)建成功。采用不同濃度的Cur處理CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率降低，進(jìn)一步檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3表達(dá)，結(jié)果顯示Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，已有報(bào)道指出Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，可促使凋亡因子釋放量增加并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，從而激活Caspase-9，Caspase-9可激活下游執(zhí)行因子Caspase-3，Caspase-3形成Cleaved Caspase-3從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］。提示Cur可能通過降低Cleaved Caspase-3表達(dá)抑制VMC心肌細(xì)胞凋亡。研究表明 VMC發(fā)病過程中涉及多種炎癥細(xì)胞因子，其中TNF-α、 IL-6、MCP-1水平升高，IL-6可通過誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分化從而促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生，TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生并可促進(jìn)心肌細(xì)胞中炎性細(xì)胞的持續(xù)性浸潤，MCP-1與TNF-α具有一定協(xié)同作用，TNF-α可促進(jìn)MCP-1表達(dá)從而加重心肌細(xì)胞炎癥浸潤［15-16］。本研究結(jié)果顯示，CVB3處理后細(xì)胞中TNF-α、 IL-6 、 MCP-1的水平明顯升高，Cur處理后可明顯降低TNF-α、 "IL-6 、MCP-1水平，提示Cur可通過降低TNF-α、 IL-6、 MCP-1水平減輕VMC心肌細(xì)胞損傷，從而改善心 功能。

miR-21表達(dá)異常與冠心病、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究表明miR-21 RNA高表達(dá)可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）/Smad7信號通路從而促進(jìn)慢性VMC心肌細(xì)胞小鼠心肌纖維化［17-18］。本研究結(jié)果顯示，CVB3處理后心肌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平升高，Cur處理后細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平降低，進(jìn)一步研究顯示干擾miR-21表達(dá)可抑制VMC心肌細(xì)胞凋亡，降低炎性因子表達(dá)水平，miR-21高表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)Cur對VMC凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。提示Cur可通過下調(diào)miR-21表達(dá)從而抑制VMC心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。研究表明抑制NF-κB信號通路可抑制軟骨細(xì)胞炎性反應(yīng)的發(fā)生，還可減輕神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)從而對缺血再灌注損傷后的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用［19-20］。本研究結(jié)果顯示Cur處理后VMC心肌細(xì)胞中p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá) 量降低，miR-21過表達(dá)后可上調(diào)VMC心肌細(xì)胞中 p-p65、p-IκBα蛋白表 達(dá)，提示Cur可通過下調(diào)miR-21表達(dá)及抑制NF-κB 信號通路活化而抑制VMC心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)。

綜上所述，Cur可通過抑制miR-21表達(dá)減少炎性因子表達(dá)及抑制細(xì)胞凋亡，對VMC心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路活化有關(guān)。但關(guān)于miR-21如何調(diào)控下游靶基因尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2022-03-22）

（本文編輯 王雅潔）