摘要 目的： 探討洋參芎芍方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞代謝、炎癥反應(yīng)的影響及其可能的機(jī)制。 方法： 應(yīng)用細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)（CCK-8）法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性；分別使用葡萄糖、總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞葡萄糖攝取率、TC、FC；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平；油紅O染色法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚；真核RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞基因表達(dá)，通過蛋白免疫印跡法（Westren Blot）檢測(cè)洋參芎芍方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞過氧化物酶體增殖物激活受體-gamma（PPAR-γ）蛋白表達(dá)的影響。 "結(jié)果： 與空白組比較，洋參芎芍方在25～6 400 "mg/L 梯度范圍內(nèi)均促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活性（ P ＜0.01）；與空白組比較，模型組可增加RAW264.7巨噬細(xì)胞的葡萄糖攝取率、TC與FC濃度、TNF-α水平及脂質(zhì)積聚（ P ＜0.05），與模型組比較，洋參芎芍中劑量組、高劑量組可減少RAW264.7巨噬細(xì)胞葡萄糖攝取率、TC與FC濃度、TNF-α水平及脂質(zhì)積聚（ P ＜0.05）；RNA測(cè)序結(jié)果表明過PPAR-γ信號(hào)通路是調(diào)控巨噬細(xì)胞代謝的關(guān)鍵通路，洋參芎芍方（400 mg/mL）可降低PPAR-γ蛋白表達(dá)，Westren Blot結(jié)果顯示模型組PPAR-γ蛋白表達(dá)降低，洋參芎芍方可增加PPAR-γ蛋白表達(dá)（ P ＜0.05）。 結(jié)論： 洋參芎芍方可能通過增加PPAR-γ蛋白表達(dá)改善巨噬細(xì)胞代謝及炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 "糖尿??；動(dòng)脈粥樣硬化；益氣活血方；巨噬細(xì)胞；糖脂代謝；過氧化物酶體增殖物激活受體-gamma，PPAR-γ；實(shí)驗(yàn)研究

doi： "10.12102/j.issn.1672-1349.2023.14.007

Effeve of Yangshen Xiongshao Formula on the Metabolism "and Inflammatory Response of RAW264.7 Macrophages Based on RNA-Seq "Technology

WANG Hongqin， XU Fengqin， ZHOU Qingbing， LIU Yue， MEI Jun， LIU Xiaolin， LIU Li， ZHANG Ying

Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China

Corresponding Author "XU Fengqin， E-mail： dr. xufengqin@outlook.com; ZHANG Ying， E-mail： doctoronline@126.com

Abstract Objective： To explore the effect "of the Yangshen Xiongshao Formula on the metabolism and inflammatory response of RAW264.7 macrophages. "Methods： The Cell Proliferation and Cytotoxicity "Assay Kit（CCK-8） was used to detect the activity of RAW264.7 "macrophages;the glucose，total cholesterol（TC），and free cholesterol（FC） kits were used to detect the glucose uptake rate，TC，and FC of macrophages，respectively;enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the level of tumor necrosis factor-α（TNF-α） in RAW264.7 macrophages;Oil Red O staining was used to detect lipid accumulation in RAW264.7 macrophages;RNA sequencing（RNA-seq） technique was used to detect gene expression in RAW264.7 macrophages;Western Blot was used to observe the effect of Yangshen Xiongshao formula on RAW264.7 macrophages. "Results： Compared with the blank group，the Yangshen Xiongshao formula promoted the activity of RAW264.7 macrophages in the gradient range of 25 to 6 400 mg/L（ P ＜0.01）;In the model group increased the macrophage glucose uptake rate of RAW264.7 macrophages，TC and FC concentration，TNF-α level，and lipid accumulation increased（ P ＜0.05）.Compared with the model group，the medium-and high-dose Yangshen Xiongshao formula groups the glucose uptake rate of RAW264.7 macrophages，TC and FC concentration，TNF-α level，and lipid accumulation of RAW264.7 macrophages（ P ＜0.05）.RNA-seq results showed that the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma（PPAR -γ） signaling pathway was the key to regulating "of macrophages.Yangshen Xiongshao formula（ 400 mg/mL） could reduce the expression of PPAR-γ "mRNA.Western Blot results showed that the expression of PPAR-γ protein in the model group decreased，and Yangshen Xiongshao formula could increase the expression of PPAR-γ protein（ P ＜0.05）. "Conclusion： Yangshen Xiongshao formula may improve macrophage metabolism and inflammatory response by increasing the expression of PPAR-γ protein.

Keywords "diabetic; atherosclerosis; Yiqi fuoxue formula; macrophages; glucose and lipid metabolism; peroxisome proliferator-activated receptor-gamma， PPAR-γ;experimental study

目前2型糖尿病患病率不斷上升，影響了超過3.7億人［1］，動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病是糖尿病病人死亡和致殘的主要原因［2］，兩者都屬于代謝紊亂和慢性炎癥性疾病，其中糖尿病可加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，巨噬細(xì)胞是糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵細(xì)胞，與非糖尿病病人相比，糖尿病病人的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)有更多的巨噬細(xì)胞浸潤和更大的壞死核心［3］。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下的高血糖和胰島素可增加巨噬細(xì)胞葡萄糖攝取，導(dǎo)致糖酵解增加，引起巨噬細(xì)胞表型變化并激活促炎程序，加重動(dòng)脈粥樣硬化［4-5］，糖尿病狀態(tài)還可增加巨噬細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白的攝取并減少膽固醇外流，引起脂質(zhì)積聚，使泡沫細(xì)胞生成增加［6-8］，因此，靶向巨噬細(xì)胞代謝的藥物開發(fā)對(duì)于防治糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化具有極大潛力。

洋參芎芍方是在芎芍膠囊和心悅膠囊的基礎(chǔ)上組合而來，其主要成分包括川芎、赤芍、西洋參，其中川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，赤芍清熱涼血、活血祛瘀，西洋參益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)血生津，全方合用，共奏益氣活血養(yǎng)陰之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，洋參芎芍方可有效降低糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血清中的空腹血糖、胰島素抵抗指數(shù)、血清總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白水平［9］，但其具體機(jī)制尚不明晰，且既往對(duì)芎芍膠囊及其主要成分的研究多集中于對(duì)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚及泡沫細(xì)胞形成的影響［10］，忽略了巨噬細(xì)胞糖代謝在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用，而心悅膠囊的主成分西洋參莖葉總皂苷的研究僅限于對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的影響［11］，尚未涉及巨噬細(xì)胞。因此，本研究以巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞，以高糖、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）模擬糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病人高糖、高脂的體內(nèi)環(huán)境，探討洋參 芎芍方對(duì)巨噬細(xì)胞糖脂代謝、炎癥的影響及可能的 機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及藥物 "RAW264.7巨噬細(xì)胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司，批號(hào)為CL-0109；洋參芎芍方顆粒來自中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院顆粒藥房；羅格列酮來自MedChemExpress（MCE），批號(hào)為HY-17386。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 "DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco，批號(hào)C11885500BT）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，批號(hào)C11995500BT）；南美來源特級(jí)胎牛血清（翱擎，批號(hào)AQMV09900）；磷酸緩沖鹽溶液（PRS）（索萊寶，P1020）； DMSO（Sigma，D8418）；氧化低密度脂蛋白（廣東奕元生物，YB-002）；油紅O染料（Sigma， 批號(hào)00625）；異丙醇（北京化學(xué)試劑研究所，批號(hào)BJHXSJ004）；4%多聚甲醛（索萊寶，批號(hào)P1110）；葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒（普利萊，批號(hào)E1010-1）；TC測(cè)定試劑盒（南京建成，批號(hào)A111-1-1）；組織細(xì)胞游離膽固醇（FC）酶法測(cè)定試劑盒（普利萊，批號(hào)E1016-105）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（普利萊，批號(hào)AZ0625）；過氧化物酶體增殖物激活受體-gamma（PPAR-γ）鼠單克隆抗體（Proteintech，批號(hào)60127-1）；鼠β-actin 單克隆抗體（proteintech，批號(hào)66009-1）；一步法快速WB（HRP）試劑盒（鼠）（康為世紀(jì)，批號(hào)CW2030M）；高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（康為世紀(jì)，批號(hào)CW0049S）；MJzol animal RNA Extraction Kit （MagBeads） 試劑盒（美吉逾華公司，批號(hào)T102096）；RNAClean XP Kit（Beckman Coulter，批號(hào)：A63987）；RNase-Free DNase Set（QIAGEN，批號(hào)79254）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 "倒置相差顯微鏡（Olympus， IMT-2）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，51030999）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Biotec，synergyH1）；離心機(jī)（Ependorff，5804R）；HiSeq 2500 systerm（HiSeq，Illumina）；TapeStation（Agilent 4200，Agilent technologies Santa Clara）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) "使用含10%胎牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。RAW264.7巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后，24 h后換液，待細(xì)胞生長到80%左右融合后進(jìn)行傳代，使用細(xì)胞刮輕輕將細(xì)胞刮離培養(yǎng)瓶，離心重懸后按1∶3比例進(jìn)行傳代，傳代周期為2～3 d。

1.5 模型制備 "將巨噬細(xì)胞置于含的ox-LDL高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)以模擬糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病人高糖、高脂的環(huán)境。將生長到80%左右的細(xì)胞消化離心重懸后平均分為6組，分別為空白組、模型組、洋參芎芍低劑量組、洋參芎芍中劑量組、洋參芎芍高劑量組、羅格列酮組（20 mmol/L），待細(xì)胞生長24 h后，空白組仍使用含10%胎牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組更換為含60 mg/L ox-LDL的DMEM高糖培養(yǎng)基中，各藥物組更換為含60 mg/L ox-LDL及相應(yīng)藥物濃度的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.6 藥物制備 ""洋參芎芍方顆粒（川芎 12 g，赤芍 6 g，西洋參 6 g） 研缽研成粉末，充分混勻后，用培養(yǎng)基配成相應(yīng)濃度后用0.22 μm針孔濾器過濾后待用，現(xiàn)用現(xiàn)配。羅格列酮用DMSO配制成20 mmol/L的母液，使用前用培養(yǎng)基稀釋1 000倍至終濃度為20 μmol/L。

1.7 細(xì)胞增殖與活性試驗(yàn)（CCK8）檢測(cè)洋參芎芍方對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響 "將生長到80%左右融合的RAW264.7巨噬細(xì)胞消化離心重懸后分為7組，分別為空白組、25 mg/L 洋參芎芍組、100 mg/L洋參芎芍組、400 mg/L 洋參芎芍組、1 600 mg/L洋參芎芍組、6 400 mg/L洋參芎芍組、25 600 mg/L洋參芎芍組，并以4×104/mL的細(xì)胞密度平鋪到96孔板中，待細(xì)胞生長24 h后更換培養(yǎng)基，空白組仍使用含10%胎牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各藥物組更換為含相應(yīng)藥物濃度及10%胎牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將96孔板中原有培養(yǎng)基吸出，PBS清洗2遍，每孔加入含10% CCK8溶液的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育2 h后酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)其吸光度。

1.8 酶標(biāo)儀檢測(cè)洋參芎芍方對(duì)巨噬細(xì)胞葡萄糖攝取率、TC、FC的影響 "將融合到80%左右的RAW264.7巨噬細(xì)胞消化離心重懸后，按照模型制備的方法分組及造模，使用 T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞鋪板密度為2×105 /mL， 造模結(jié)束后，將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基吸出，PBS清洗2遍，后每組加入5 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，之后收集培養(yǎng)基上清液，按照葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀550 nm測(cè)定其吸光度，葡萄糖攝取率＝（DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基葡萄糖濃度－各組培養(yǎng)基上清液葡萄糖濃度）/ DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基葡萄糖濃度；收集各組細(xì)胞沉淀后按照TC、FC檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別使用酶標(biāo)儀510 nm、550 nm測(cè)定其吸光度；并用二喹啉甲酸 法（BCA）法測(cè)定各組蛋白濃度，使用蛋白濃度進(jìn)行 矯正。

1.9 油紅O染色法檢測(cè)洋參芎芍方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響 "將RAW264.7巨噬細(xì)胞按照模型制備的方法分 組、造模，使用24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞鋪板密度為 2×105/mL。油紅O染料用異丙醇配制成0.5%的儲(chǔ)存液，可4 ℃冰箱短暫保存。使用時(shí)儲(chǔ)存液與蒸餾水以3∶2的比例稀釋并濾紙過濾2次后配制成油紅O 工作液，使用前靜置10 min。造模結(jié)束后，將板內(nèi)培養(yǎng)基吸出，PBS清洗2遍，每孔加0.5 mL 4%多聚甲醛固定30 min，吸出多聚甲醛后，PBS清洗2遍，再每孔加入油紅O工作液0.5 mL，孵育30 min后，吸除油紅O工作液，PBS清洗5遍，后倒置顯微鏡下觀察。

1.10 ELISA法檢測(cè)洋參芎芍方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α的影響 "將融合到80%左右的RAW264.7巨噬細(xì)胞消化離心重懸后，按照模型制備的方法分組及造模，使用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞鋪板密度為2×105/mL，造模結(jié)束后收集細(xì)胞上清液，1 000 r/min離心，后根據(jù)小鼠TNF-α ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作；并收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行BCA蛋白定量，結(jié)果用蛋白濃度矯正。

1.11 RNA測(cè)序及分析 "根據(jù)不同濃度洋參芎芍方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞糖酵解、脂質(zhì)代謝及炎性因子的結(jié)果，選取藥效學(xué)最穩(wěn)定且顯著的濃度（洋參芎芍方400 mg/mL）干預(yù)RAW264.7巨噬細(xì)胞，并分為空白組、模型組、洋參芎芍方組（400 mg/mL），使用T25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，造模結(jié)束后，收集細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA并進(jìn)行純化，純化后的總RNA再按照操作說明進(jìn)行測(cè)序樣本文庫構(gòu)建，后使用Illumina NovaSeq測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序，模式為PE150。應(yīng)用Stringtie及TMM計(jì)算出FPKM值進(jìn)行基因表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)用edgeR軟件進(jìn)行樣本間差異基因分析，得出 P 值后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)矯正后得到 q 值，F(xiàn)PKM值計(jì)算差異 表達(dá)倍數(shù)（fold-change），差異基因篩選條件為 q ≤0.05 且Fold-change≥2，利用Pheatmap R包進(jìn)行熱圖繪制，并對(duì)差異表達(dá)基因通過基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析。

1.12 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)洋參芎芍方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響 "按照模型制備的方法分組及造模，用T25培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞，細(xì)胞鋪板密度為2×105/mL，收集到的細(xì)胞沉淀按照全蛋白提取試劑盒操作說明進(jìn)行后續(xù)操作，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度，后將各組蛋白濃度統(tǒng)一，加入5×上樣緩沖液（loading buffer）后進(jìn)行凝膠電泳，后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后按照一步法快速WB（HRP）試劑盒（鼠）說明書進(jìn)行后續(xù)操作，并用ECL化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像系統(tǒng)上顯色成像，應(yīng)用Image軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 "使用SPSS Statistics 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x "± s ）表示，多組間比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，兩兩組間比較采用 t 檢驗(yàn)，以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的洋參芎芍方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響 "分別用25，100，400，1 600，6 400，25 600 mg/L的洋參芎芍方干預(yù)RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h，通過CCK8法檢測(cè)洋參芎芍方對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示，與空白組比較，25，100，400，1 600，6 400 mg/L的洋參芎芍方可促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的生長（ P ＜0.01），且在25～1 600 mg/L的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖程度與藥物濃度成正比；與空白組比較，25 600 mg/L的洋參芎芍方可抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的生長（ P ＜0.01），對(duì)巨噬細(xì)胞有毒副作用。綜合考慮藥物溶解度及藥物對(duì)造模后細(xì)胞的應(yīng)激影響，最終確定將25，100，400 mg/L的洋參芎芍方干預(yù)細(xì)胞（即洋參芎芍低劑量組、中劑量組、高劑量組）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)。詳見表1。

2.2 洋參芎芍方對(duì)巨噬細(xì)胞葡萄糖攝取、TC、FC及TNF-α的影響 "細(xì)胞造模結(jié)束后，收集各組細(xì)胞上清液，通過ELISA法檢測(cè)TNF-α水平，后每組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，再收集各組細(xì)胞上清液，酶標(biāo)儀檢測(cè)葡萄糖濃度再計(jì)算每組葡萄糖攝取率；后收集各組細(xì)胞沉淀，應(yīng)用TC及FC檢測(cè)試劑盒檢測(cè)TC及FC的濃度，并測(cè)定蛋白濃度進(jìn)行矯正。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組的葡萄糖攝取率、TC及FC濃度、TNF-α水平均增高（ P ＜0.01）；與模型組比較，洋參芎芍中劑量組、高劑量組及羅格列酮組均能減少葡萄糖攝取率，降低TC、FC及TNF-α水平（ P ＜0.05），洋參芎芍低劑量 組雖然葡萄糖攝取率減少但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＝ 0.14），但其能降低TC、FC和TNF-α水平（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.3 洋參芎芍方對(duì)巨噬細(xì)胞脂滴的影響 "造模結(jié)束后，油紅O染色法觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量的影響，油紅O可將細(xì)胞內(nèi)脂滴染成紅色。與空白組比較，模型組巨噬細(xì)胞明顯紅染，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增多；與模型組比較，洋參芎芍方可減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量，細(xì)胞紅染改善，其中洋參芎芍方中、高劑量組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少（ P ＜0.05）。詳見圖1、表3。

2.4 洋參芎芍方對(duì)巨噬細(xì)胞差異mRNA表達(dá)的影響 ""RNA測(cè)序結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組共有 1 678個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因927個(gè)、下調(diào)基因751個(gè)，GO與KEGG富集分析顯示，差異基因多涉及脂肪酸合成代謝、膽固醇代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、PPAR信號(hào)等功能與通路；與模型組比較，洋參芎芍方組共有649個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因480個(gè)、下調(diào)基因169個(gè)，GO與KEGG分析顯示差異基因多涉及脂肪酸代謝、氨基酸代謝、乳糖代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、PPAR信號(hào)等功能與通路；通過對(duì)模型組與空白組的差異基因富集分析的通路和洋參芎芍方組與模型組差異基因富集分析的通路取交集且 q 值＜0.05，最終篩選到PPAR信號(hào)通路，與空白組比較，模型組差異基因富集到該通路的共有14個(gè)，其中包括5個(gè)上調(diào)基因 （plin2、angptl4、acsbg1、acadl、cpt1a）和9個(gè)下調(diào)基因（lpl、fabp4、fabp3、fads2、scd1、scd2、scd3、scd4、ppar-γ）， 與模型組比較，洋參芎芍方組差異基因富集到該通路 的共有4個(gè)，其中包括3個(gè)上調(diào)基因（scd3、lpl、ppar-γ） 和1個(gè)下調(diào)基因（cpt1c），表明洋參芎芍方可改善scd3、lpl、ppar-γ的mRNA表達(dá)，通過文獻(xiàn)確認(rèn)，最終篩選出調(diào)節(jié)糖脂代謝的關(guān)鍵因子PPAR-γ進(jìn)行后續(xù)蛋白檢測(cè)。詳見圖2、圖3及表4。

2.5 洋參芎芍方對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響 "造模結(jié)束后，收集各組細(xì)胞沉淀，提取蛋白，用Western Blot法檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ蛋白表達(dá)的 影響。與空白組比較，模型組PPAR-γ蛋白表達(dá)減少 （ P ＜0.01）；與模型組比較，洋參芎芍方各劑量組及羅 格列酮組可增加巨噬細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ蛋白的表達(dá) （ P ＜0.05）。詳見圖4、表5。

3 討 論

巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的主要途徑，巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36可與氧化/修飾的低密度脂蛋白顆粒結(jié)合，引起巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積聚，隨著ox-LDL進(jìn)入巨噬細(xì)胞，ox-LDL中的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，形成較大的脂滴，稱為泡沫細(xì)胞［12-15］，并釋放包括TNF-α在內(nèi)的多種炎性因子，吸引更多巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞進(jìn)入病變而加劇動(dòng)脈粥樣硬化過程［16］。巨噬細(xì)胞具有多樣性和可塑性，其中公認(rèn)的巨噬細(xì)胞亞型包括經(jīng)典活化的M1巨噬細(xì)胞（促炎表型）和替代活化的M2巨噬細(xì)胞（抗炎表型），在環(huán)境的影響下巨噬細(xì)胞的表型可互相切換［17］，不同表型的巨噬細(xì)胞其代謝也不相同，促炎性巨噬細(xì)胞傾向于糖酵解、脂肪酸和膽固醇合成途徑，而抗炎性巨噬細(xì)胞傾向脂肪酸氧化［18］，研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病環(huán)境下巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1促炎表型［19］，糖酵解和脂質(zhì)積聚增加，炎性因子釋放增多，靶向巨噬細(xì)胞代謝有利于改善巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和減少泡沫細(xì)胞的形成［20］。

本實(shí)驗(yàn)以巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞，探索洋參芎芍方對(duì)巨噬細(xì)胞糖脂代謝及炎癥反應(yīng)的影響及可能的機(jī)制，研究結(jié)果表明，高糖和ox-LDL可引起巨噬細(xì)胞葡萄糖攝取增加、TC和FC升高、巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴面積增大及TNF-α釋放增多，說明高糖高脂可引起巨噬細(xì)胞內(nèi)糖酵解增加，引起脂質(zhì)積聚，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成和炎性因子產(chǎn)生，而洋參芎芍方可減少巨噬細(xì)胞的葡萄糖攝取及降低TC和FC濃度，減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴面積及TNF-α濃度，表明洋參芎芍方可有效改善巨噬細(xì)胞糖脂代謝及炎癥反應(yīng)，抑制泡沫細(xì)胞形成。值得注意的是，He等［21］在觀察二甲雙胍調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞代謝對(duì)細(xì) 胞內(nèi)炎癥狀態(tài)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍改善了 ox-LDL誘導(dǎo)的抗炎表型，但增加了巨噬細(xì)胞的葡萄糖攝取，這與本研究中改善炎癥反應(yīng)伴隨葡萄糖攝取減少的發(fā)現(xiàn)不一致，這可能是本研究應(yīng)用高糖及ox-LDL造模，高糖可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取所致。

本研究中RNA測(cè)序結(jié)果顯示，高糖高脂可引起巨噬細(xì)胞內(nèi)927個(gè)基因上調(diào)、751個(gè)基因下調(diào)，KEGG與GO富集分析顯示這些差異基因可涉及脂肪酸合成代謝、膽固醇代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、PPAR信號(hào)等功能與通路，而洋參芎芍方可引起高糖高脂狀態(tài)下RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)480個(gè)基因上調(diào)、169個(gè)基因下調(diào)，KEGG與GO富集分析顯示這些差異基因涉及脂肪酸代謝、氨基酸代謝、乳糖代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、PPAR信號(hào)等功能與通路，這些功能及通路與代謝密切相關(guān)。與空白組比較，模型組RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)減少，而洋參芎芍方干預(yù)后可增加巨噬細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ mRNA和蛋白表達(dá)，推測(cè)洋參芎芍方可能通過調(diào)控PPAR-γ表達(dá)而改善巨噬細(xì)胞糖脂代謝及炎癥反應(yīng)，減少泡沫細(xì)胞形成，發(fā)揮抗糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化作用。PPAR-γ是一種配體激活 的核受體，調(diào)節(jié)糖脂代謝、炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，PPAR-γ激動(dòng)劑可抑制M1表型，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)，PPAR-γ還能促進(jìn)膽固醇外流，減少泡沫細(xì)胞的形成［22-24］，目前臨床上最常見的PPAR-γ激動(dòng)劑為噻唑烷二酮類，為糖尿病的治療藥物，但因其臨床副作用已不作為一線用藥，從天然植物中尋找PPAR-γ配體是一種高效且安全的方法，既往研究發(fā)現(xiàn)很多中草藥可激活PPAR-γ，祝驥等［25］發(fā)現(xiàn)川芎的主要成分川 芎嗪可通過增加PPAR-γ蛋白表達(dá)促進(jìn)膽固醇逆 轉(zhuǎn)運(yùn)。

綜上所述，洋參芎芍方通過增加PPAR-γ表達(dá)改善巨噬細(xì)胞糖脂代謝及炎癥反應(yīng)，減少泡沫細(xì)胞的形成，但對(duì)巨噬細(xì)胞表型改變，影響巨噬細(xì)胞代謝的PPAR-γ下游靶點(diǎn)及巨噬細(xì)胞代謝的其他方面如脂肪酸氧化等尚未進(jìn)行探討，且巨噬細(xì)胞代謝與炎癥反應(yīng)的互作有待進(jìn)一步探究，這些是未來研究的重點(diǎn)。

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（收稿日期：2023-01-29）

（本文編輯 王雅潔）