摘要 目的： 采用網(wǎng)絡藥理學、基因芯片分子對接方法探討梔子川芎膠囊防治動脈粥樣硬化（AS）的作用機制。 方法： 利用14個數(shù)據(jù)庫和基因芯片等預測梔子川芎膠囊防治AS的靶點，構建成分-治療靶點（C-T）網(wǎng)絡、治療靶點網(wǎng)絡（T-D），并計算網(wǎng)絡貢獻指數(shù)、度值、中介中心性、接近中心性和平均最短路徑篩選C-T和T-D網(wǎng)絡主要核心成分和靶點。對治療靶點進行富集分析，最后對核心成分和核心靶點做分子對接驗證。 結果： 預測得到治療靶點162個，根據(jù)網(wǎng)絡貢獻指數(shù)、度值、中介中心性、接近中心性和平均最短路徑篩選C-T和T-D網(wǎng)絡得到葉酸和槲皮素2個核心成分、13個核心靶點。富集分析顯示梔子川芎膠囊從炎癥反應、氧化應激、脂質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)代謝等多方面防治AS，并且治療靶點富集于全身多個組織器官。分子對接驗證結果表明核心成分與核心靶點間具有較強的結合力。 結論： 梔子川芎膠囊防治AS具有多成分、多靶點的特點，可以從多層次、多角度防治AS。

關鍵詞 "動脈粥樣硬化；梔子川芎膠囊；網(wǎng)絡藥理學；基因芯片；分子對接；靶點；富集分析

doi： "10.12102/j.issn.1672-1349.2023.14.001

Mechanism of Zhizi Chuanxiong Capsules Preventing and Treating Atherosclerosis Based on Network Pharmacology

WU Liqi， SHENG Song， ZHOU Qingbing， XU Fengqin

Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100093， China

Corresponding Author "XU Fengqin， E-mail： doctorxu@aliyun.com

Abstract Objective： To study the mechanism of Zhizi Chuanxiong Capsules in preventing and treating atherosclerosis（AS） using network pharmacology and gene chip molecular docking methods. "Methods： A total of 14 databases and gene chips were used to predict the targets of Zhizi Chuanxiong Capsules for the prevention and treatment of AS.Then the composition-therapeutic target（C-T） and therapeutic target network（T-D） were constructed.The network contribution index，degree，betweenness，closeness，and average shortest path were calculated to screen the main core components and targets.Enrichment analysis was performed on therapeutic targets，and finally，molecular docking verification was performed on core components and core targets. "Results： A total of 162 therapeutic targets were predicted，and the two core components of folic acid（FA） and quercetin and 13 core targets were obtained by screening the C-T and T-D networks according to the network contribution index，degree，betweenness，closeness，and average shortest path.Enrichment analysis showed that Zhizi Chuanxiong Capsules for preventing and treating AS by multiple aspects，such as inflammatory response，oxidative stress，lipid and nutrient metabolism，and the therapeutic targets were enriched in multiple tissues and organs throughout the body.Molecular docking results showed there was a strong binding force between the core components and the core target. "Conclusion： The prevention and treatment of AS with Zhizi Chuanxiong Capsules showed "the characteristics of components and multi-targets，by multi-level and multi-sngle.

Keywords "atherosclerosis; Zhizi Chuanxiong Capsule; network pharmacology; "gene chip; molecular docking; target; enrichment analysis

動脈粥樣硬化（AS）是動脈硬化血管病中最常見、最重要的一種，是心腦血管疾病共同的病理基礎。目前中醫(yī)學認為“瘀”“毒”是AS的核心病機，尤其在AS 易損斑塊破裂進而引發(fā)急性心血管事件的過程中發(fā)揮主要作用［1］。研究表明，與傳統(tǒng)活血化瘀治療AS相比， 活血化瘀與清熱解毒藥物配伍組合具有更強的抗AS作用［2］，在此基礎上中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院徐鳳芹教授團隊根據(jù)多年臨床經(jīng)驗設計了活血解毒組合梔子川芎膠囊防治AS。課題組前期研究表明低劑量和高劑量梔子川芎膠囊均能減少血管壁脂質(zhì)沉積和AS斑塊形成［3］。但是由于梔子川芎膠囊成分復雜性和藥理作用多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑的特點，采用既往“單成分-單靶點”的研究思路來探索梔子川芎膠囊干預AS的作用機制難以從整體上解釋梔子川芎膠囊抗AS的物質(zhì)基礎。

網(wǎng)絡藥理學是從系統(tǒng)水平研究藥物與人體相互作用規(guī)律和機制的一門新興學科，因其整體性和系統(tǒng)性的特點已被廣泛應用于復方活性成分篩選、治療靶點預測及作用機制研究［4-6］。因此，本研究借助網(wǎng)絡藥理學方法，結合基因芯片、分子對接等多項生物信息學技術試圖從整體角度探究梔子川芎膠囊干預AS的作用機制，為梔子川芎膠囊的系統(tǒng)深入研究提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 復方成分篩選 "本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫分析平臺 （TCMSP）v2014，http：/tcmspw.com/news.php［7］檢 索 梔子、川芎的化學成分，然后以口服生物利用度（OB）≥ 30%，類藥性（DL）≥0.18和藥物半衰期（HL）≥4為條件篩選活性成分，并結合相關文獻納入不符合篩選條件但是經(jīng)過驗證抗AS作用顯著的中藥成分，如川芎嗪、梔子苷等［8-9］ ，檢索日期截至2020年11月1日。

1.2 活性成分靶點篩選 "將活性化合物名稱分別上傳至TCMSP和PubChem得到各化合物的mol2文件、SMILES和InChI，將其導入PharmMapper（v2017）［10］、 SwissTargetPrediction（v2019） ［11］、DrugBank（v5.0）［12］、 SEA（v2007）［13］和Batman-TCM（v2020）［14］等5個數(shù)據(jù)庫，根據(jù)反向藥效基團、化合物分子結構相似性和成分-靶點互作相似性等3種原理預測成分靶點。同時在上述5個網(wǎng)站中分別以Norm Fit score≥0.9、 Probability≥0.7、Similarity threshold≥0.9、 P ＜0.05、Score cutoff≥20 作為篩選條件保證靶點預測的準確性。最后將從5個數(shù)據(jù)庫中得到的成分靶點匯總去重后導入UniPort中校正為gene symbol，檢索日期截至2020年11月1日。

1.3 疾病靶點篩選 "以atherosclerosis、arteriosclerosis、atherosis和atherosclerotic arterial disease作為檢索詞檢索治療靶標數(shù)據(jù)庫（TTD，v2020）［15］、DrugBank（v5.0）［12］、OMIM（v2020 Oct） ［16］、GAD（v2014） ［17］、PharmGKB（v2018） ［18］、GeneCards（v5.2）［19］、NCBI、DisGeNET（v2019）［20］、HAGR（v2018）［21］等9個數(shù)據(jù)庫。同時在 GEO中以相同關鍵詞檢索得到AS相關的基因芯片 1個。GSE28829是一個由荷蘭Maastricht大學血管病理中心提供的包括13例早期和16例晚期頸動脈AS斑塊尸體活檢標本的基因表達數(shù)據(jù)集［22］。本研究使用Perl將探針I(yè)D批量轉(zhuǎn)換為Gene symbol，然后應用R 4.0.0的impute（v3.1.3）包和limma（v4.1） 包來插補缺失值、歸一化處理和確定差異基因，差異基因閾值為 P ＜0.05且｜log2 fold change｜≥1。為保證預測準確性將上述10個來源的靶點兩兩取交集，篩選至少出現(xiàn)在2個數(shù)據(jù)源中的靶點作為疾病靶點，然后將復方靶點與疾病靶點再次取交集最終得到治療靶點（檢索日期截至2020年11月1日）。

1.4 C-T網(wǎng)絡構建及分析 "將活性成分、治療靶點及活性成分-靶點關系導入Cytoscape 3.2.1［23］構建C-T網(wǎng)絡，本研究引入了貢獻指數(shù)（contribution index， CI）評估化合物對C-T網(wǎng)絡的貢獻程度，CI計算基于網(wǎng)絡效能（network based efficacy，NE）和PubMed文獻數(shù)，如果排名前 n 個化合物的CI之和≥85%，則這 n 個化合物是C-T網(wǎng)絡中貢獻度最大的核心成分［24］，CI計算公式如下：

公式①中， n 是與化合物 j 連接的靶點總數(shù)， d （ i ）是與化合物 j 連接的靶點 i 的度值（degree）。公式②中， "m 是網(wǎng)絡中的化合物總數(shù)， c （ j ）是化合物 j 治療AS的相關PubMed文獻總數(shù)，檢索策略在標題或摘要中以atherosclerosis、arteriosclerosis、atherosis、atherosclerotic arterial disease和網(wǎng)絡中化合物英文名稱及常用別稱作為關鍵詞聯(lián)合檢索PubMed中建庫至2020年11月1日的文獻。

1.5 T-D網(wǎng)絡構建及分析 "將治療靶點導入STRING［25］，其中“minimum "required interaction score”設定為 “medium confidence "（＞0.400）”，“organism”限定為“homo sapiens”，用治療靶點及靶點間的蛋白互作關系導入Cytoscape構建T-D網(wǎng)絡。使用軟件Network Analyzer模塊計算網(wǎng)絡中度、中介中心性、接近中心性和平均最短路徑評估T-D網(wǎng)絡中節(jié)點的重要性，網(wǎng)絡中節(jié)點的重要性與度、中介中心性、接近中心性值成正比，與平均最短路徑成反比，篩選網(wǎng)絡中同時大于度、中介中心性、接近中心 性均值且小于平均最短路徑均值的節(jié)點定義為核心 靶點。

1.6 富集分析 "應用R的 org.Hs.eg.db（v3.13.0）、clusterProfiler（v4.0.0）、enrichplot（v1.13.0）包和ggplot2（v3.3.3）包進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析和結果可視化，根據(jù)adjusted "P ＜0.05篩選GO和KEGG富集條目。使用TissueEnrich （https：//tissue.gdcb.iastate.edu/，v2018）進行組織富集分析和可視化［26］，同樣根據(jù)adjusted "P ＜0.05篩選顯著富集的組織器官。

1.7 分子對接 "在TCMSP中下載核心成分的mol2文件，同時在PDB中下載核心靶點的pdb文件。對接前使用Discovery Studio （v2019）對所有靶點蛋白進行去水、加氫、刪除原始配體等預處理，刪除的配體另存為mol2格式文件。分子對接應用GEMDOCK（v2.1）軟件［27］，軟件采用standard docking對接，其余對接參數(shù)均為默認。結合親和力由結合自由能決定的，結合能（負值）的絕對值越大，結合構象越穩(wěn)定。當核心成分和核心靶點的結合能強于核心靶點原配小分子和核心靶點的結合能時，則核心成分與核心治療靶點結合親和力較好。最后使用R的pheatmap包（v1.0.12）繪制對接能量值熱圖，如果pdb中下載的靶點蛋白自帶的是多個配體小分子（ligand group），則把多個配體小分子分別與靶點蛋白對接計算能量值然后取平均值繪制熱圖［6］。

1.8 研究流程

從多項生物信息學技術深入研究梔子川芎膠囊干預AS的作用。詳見圖1。

2 結 果

2.1 復方成分篩選 "在TCMSP中以OB≥30%，DL≥0.18和HL≥4為條件篩選，并結合文獻得到化合物18個，其中梔子成分12個，川芎成分7個，其中mandenol為兩藥共有成分。梔子川芎膠囊活性成分見表1。

2.2 活性成分靶點篩選 "5個數(shù)據(jù)庫篩選到456個成分靶點，包括川芎靶點172個，梔子靶點328個。

2.3 疾病靶點篩選 "將疾病靶點兩兩取交集得到AS靶點1 991個，成分靶點與AS靶點再取交集共得梔子川芎膠囊治療AS靶點162個，其中川芎61個，梔子129個，共有靶點14個，這表明梔子川芎膠囊在防治AS過程中既有各自的特異性靶點單獨發(fā)揮作用，又有共同靶點協(xié)同發(fā)揮作用，兩藥可相須相使防治AS。

2.4 C-T網(wǎng)絡構建及分析 "C-T網(wǎng)絡刪除孤立節(jié)點及連邊后有節(jié)點176個，代表14個化合物成分，其中川芎5個，梔子8個，共有成分1個和治療靶點162個；263條邊代表263個成分-靶點關系（見圖2），圖中紅色圓圈代表梔子成分，藍色圓圈代表兩藥共有成分，黃色圓圈代表川芎成分，紫色方塊代表治療靶點，線代表成分-靶點關系。根據(jù)上述公式計算C-T網(wǎng)絡中每個化合物的CI，結果表明葉酸（FA）和槲皮素（quercetin）2個化合物的CI之和≥ 85%，是網(wǎng)絡中貢獻度最大的核心成分。詳見圖3。

2.5 T-D網(wǎng)絡構建及分析 "刪除孤立節(jié)點后T-D網(wǎng)絡中有161個節(jié)點和 1 508條邊（見圖4），在網(wǎng)絡中選取滿足同時度 "值＞33.431%、接近中心性＞0.525、中介中心性均值＞ 0.015和小于平均最短路徑均值（1.916）的節(jié)點定義為 核心靶點，共篩選得到胰島素（INS）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、表皮生長因子受體（EGFR）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、表皮生長因子（EGF）、雌激素受體1（ESR1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-10（IL-10）、基質(zhì)金屬 蛋白酶-9（MMP9）、人固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（SREBF1）、 熱休克蛋白90α家族A類成員1（HSP90AA1） 這13個核心靶點（見表2、圖5）。進一步提取13個核心靶點及其相鄰節(jié)點構建核心靶點網(wǎng)絡得到137個節(jié)點和1 397個邊（見圖6），該13個核心靶點與原始T-D網(wǎng)絡中74.5%（137/161）的靶點和92.6%（1 397/1 508）的邊有關聯(lián)，紅色、黃色、綠色分別代表高度值、中等度值和低度值的節(jié)點。因此，T-D網(wǎng)絡符合無標度網(wǎng)絡。

2.6 富集分析 "根據(jù) "P ＜0.05確定2 195個GO富集條目，其中細胞成分（CC）有40個，主要關于RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合物、膜筏、微疇膜等；分子功能（MF）結146個，主要包括核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性等；生物過程（BP）條目200 9個，主要涉及類固醇代謝、炎癥反應調(diào)控、維生素代謝、活性氧代謝和調(diào)控、脂質(zhì)代謝調(diào)控、對營養(yǎng)水平的反應等（見圖7），圖中條帶長度對應該條目中的富集基因數(shù)量，條帶顏色由紅到藍代表條目富集的 P 逐漸增大。以 P ＜0.05為條件篩選得到115條通路，包括磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）通路、低氧誘導因子-1（HIF-1）通路、內(nèi)分泌抵抗、甲狀腺激素信號通路、胰島素抵抗、甲狀旁腺激素合成分泌和作用、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、白細胞介素17（IL-17）信號通路、輔助性T 細胞17（Th17）細胞分化和脂肪細胞脂肪分解的調(diào)節(jié)等 （見圖8），圖中橫坐標代表通路富集基因數(shù)量占通路中所有基因的比例，圓圈面積大小與通路富集基因數(shù)量成正比，圓圈顏色由紅到藍代表通路富集的adjusted "P 值逐漸增大。組織富集分析顯示 162個治療靶點富集于肝臟等多個組織（見圖9）。

2.7 分子對接 "對篩選出的2個核心成分葉酸、槲皮素和11個核心靶點INS、AKT1、SRC、EGFR、PTGS2、ESR1、PPARG、IL1B、MMP9、SREBF1、 HSP90AA1（EGF和IL-10未在PDB找到相應自帶配體的蛋白結構）進行分子對接。對接結果顯示核心成分與PPARG、PTGS2、SREBF、INS、AKT1、EGFR1的對接能量強于原配體和靶點間的能量值，核心成分與其余靶點的對接能量值和原配體和靶點間的能量相比近似或略低，因此，可以認為核心成分和核心靶點間對接較好，具有較強的結合力。詳見圖10、圖11。

3 討 論

AS是心腦血管疾病共同的病理基礎，近年來的研究證實AS是一個多因素參與、多基因異常調(diào)控的復雜病理過程，包括炎癥、脂質(zhì)浸潤、血栓形成、細胞凋亡、膽固醇逆向轉(zhuǎn)運等，因此，通過某個化合物和某個靶點防治AS往往難以取得理想的臨床療效。中藥復方中含有多種活性成分，具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，是治療AS這類由多種機制共同介導的慢性疾病的理想藥物。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學角度探究了梔子川芎膠囊治療AS的潛在的分子機制和靶點通路。C-T網(wǎng)絡及CI結果顯示葉酸和槲皮素是網(wǎng)絡中的核心成分，在梔子川芎膠囊抗AS中發(fā)揮主要作用。T-D網(wǎng)絡分析顯示，INS、AKT1、SRC、EGFR、PTGS2、EGF、ESR1、PPARG、IL1B、IL10、MMP9、SREBF1、HSP90AA1這13個核心靶點在梔子川芎膠囊治療AS中尤為重要。通過進一步提取13個核心靶點及其相鄰節(jié)點構建核心靶點網(wǎng)絡，可知T-D網(wǎng)絡符合無標度網(wǎng)絡，即網(wǎng)絡中少數(shù)的節(jié)點擁有大量的連接，說明它們對保證T-D網(wǎng)絡的穩(wěn)定起著至關重要的作用，可見這13個核心靶點是梔子川芎膠囊治療AS的潛在靶點。既往研究證實 INS［28］、AKT1 ［29］、SRC ［30］、 EGFR ［31］、PTGS2 ［32］、EGF［33］、 ESR1 ［34］、PPARG ［35］、IL1B ［36］、IL10 ［37］、MMP9 ［38］、SREBF1 ［39］、HSP90AA1［40］ 和AS密切相關，證實了本研究靶點預測的準確性。GO與KEGG分析顯示，梔子川芎膠囊通過干預類固醇代謝、炎癥反應、維生素代謝、活性氧代謝、脂質(zhì)代謝、對營養(yǎng)水平反應等，進而調(diào)控PI3K-AKT通路、HIF-1通路、內(nèi)分泌抵抗、胰島素抵抗、IL-17信號通路、Th17細胞分化和脂肪細胞脂肪分解調(diào)節(jié)等多個信號通路，從炎癥反應、氧化應激、脂質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)代謝等多方面干預AS，發(fā)揮其治療AS的作用。GO、KEGG分析表明，梔子川芎膠囊活性成分的作用靶點分布于不同的生物學功能和通路，多成分、多靶點整體相互調(diào)節(jié)是其防治AS的作用機制。組織富集分析顯示，治療靶點富集于肝臟等多個組織和器官，說明梔子川芎膠囊防治AS是對全身多個組織和器官綜合整體調(diào)控的結果。分子對接表明葉酸和槲皮素與核心靶點間有較強的結合力，也進一步間接證明了網(wǎng)絡藥理學預測的準確性［41-42］。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學等方法分析和探索了梔子川芎膠囊防治AS的潛在物質(zhì)基礎與靶點通路，為后續(xù)機制研究提供了理論基礎。但是需要注意的是，網(wǎng)絡藥理學研究尚存在一定局限性，如忽視了藥物劑量、中藥炮制、個體化差異帶來的影響，因此，仍需進一步試驗結果的驗證與支持。

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（收稿日期：2022-10-08 ）

（本文編輯 王雅潔）