摘要 目的： 探討胱天蛋白酶募集域蛋白6（CARD6）對(duì)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）中炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響，并分析其相關(guān)分子機(jī)制。 方法： 將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（MIRI組）、MIRI＋空載慢病毒（LV-NC）組、MIRI＋CARD6過(guò)表達(dá)慢病毒組（MIRI＋LV-CARD6組），每組15只。除Sham組外，其他各組大鼠采用手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法構(gòu)建MIRI模型。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)心肌損傷指標(biāo)含量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)炎性細(xì)胞因子水平，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化，原位末端標(biāo)記測(cè)定（TUNEL）染色法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）法和Western Blot法檢測(cè)大鼠心肌組織中CARD6、細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 與Sham組比較，MIRI組大鼠心肌細(xì)胞水腫變性，大量間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，存在明顯心肌組織病理?yè)p傷；大鼠血清中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白T（cTnT）水平及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）水平均升高；心肌細(xì)胞凋亡率升高，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白表達(dá)量均升高；心肌組織中CARD6蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低，ASK1蛋白和mRNA表達(dá)水 平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。 與MIRI組比較，MIRI＋LV-CARD6組大鼠心肌細(xì)胞水腫減輕，間質(zhì)炎性滲出減少，心肌組織病理?yè)p傷明顯減輕；大鼠血清LDH、CK、CK-MB、cTnT、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平均降低；心肌細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)量均降低；心肌組織中CARD6蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高，ASK1蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05）。 結(jié)論： CARD6通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡保護(hù)MIRI，其作用機(jī)制與調(diào)控ASK1表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 "心肌缺血再灌注損傷；胱天蛋白酶募集域蛋白6；細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1；炎癥反應(yīng)；細(xì)胞凋亡；實(shí)驗(yàn)研究

doi： "10.12102/j.issn.1672-1349.2023.14.010

CARD6 Protects Against Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury by Regulating ASK1 Expression to Inhibit Inflammation and Apoptosis

ZHAO Haiyan， YAN Jinlong， BANNU Kuken

The Seventh Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830063， Xinjiang， China

Corresponding Author "YAN Jinlong， E-mail： 214289027@qq.com

Abstract Objective： To investigate the effect of caspase recruitment domain protein 6（CARD6） on inflammatory response and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI） . "Methods： A total of 60 Sprague-Dawley（SD） rats were randomly divided into sham operation group（sham group），model group（MIRI group），MIRI＋empty lentivirus group（MIRI＋LV-NC group），MIRI＋CARD6 overexpression lentivirus group（MIRI＋LV-CARD6 group），with 15 rats in each group.Except for the sham group，rats in other groups MIRI modelswere established "by surgical ligation of the left anterior descending coronary artery.An automatic biochemical analyzer was used to detect the content of myocardial injury indicators;enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the level of inflammatory cytokines;hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the morphological changes of myocardial tissue in rats;the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） assay was used to detect cardiomyocyte apoptosis; Western Blot was used to detect the expression of apoptosis-related "proteins in rat myocardial tissue;the real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-qPCR） and Western Blot were used to detect CARD6，apoptosis signal-regulated kinase 1（ASK1） mRNA，and protein expression in rat myocardial tissue. "Results： "Compared with the sham group，the rats in the MIRI group myocardial cell edema and degeneration，a large number of interstitial inflammatory cell infiltration，and obvious myocardial histopathological damage;the serum levels of lactate dehydrogenase（LDH），creatine kinase（CK），creatine kinase isoenzyme（CK-MB），cardiac troponin T（cTnT） levels，tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6），interleukin-1β（ IL-1β） and monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1） levels increased;cardiomyocyte apoptosis rate increased，B lymphocytoma-2 gene（Bcl-2） protein expression decreased.Bcl-2-associated X protein（Bax） and Caspase-3 protein expressions both increased;CARD6 protein and mRNA expression levels in myocardial tissue decreased，ASK1 protein and mRNA expression levels increased，and the difference was statistically significant（ P ＜0.05）.Compared with the MIRI group，the MIRI＋LV-CARD6 group Showed less myocardial cell edema，less interstitial inflammatory exudation，and significantly less myocardial pathological damage;the levels of LDH，CK，CK-MB，cTn-T，TNF-α，IL-6，IL-1β，and MCP-1 in serum decreased;the apoptosis rate of cardiomyocytes decreased，the protein expression of Bcl-2 increased，and the protein expression of Bax and Caspase-3 decreased;CARD6 protein and mRNA expression level in myocardial tissue increased，the expression levels of ASK1 protein and mRNA decreased，and the difference was statistically significant（ P ＜0.05）. "Conclusion： CARD6 could protect MIRI by inhibiting inflammatory response and apoptosis，and its mechanism is related to the regulation of ASK1 expression.

Keywords "myocardial ischemia-reperfusion injury; Caspase recruitment domain protein 6; apoptosis signal-regulated kinase 1; inflammation; apoptosis; experimental research

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是世界范圍內(nèi)心血管疾病病人住院、死亡的常見原因之一，其發(fā)病是由于冠狀動(dòng)脈供血供氧中斷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)能量下降，最終致使心肌細(xì)胞壞死［1-2］。當(dāng)前，及時(shí)恢復(fù)缺血心肌的血流是有效減少梗死范圍并降低病人死亡率的方法，然而，這種治療可能對(duì)心肌造成復(fù)合損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）［3］。MIRI 的發(fā)生嚴(yán)重影響AMI病人預(yù)后，但由于MIRI發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，臨床上尚無(wú)有效治療MIRI的靶點(diǎn)或藥物［4］。因此，探索MIRI的發(fā)病機(jī)制，尋找減輕MIRI的有效途徑或方法，對(duì)于改善AMI預(yù)后至關(guān)重要。胱天蛋白酶募集域蛋白6（caspase recruitment domain protein 6，CARD6）是CARD結(jié)構(gòu)域蛋白的典型成員，屬于同型蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用模塊，其通過(guò)連接參與細(xì)胞凋亡或先天免疫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成部分，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)［5］。CARD6最初被認(rèn)為與細(xì)胞生長(zhǎng)期間核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)的激活有關(guān)［6］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)CARD6可有效減輕肝臟缺血/再灌注損傷［7］。Li等［8］研究報(bào)道，壓力過(guò)載增加了CARD6的表達(dá)，可防止心肌肥厚。但CARD6在MIRI中的作用效果和機(jī)制尚少有報(bào)道，因此，本研究旨在探討CARD6對(duì)MIRI中炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響，并分析其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 "選取無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)SD雄性大鼠60只， 8周齡，體質(zhì)量220～240 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（新）2018-0002。所有動(dòng)物均嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則，置于室溫22～26 ℃、相對(duì)濕度50%～60%、12 h光暗交替的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。

1.2 主要試劑 "空載慢病毒（LV-NC）和CARD6過(guò)表達(dá)慢病毒（LV-CARD6）均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司；肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白T （cTnT）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢賽培生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購(gòu)自武漢博爾夫生物科技有限公司；原位末端標(biāo)記測(cè)定法（TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自塞維爾生物技術(shù)有限公司；Trizol提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海翌圣生物科技股份有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CARD6、細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組給藥與MIRI模型建立 "將飼養(yǎng)1周的60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（MIRI組）、 MIRI＋LV-NC組、MIRI＋LV-CARD6組，每組15只。其中MIRI＋ LV-NC組大鼠經(jīng)尾靜脈注射LV-NC慢病毒，MIRI＋LV-CARD6組大鼠經(jīng)尾靜脈注射LV-CARD6慢病毒，注射劑量均為每只10 μL；Sham組和MIRI組大鼠均尾靜脈注射等劑量 生理鹽水。于注射給藥2周后，MIRI組、MIRI＋LV-NC組和MIRI＋LV-CARD6 組大鼠采用手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法構(gòu)建MIRI模型。操作如下：大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，給予氣管插管，連接心電圖和小動(dòng)物呼吸機(jī)后，沿大鼠左側(cè)第3肋、第4肋間切開皮膚，打開胸腔暴露心臟，于左心耳下方約2 mm處鈍性分離冠狀動(dòng)脈左前降支血管并以0號(hào)手術(shù)線進(jìn)行活結(jié)結(jié)扎，30 min后打開活結(jié)恢復(fù)血流進(jìn)行再灌注2 h。大鼠缺血時(shí)心肌局部組織發(fā)紺、心電圖顯示ST段持續(xù)抬高，再灌注時(shí)心肌組織恢復(fù)紅潤(rùn)且ST段下降表示造模成功。Sham組大鼠同上述操作，但不進(jìn)行冠狀動(dòng)脈左前降支血管結(jié)扎。

1.3.2 大鼠心肌損傷指標(biāo)檢測(cè) "再灌注2 h后，麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后以3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，應(yīng)用 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清LDH、CK、CK-MB、 cTnT含量。

1.3.3 大鼠血清炎性細(xì)胞因子水平檢測(cè) "取制備的大鼠血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平。

1.3.4 HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化 "腹主動(dòng)脈取血結(jié)束后立即處死大鼠，摘取大鼠心臟，部分置于4 %多聚甲醛中固定，制作4 μm厚度的石蠟切片；部分置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取大鼠心肌組織石蠟切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察。

1.3.5 TUNEL染色法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 ""取大鼠心肌組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，用 0.5% Triton X-100溶液孵育20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，滴加50 μL 含有熒光素-12-dUTP的TUNEL試劑，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，DAPI顯色，蘇木素復(fù)染，封片后熒光顯微鏡下觀察，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.3.6 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中CARD6和ASK1 mRNA表達(dá)

取大鼠心肌組織，加入Trizol提取心肌組織中總RNA，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量。以反轉(zhuǎn)錄試 劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系為20 μL。引物序列：CARD6正向引物為：5′-AGCACTCTGTATCTACATGAC-3′， 反向引 物為：5＇-ATGATGCCATTATAAGACCGA-3＇，擴(kuò)增 產(chǎn)物長(zhǎng)度為154 bp；ASK1正向引物為：5′-GATCGACCCTAACCAAGGCT-3′， "反向引物為：5′-ACCAGTTCTTCTGAGGCACA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為113 bp；GAPDH正向引物為：5′- GAACAGTGTGGTCGGTGAGG-3′， 反向引物為：5′-TTACCGGGCCCAAGTGTAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為169 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，按公式2－△△Ct計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。

1.3.7 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)大鼠心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白、CARD6和ASK1蛋白表達(dá)

取大鼠心肌組織，用RIPA裂解液裂解，提取心肌組織中總蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA法確定蛋白濃度，將蛋白煮沸變性后，取定量蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫 脂牛奶中常溫封閉1 h，洗膜后，加入一抗Bcl-2 （1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、 CARD6（1∶2 000）、 ASK1（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）， "4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h， "ECL發(fā)光液顯影成像，以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 "采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x "± s ）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD- t 檢驗(yàn)，以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MIRI大鼠心肌組織中CARD6表達(dá)水平 "與Sham組比較，MIRI組大鼠心肌組織中CARD6蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低（ P ＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋LV-NC組大鼠心肌組織中 CARD6蛋白和mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化（ P ＞0.05）， MIRI＋LV-CARD6組大鼠心肌組織中CARD6蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高（ P ＜0.05）。詳見圖1。

2.2 CARD6對(duì)MIRI大鼠心肌損傷指標(biāo)水平的影響 ""與Sham組比較，MIRI組大鼠血清LDH、CK、CK-MB、 cTnT水平均升高（ P ＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋LV-NC組大鼠血清LDH、CK、CK-MB、cTnT水平均無(wú)明顯變化（ P ＞0.05），MIRI＋LV-CARD6組大鼠血清LDH、CK、CK-MB、cTnT水平均降低（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.3 "CARD6對(duì)MIRI大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響 ""Sham組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯細(xì)胞水腫、壞死；MIRI組和MIRI＋LV-NC組大鼠心肌細(xì)胞連接松散，排列紊亂，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞水腫變性，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多；MIRI＋LV-CARD6組大鼠心肌排列較為整齊，細(xì)胞水 腫減輕，間質(zhì)炎性滲出減少，較MIRI組和MIRI＋LV-NC 組心肌組織病理?yè)p傷明顯減輕。詳見圖2。

2.4 CARD6對(duì)MIRI大鼠血清炎性細(xì)胞因子水平的影響 "與Sham組比較，MIRI組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平均升高（ P ＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋LV-NC組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平均無(wú)明顯變化（ P ＞0.05），MIRI＋LV-CARD6組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平均降低（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.5 CARD6對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的影響 "與Sham組比較，MIRI組大鼠心肌細(xì)胞 凋亡率升高，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量降低，Bax和Caspase-3 表 達(dá)量均升高（ P ＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋LV-NC 組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)量均無(wú)明顯變化（ P ＞0.05），MIRI＋LV-CARD6組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)量升高，Bax和Caspase-3表達(dá)量均降低（ P ＜0.05）。詳見圖3、圖4。

2.6 "CARD6對(duì)MIRI大鼠心肌組織中ASK1表達(dá)的影響 ""與Sham組比較，MIRI組大鼠心肌組織中ASK1蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高（ P ＜0.05）；與MIRI組比較，MIRI＋LV-NC組大鼠心肌組織中ASK1蛋白和mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化（ P ＞0.05），MIRI＋LV-CARD6組大鼠心肌組織中ASK1蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低（ P ＜0.05）。詳見圖5。

3 討 論

近年來(lái)，AMI發(fā)病率呈上升趨勢(shì)的同時(shí)也趨于年輕化，盡管臨床推廣應(yīng)用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入、溶栓治療等技術(shù)治療AMI，但AMI治療中無(wú)法有效避免MIRI的發(fā)生，MIRI逐漸成為臨床面臨的主要難題之一［9］。研究表明MIRI與細(xì)胞內(nèi)離子超載、線粒體膜損傷、氧自由基產(chǎn)生、內(nèi)皮功能障礙、免疫激活、細(xì)胞凋亡等多種病理機(jī)制相關(guān)［10-11］。目前臨床上無(wú)確定藥物治療MIRI，常以針對(duì)性應(yīng)用抗血小板聚集等藥物為治療策略，故而探索治療MIRI的新方法至關(guān)重要。CARD6定位于細(xì)胞質(zhì)中，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。Wang等［12］報(bào)道，CARD6基因敲除小鼠在脊髓損傷后表現(xiàn)出較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，而CARD6基因過(guò)表達(dá)小鼠則表達(dá)出相反的效果，并抑制細(xì)胞凋亡，提示CARD6過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥和氧化應(yīng)激來(lái)減輕小鼠的脊髓損傷。劉安祥［13］研究報(bào)道，CARD6可能通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)過(guò)程減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，保護(hù)大鼠神經(jīng)功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIRI大鼠中CARD6表達(dá)量下調(diào)，提示CARD6參與MIRI發(fā)生、發(fā)展。與Sham組 大鼠相比，MIRI組大鼠心肌損傷指標(biāo)LDH、CK、CK-MB、 cTnT水平均升高，而CARD6過(guò)表達(dá)慢病毒的干預(yù)則降低了MIRI大鼠心肌損傷指標(biāo)LDH、CK、CK-MB、cTnT水平，并減輕大鼠心肌細(xì)胞水腫、減少心肌間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，改善MIRI大鼠心肌組織病理?yè)p傷，表明CARD6可有效減輕MIRI。

心肌梗死引起無(wú)菌炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致梗死心肌面積擴(kuò)大和心力衰竭，加重心肌損傷。有研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)是MIRI發(fā)生的病理機(jī)制之一［14］，TNF-α、IL-6、IL-1β是巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等分泌的主要促炎因子，其表達(dá)水平變化可直接反映機(jī)體炎癥反應(yīng)程度。相關(guān)研究報(bào)道，在MIRI中，降低炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平可提高心肌細(xì)胞的存活率［15-16］。MCP-1是一種趨化因子，參與動(dòng)脈粥樣硬化的起始炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂。研究發(fā)現(xiàn)MCP-1在AMI病人外周血中表達(dá)升高，在AMI發(fā)生后心室重塑中起著重要作用［17］。Zhang等［18］報(bào)道，MCP-1在MIRI中表達(dá)升高，參與并介導(dǎo)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，MIRI大鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平均升高，CARD6降低MIRI大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1水平。提示CARD6可抑制MIRI中的炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是參與各種疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的程序性細(xì)胞死亡形式之一，受體內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3等介導(dǎo)的一系列信號(hào)通路調(diào)控。過(guò)度的細(xì)胞凋亡可以促進(jìn)冠狀動(dòng)脈疾病、MIRI、缺血后心臟重構(gòu)和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等一系列病理過(guò)程，因此，靶向細(xì)胞凋亡的治療對(duì)于減輕MIRI具有重要意義［19-20］。既往研究證實(shí)，抑制細(xì)胞凋亡可改善MIRI［21］。本研究檢測(cè)MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，MIRI大鼠 心肌細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量下調(diào)，Bax和Caspase-3 蛋白表達(dá)量上調(diào)。CARD6則降低MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)量，下調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)量。該結(jié)果提示CARD6能夠通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減輕MIRI。

ASK1是一種廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其被激活可響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、鈣信號(hào)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)等多種信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，ASK1不僅在應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中起著關(guān)鍵作用，而且在促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)或?qū)垢鞣N應(yīng)激的生物活動(dòng)中也發(fā)揮著重要作用［22］。研究報(bào)道，ASK1參與了腎臟、肝臟MIRI的發(fā)生，抑制ASK1激活可在一定程度上抑制MIRI引起的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡［23-24］。Xu等［25］發(fā)現(xiàn)抑制ASK1介導(dǎo)的c-Jun氨基端激酶（JNK）/p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可減輕MIRI的發(fā)生。本研究檢測(cè)MIRI大鼠中ASK1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MIRI大鼠心肌組織中ASK1蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)，提示ASK1參與MIRI發(fā)生、發(fā)展。Sun等［26］研究報(bào)道，CARD6與ASK1及其介導(dǎo)的JNK/p38信號(hào)通路具有相互作用，ASK1可介導(dǎo)CARD6的功能。本研究探索MIRI中CARD6與ASK1的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導(dǎo)的CARD6過(guò)表達(dá)能下調(diào)MIRI大鼠心肌組織中ASK1蛋白和mRNA表達(dá)水平。表明在MIRI中，CARD6通過(guò)抑制ASK1表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)CARD6可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡減輕MIRI，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)ASK1表達(dá)相關(guān)。本研究為臨床治療MIRI提供了新的靶點(diǎn)和方向。

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（收稿日期：2022-03-28）

（本文編輯 王雅潔）