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        鞣花酸灌胃對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥心功能不全的影響

        2023-12-29 00:00:00劉江王鳳媛李彬楊雙吳浩亮唐艷紅王晞黃從新
        心血管病學(xué)進(jìn)展 2023年2期

        【摘要】目的"探究鞣花酸(EA)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥所致心功能不全保護(hù)作用的潛在機(jī)制。方法"將32只C57BL/6小鼠分為4組:對(duì)照Control(Con)組(n=8),LPS組(n=8),20EA(20 mg/kg)組(n=8),40EA(40 mg/kg)組(n=8)。20EA及40EA組用EA灌胃14 d后腹腔注射10 mg/kg LPS,Con組使用等量生理鹽水灌胃。超聲心動(dòng)圖評(píng)測(cè)心功能,分析射血分?jǐn)?shù)及短軸縮短率,生化法檢測(cè)超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脫氫酶(LDH)血清水平。結(jié)果"超聲心動(dòng)圖顯示EA以劑量依賴的方式改善LPS誘導(dǎo)的心臟的射血分?jǐn)?shù)及短軸縮短率。生化檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,LPS組SOD血清水平下降,MDA、CK-MB及LDH血清水平升高,EA可呈劑量依賴性上調(diào)SOD,下調(diào)MDA、CK-MB及LDH的血清水平。蛋白免疫印跡顯示EA預(yù)處理可上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)以及血紅素加氧酶1(HO-1)的水平。結(jié)論"EA可有效改善LPS誘導(dǎo)的心功能不全,可能是通過減輕氧化應(yīng)激水平及上調(diào)Nrf2/HO-1水平發(fā)揮作用。

        【關(guān)鍵詞】鞣花酸;膿毒癥;氧化應(yīng)激

        【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2023.02.019

        【Abstract】Objective"To investigate the probable mechanism of ellagic acid(EA)’s preventive effect on cardiac insufficiency caused by lipopolysaccharide (LPS)-induced sepsis.Methods"32 C57BL/6 mice were placed into four groups:Control(Con,n=8),LPS(n=8),20EA(n=8),and 40EA(n=8).20EA and 40EA groups were administered EA for 14 days,followed by intraperitoneal injections of 10 mg/kg LPS.The Con group was given the equivalent saline by gastric gavage.The heart function was evaluated using echocardiography,ejection fraction and fractional shortening were assessed,and serum levels of superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA),creatine kinase isoenzyme(CK-MB),and lactate dehydrogenase(LDH) were tested using a biochemical approach.Results"Echocardiography showed that EA improved LPS-induced cardiac ejection fraction and fractional shortening in a dose-dependent manner.Biochemical assays showed that compared with the control group, levels of SOD decreased and serum levels of MDA,CK-MB and LDH increased in the LPS group.EA improved SOD and decreased the serum levels of MDA,CK-MB and LDH in a dose-dependent way.The western blot results indicate that EA pretreatment could increase nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2) and hemeoxygenase-1(HO-1) levels.Conclusion"EA can significantly ameliorate the cardiac dysfunction generated by LPS,which may play a role in reducing the level of oxidative stress and elevating the levels of Nrf2/HO-1.

        【Key words】Ellagic acid;Sepsis;Oxidative stress

        膿毒癥表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)的炎癥,可導(dǎo)致多器官的損傷甚至衰竭,因此在臨床上具有極高的死亡率[1]。膿毒癥發(fā)生時(shí),組織和循環(huán)中的炎癥細(xì)胞因子顯著升高,炎癥因子產(chǎn)物可在心肌細(xì)胞周圍產(chǎn)生大量活性氧和超氧陰離子繼而導(dǎo)致組織的損傷[2]。心臟功能障礙是膿毒癥的致命并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為收縮功能下降。盡管支持治療技術(shù)手段日益成熟,其死亡率仍可達(dá)70%[3],探索膿毒癥的發(fā)病機(jī)制及新的治療方案愈發(fā)重要。鞣花酸(ellagic acid,EA)是一種植物來源的多酚,作為一種有效的過氧亞硝酸鹽清除劑,EA具有強(qiáng)大的抗炎抗氧化作用[4]。之前的研究表明,EA可以通過抑制氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡水平預(yù)防兔的動(dòng)脈粥樣硬化[5],在阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷小鼠模型中,EA灌胃預(yù)處理可有效減輕氧化應(yīng)激水平從而保護(hù)心臟[6]。盡管如此,EA在膿毒癥中的作用尚不明確。本研究旨在探索EA在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥心肌炎中的作用,并進(jìn)一步探討可能的機(jī)制。

        1"材料與方法

        1.1"實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        本研究選用32只體重22~25 g成年無特定病原體級(jí)C57BL/6小鼠(6~8周齡),所有動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫(24±2)℃并自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分為4組,對(duì)照Control(Con)組(n=8),LPS組(n=8),20 mg/kg EA(20EA)組(n=8),40 mg/kg EA(40EA)組(n=8)。Con組腹腔注射生理鹽水,LPS組注射10 mg/kg LPS,20EA及40EA組予EA及LPS處理。

        1.2"實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        EA灌胃,每天1次,連續(xù)14 d,第14天灌胃1 h后,腹腔注射生理鹽水或LPS(10 mg/kg),小鼠毛發(fā)豎立,眼周出現(xiàn)膿性分泌物則為造模成功。動(dòng)物的治療遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院發(fā)布的《保護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)原則》。

        1.3"超聲心動(dòng)圖檢查

        LPS注射12 h后用3%異氟醚麻醉小鼠,取仰臥位后超聲心動(dòng)圖M型平面圖像,測(cè)量的心功能指標(biāo)包括射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)和短軸縮短率(fractional shortening,F(xiàn)S)。

        1.4"血清生化檢測(cè)

        注射LPS或生理鹽水12 h后,從小鼠眼球取血,靜置1 h后,以3 500 r/min的速度離心。收集上清液儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)血清水平按照制造商(武漢賽維爾)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

        1.5"蛋白免疫印跡

        小鼠處死后取心臟儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。隨后稱取30 g心臟組織置于1.5 mL離心管中,加入蛋白裂解液提取總蛋白,使用BCA蛋白分析試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)蛋白濃度。測(cè)量后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳法分離每個(gè)樣品的等量蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)米利波爾)。PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,隨后將膜與特異性一抗于4 ℃冰箱孵育過夜。第2天將一抗孵育的膜用Tris緩沖液加Tween 20液清洗5 min后與二抗在室溫下孵育2 h。最后,使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)孵育的膜進(jìn)行蛋白可視化操作,并使用Image J軟件對(duì)蛋白定量。

        1.6"HE染色

        快速獲取心臟組織,用生理鹽水洗凈并擦干,置于4%多聚甲醛溶液中固定。將固定的組織用石蠟包埋,然后切成5 μm厚切片,進(jìn)行HE染色并觀察染色區(qū)域心肌組織結(jié)構(gòu)與炎癥浸潤(rùn)變化。

        1.7"數(shù)據(jù)分析

        采用GraphPad Prism 9.0軟件分析和處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示,采用單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù),兩組間數(shù)據(jù)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)確定,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2"結(jié)果

        2.1"EA灌胃對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌功能障礙具有改善作用

        3%異氟醚輕度麻醉小鼠后使用超聲心動(dòng)圖觀察左心功能。表1數(shù)據(jù)顯示,與接受生理鹽水灌胃的Con組相比,注射LPS導(dǎo)致顯著的左心室收縮功能障礙,EF和FS顯著降低。EA預(yù)處理呈劑量依賴方式顯著降低LPS對(duì)EF的影響(圖1)。提示EA可顯著改善LPS誘導(dǎo)的心肌收縮功能障礙。

        2.2"EA灌胃對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌形態(tài)變化的影響

        先前的實(shí)驗(yàn)表明,膿毒癥心肌炎可使心肌結(jié)構(gòu)改變,如心室擴(kuò)張。本研究觀察了EA對(duì)LPS誘導(dǎo)的心功能不全的改善作用。結(jié)果表明,Con組心肌纖維結(jié)構(gòu)正常,橫紋清晰,未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。使用LPS處理的小鼠可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及心肌纖維間隙變寬(圖2),而使用EA預(yù)處理的小鼠心肌炎癥細(xì)胞明顯呈劑量依賴性減少。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EA預(yù)處理可有效改善LPS誘導(dǎo)的心肌結(jié)構(gòu)改變。

        2.3"EA對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠血清SOD、MDA、CK-MB和LDH變化的影響

        為了研究EA對(duì)LPS導(dǎo)致心肌損傷的變化,本研究檢測(cè)了血清SOD和MDA的水平,同時(shí)也檢測(cè)了血清中心肌損傷標(biāo)志物CK-MB及LDH的表達(dá)。表2展示了Con組與LPS組炎癥及氧化應(yīng)激的比較數(shù)據(jù),與對(duì)照組相比,LPS組的SOD顯著降低,MDA、CK-MB和LDH顯著升高,而EA灌胃預(yù)處理可呈劑量依賴性上調(diào)SOD,下調(diào)MDA、CK-MB和LDH的血清水平(圖3)。

        2.4"EA預(yù)處理可上調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥心肌炎Nrf2蛋白水平

        為了進(jìn)一步確定LPS和EA對(duì)膿毒癥心肌炎氧化應(yīng)激水平的可能機(jī)制,本研究檢測(cè)了抗氧化因子核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2)和血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)的蛋白表達(dá)水平。圖4顯示 ,相對(duì)于Con組,LPS處理可引起明顯的Nrf2及HO-1降低,而EA預(yù)處理可呈劑量依賴方式上調(diào)Nrf2及HO-1。3"討論

        本實(shí)驗(yàn)表明,LPS可造成小鼠的心肌損傷,表現(xiàn)為SOD水平的降低以及MDA、CK-MB及LDH水平的升高,EA的灌胃預(yù)處理可顯著改善LPS所致心肌損傷。超聲心動(dòng)圖及HE染色結(jié)果表明,EA灌胃可以減輕LPS誘導(dǎo)的膿毒癥心功能不全,這可能是通過促進(jìn)Nrf2/HO-1的表達(dá)從而抑制線粒體氧化應(yīng)激發(fā)揮作用的(見圖5)。過去的研究[7-8]已證實(shí)EA作為膳食多酚,具有抗氧化、抗炎以及保護(hù)神經(jīng)作用。LPS誘發(fā)的膿毒癥導(dǎo)致心肌損傷主要是通過誘導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激。

        有研究[9-10]表明,LPS會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子,炎癥因子在激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)損傷心肌的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致心臟整體的收縮功能障礙。富含EA的石榴汁可以通過抑制炎癥因子從而改善非酒精性脂肪肝[11]。本次研究的HE染色及超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示,EA能改善LPS誘導(dǎo)的心肌纖維結(jié)構(gòu)損傷。生理狀態(tài)下,機(jī)體自身的抗氧化系統(tǒng)可以消除活性氧,以避免過度氧化應(yīng)激[12-14],EA的抗氧化應(yīng)激作用主要?dú)w因于其結(jié)構(gòu)上的4個(gè)羥基[15]。核因子Nrf2可以編碼抗氧化抗炎蛋白發(fā)揮保護(hù)因子的作用,HO-1是Nrf2的下游,可以防止氧化損傷及炎癥的發(fā)生發(fā)展[16]。既往的研究[17]發(fā)現(xiàn),EA可以通過上調(diào)Nrf2的表達(dá)減輕糖尿病大鼠的生殖毒性及功能障礙,也可減輕百草枯導(dǎo)致的仔豬氧化應(yīng)激及腸道損傷[18]。在神經(jīng)保護(hù)方面,EA上調(diào)的Nrf2可保護(hù)鏈脲佐菌素所致的大鼠海馬區(qū)損傷和記憶喪失[19],在魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中也具有保護(hù)作用[20]。在心血管疾病中,EA可升高Nrf2和HO-1水平[21],同時(shí)改善谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性發(fā)揮心肌保護(hù)作用[22],對(duì)抗異丙腎上腺素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到,EA的預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)了LPS導(dǎo)致的Nrf2及HO-1的降低,提示EA可能是通過上調(diào)Nrf2/HO-1來減輕膿毒癥小鼠的心肌損傷。綜上所述,EA是一種有效的心臟保護(hù)劑,可以減輕LPS誘導(dǎo)的心肌損傷可能是通過上調(diào)Nrf2/HO-1從而抑制線粒體氧化損傷而發(fā)揮作用。

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