【摘要】 目的：研究FAM136A（family with sequence similarity 136，member A gene）在胃癌進(jìn)展中的調(diào)控作用。方法：通過生信分析篩選出FAM136A在胃癌中轉(zhuǎn)錄水平，通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)分析FAM136A在胃癌組織中表達(dá)特點及臨床病理意義，通過侵襲實驗（Transwell實驗）、細(xì)胞活力檢測實驗（MTT實驗）檢測FAM136A對胃癌細(xì)胞遷移、侵襲、增殖能力的影響。結(jié)果：FAM136A在胃癌中轉(zhuǎn)錄水平明顯高于癌旁組織，F(xiàn)AM136A在胃癌組織中高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，病理分期Ⅱ、Ⅲ期、T分期T2～4、N分期1～3期的高表達(dá)比例高于病理分期Ⅰ期、T分期T1及N分期0期（Plt;0.01）。FAM136A增強胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和增殖能力。FAM136A增強胃癌細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)論：FAM136A可通過調(diào)控EMT增強胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。FAM136A可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)胃癌增殖能力。

【關(guān)鍵詞】 FAM136A 胃癌 腫瘤進(jìn)展

The Molecular Mechanism of FAM136A Regulating the Progression of Stomach Carcinoma/FU Xingwei， LI Xiaobo， GENG Feixiang， BO Wei， WANG Xuguang， ZHANG Zhong， ZHANG Min. //Medical Innovation of China， 2023， 20（18）： 0-061

[Abstract] Objective： To study the regulation of FAM136A （family with sequence similarity 136， member A gene） in gastric cancer progression. Method： Bioinformatics analysis was used to screen the transcriptional level of FAM136A in gastric cancer， immunohistochemical staining was used to analyze the expression characteristics of FAM136A in gastric cancer tissues and clinicopathological significance. Transwell and MTT assays were used to detect the effects of FAM136A on the migration， invasion and proliferation of gastric cancer cells. Result： The transcription level of FAM136A in gastric cancer was significantly higher than that in adjacent gastric cancer， FAM136A was highly expressed in gastric cancer tissues， mainly located in the cytoplasm， the proportion of high expression in pathological stages Ⅱ， Ⅲ， T stage T2-4， and N stage 1-3 were higher than those in pathological stages Ⅰ， T stage T1， and N stage 0 （Plt;0.01）. FAM136A enhanced gastric cancer cell migration， invasion and proliferation. FAM136A enhanced EMT and the expression of cell cycle-related proteins in gastric cancer cells. Conclusion： FAM136A can enhance the migration and invasion ability of gastric cancer cells by regulating EMT. FAM136A can promote gastric cancer proliferation ability by regulating cell cycle.

[Key words] FAM136A Stomach carcinoma Tumor progression

First-author's address： Department of Pathology， Basic Medical College， Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.18.014

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在常見的惡性腫瘤中處于第四位[1]。包括中國在內(nèi)的東亞地區(qū)胃癌發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)，遼寧省亦是胃癌高發(fā)地區(qū)，為此，研究胃癌發(fā)病具體分子機制將有助于胃癌的診療，進(jìn)而提高人口健康質(zhì)量。

FAM136A的基因定位于染色體2p13.3，編碼蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。據(jù)報道，F(xiàn)AM136A蛋白在人內(nèi)耳及大鼠壺腹神經(jīng)感覺上皮中表達(dá)[2-5]，美尼爾綜合征部分患者FAM136A基因發(fā)生突變，提示FAM136A可能是早期內(nèi)耳發(fā)育的重要蛋白[5]。此外FAM136A基因突變亦與重癥肌無力中眼肌的麻痹相關(guān)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，沉默F(xiàn)AM136A表達(dá)可抑制肺癌增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，并伴有CDK4/6蛋白表達(dá)水平下降[7]，F(xiàn)AM136A對胃癌進(jìn)展的調(diào)控作用目前尚無報道，需進(jìn)一步深入研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月-2021年5月于沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除后并經(jīng)病理診斷確診的90例胃腺癌及癌旁胃組織標(biāo)本，其中病理學(xué)分級Ⅰ級36例，Ⅱ、Ⅲ級54例，出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。本實驗的設(shè)計經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑 人胃癌細(xì)胞株HGC-27及AGS購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI1640、DMEM-F12培養(yǎng)液（以色列Biological Industries公司），MEM培養(yǎng)液（以色列Biological Industries公司），胎牛血清（FBS）培養(yǎng)液（以色列Biological Industries公司）Lipofectamine TM3000轉(zhuǎn)染試劑（美國ThermoScientific公司），洗滌緩沖液（TBST）、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（上海碧云天公司），F(xiàn)AM136A過表達(dá)載體、Pcmv6-Entry（無錫傲銳東源生物科技生物有限公司），F(xiàn)AM136A siRNA（蘇州吉瑪基因公司），F(xiàn)AM136A多克隆抗體（美國abnova公司；Western Blot：1∶500；免疫組織化學(xué)染色：1∶800），單克隆抗體E-鈣粘蛋白（anti-E-cadherin）、N-鈣粘蛋白（anti-N-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（anti-MMP2）、Snail同源物1重組蛋白（anti-Snail）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白（anti-Slug）、網(wǎng)絡(luò)緊密連接蛋白1（anti-Claudin-1）、細(xì)胞周期蛋白D1（anti-cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白B1（anti-cyclin B1）、磷酸化Rb蛋白（anti-p-Rb）、細(xì)胞周期蛋白A2（anti-cyclin A2）（美國Cell Signaling Technology公司；1∶1 000）。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞鋪板，每管加入MEM培養(yǎng)液250 μL，轉(zhuǎn)染試劑3.75 μL，質(zhì)粒10 μL，孵育10 min，均勻滴加到6孔板中，搖晃均勻，靜置10 min，放入孵箱中培養(yǎng)6 h，換液，過表達(dá)組及對應(yīng)的對照組轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗或轉(zhuǎn)染48 h后提蛋白。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot） 加入裂解液提取蛋白，配SDS-PAGE膠，進(jìn)行電泳，按marker位置切膠，剪PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后TBST慢洗3 min，加封閉液，室溫孵育2 h，將PVDF膜置于一抗中，4 ℃冰箱過夜孵育，將PVDF膜放入對應(yīng)二抗中室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，配ECL發(fā)光液，均勻滴加在PVDF膜上，進(jìn)行顯影，用Image J分析條帶灰度值。

1.2.4 侵襲實驗（Transwell實驗） 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，配置成2×105個細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，遷移實驗：將200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室中，侵襲實驗：所用物品低溫處理，每個小室底部加入100 μL稀釋的基質(zhì)膠，放入孵箱孵育1 h，吸出培養(yǎng)液，每個小室中加入200 μL細(xì)胞懸液，在小室下方即孔板內(nèi)加入800 μL含10% FBS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)22 h后，輕輕擦拭小室，將小室放入4%多聚甲醛中固定5 min，將小室放入結(jié)晶紫染液中染色5 min，顯微鏡下觀察拍照，計數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞活力檢測實驗（MTT實驗） 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，以3×103個/100 μL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，另設(shè)相同數(shù)量無細(xì)胞對照孔，共鋪5板。每日取一培養(yǎng)板，棄原培養(yǎng)基，避光操作，每孔加入120 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸走培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm的OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6 免疫組織化學(xué)方法染色 將切片用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，過氧化物酶阻斷劑，F(xiàn)AM136A一抗（1∶800）4 ℃孵育過夜，Evision A液、B液37 ℃各孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察。

結(jié)果判定：在每張免疫組織化學(xué)染色切片中，隨機選取10個視野（400×），并隨機計數(shù)200個細(xì)胞，進(jìn)行判定，（1）染色強度：0為沒有陽性染色，1為淺黃色，2為棕色，3為棕褐色；（2）陽性染色范圍：陽性染色細(xì)胞比例lt;10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，gt;75%為4分。兩項評分相乘得最終評分（0～12分），得分≤5分為低表達(dá)，gt;5分為高表達(dá)。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫中篩選出FAM136A在胃癌中轉(zhuǎn)錄水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism 8.0及IBM SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗均至少進(jìn)行三次獨立重復(fù)實驗，并得到相似結(jié)果。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用字2檢驗及Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與FAM136A相關(guān)的生物信息學(xué)分析 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫（基于R語言分析的數(shù)據(jù)庫）篩選出FAM136A在胃癌中轉(zhuǎn)錄水平明顯高于癌旁組織[胃癌vs.癌旁組織：（5.57±0.58）vs.（4.45±0.33），Plt;0.05]，見圖1。對TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中FAM136A轉(zhuǎn)錄水平與Cyclin D1（圖2A）、Snail1（圖2B）等促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵分子轉(zhuǎn)錄水平正相關(guān)。

2.2 FAM136A在胃腺癌組織中表達(dá)的臨床病理意義 90例胃癌患者中61例（68%）為FAM136A高表達(dá)，29例（32%）為FAM136A低表達(dá)，分析臨床資料顯示，病理學(xué)分級Ⅰ級高表達(dá)比例低于Ⅱ、Ⅲ級（P=0.003）；分析T分期發(fā)現(xiàn)，T1期高表達(dá)比例低于T2～4（P=0.001）；N0期高表達(dá)比例低于N1～3（P=0.003）。FAM136A在胃癌組織中的表達(dá)在不同年齡及性別中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.419、0.292）。見表1。通過90例胃腺癌組織的免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)FAM136A主要表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)（圖3）。

2.3 FAM136A調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲、增殖能力 在胃癌細(xì)胞系HGC-27和AGS中，分別使用PCMV6-FAM136A過表達(dá)FAM136A或者使用三對靶向FAM136A的siRNA：si-154，si-235及si-315敲低FAM136A。經(jīng)Western Blot實驗檢測FAM136A蛋白差異表達(dá)效果顯著，三對FAM136A siRNA中si-154干擾效果最為顯著，故選用該干擾進(jìn)行后續(xù)實驗（圖4）。隨后進(jìn)行Transwell實驗，結(jié)果顯示：過表達(dá)FAM136A后，AGS和HGC-27細(xì)胞的遷移及侵襲能力增強，干擾FAM136A后AGS和HGC-27細(xì)胞的遷移及侵襲能力下降（圖5、6）。MTT實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)FAM136A增強AGS和HGC-27細(xì)胞的增殖能力，而敲低FAM136A后AGS和HGC-27細(xì)胞的增殖能力下降，見圖7。

2.4 FAM136A調(diào)控胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）能力 通過Western blot實驗檢測了EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況，發(fā)現(xiàn)在HGC-27及AGS細(xì)胞中上調(diào)FAM136A的表達(dá)水平后，E-cadherin、Claudin-1的表達(dá)水平下降，而N-cadherin、Snail、Slug及MMP-2的表達(dá)水平升高，而敲低FAM136A表達(dá)水平后E-cadherin、Claudin-1的表達(dá)水平升高，而N-cadherin、Snail、Slug及MMP-2的表達(dá)水平降低，見圖8。

2.5 FAM136A通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)胃癌增殖 通過Western blot實驗檢測了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：HGC-27及AGS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒上調(diào)FAM136A的表達(dá)水平后，cyclin D1、cyclin B1、p-Rb的表達(dá)水平升高，而下調(diào)FAM136A后cyclin D1、cyclin B1、p-Rb表達(dá)水平下降，見圖9。

3 討論

近一半接受外科治療的胃癌患者可出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8-10]，EMT是指上皮細(xì)胞在某些生理或病理條件下，失去上皮細(xì)胞特征并獲得間充質(zhì)細(xì)胞特征的生物學(xué)過程。E-cadherin表達(dá)的丟失是EMT最早發(fā)生的步驟之一，Snail與Slug可在轉(zhuǎn)錄水平抑制E-cadherin的表達(dá)，N-cadherin為間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物[11]，EMT導(dǎo)致上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為侵襲性、轉(zhuǎn)移性的間充質(zhì)細(xì)胞，是腫瘤發(fā)展的基礎(chǔ)，它通過細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上調(diào)N-Cadherin的表達(dá)、促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌及刺激整合素，促進(jìn)細(xì)胞運動[12-18]。Transwell實驗發(fā)現(xiàn)FAM136A可增強HGC-27及AGS細(xì)胞的遷移、侵襲能力，Western blot實驗發(fā)現(xiàn)FAM136A可下調(diào)E-cadherin、Claudin-1的表達(dá)，上調(diào)N-cadherin、Snail、Slug及MMP2的表達(dá)水平，提示FAM136A可通過調(diào)控EMT增強胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。

細(xì)胞通過進(jìn)入細(xì)胞周期不斷分裂增殖，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及其激酶及抑制物對細(xì)胞周期發(fā)揮重要調(diào)控作用。cyclin D1為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，cyclin D1在G1早期表達(dá)，是細(xì)胞周期的啟動因子，促進(jìn)細(xì)胞從G1到S期轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞增殖。Rb蛋白抑制細(xì)胞增殖，經(jīng)上游cyclin-CDK復(fù)合物誘導(dǎo)磷酸化后失去活性，并將轉(zhuǎn)錄因子E2F從抑制狀態(tài)釋放出來，進(jìn)一步促進(jìn)G1/S期的轉(zhuǎn)換[19]。在胃癌等多種腫瘤組織中，常發(fā)生cyclin D1過度表達(dá)活化及Rb磷酸化，進(jìn)而加速腫瘤增殖[20-21]，cyclin B1會促進(jìn)細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)換，激活細(xì)胞有絲分裂，組織細(xì)胞中cyclin B1過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增生失控及惡性轉(zhuǎn)化[22]。MTT實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)AM136A可以增強HGC-27、AGS兩種細(xì)胞的增殖能力，通過Western blot實驗檢測發(fā)現(xiàn)：FAM136A可提高cyclin D1及cyclin B1的蛋白表達(dá)水平及Rb蛋白磷酸化水平，這提示FAM136A可通過調(diào)節(jié)cyclin D1、Rb及cyclin B1的表達(dá)或活化水平促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，進(jìn)而增強胃癌增殖能力。

綜上所述，F(xiàn)AM136A可通過調(diào)控EMT增強胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。FAM136A可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)胃癌增殖能力。FAM136A調(diào)控胃癌進(jìn)展的具體機制需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2022-12-27） （本文編輯：何玉勤）