路愜楠，張素平，王 柳，張軼華

（河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院·國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200）

頭孢克洛為第2代半合成頭孢菌素類抗菌藥物，其可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，臨床主要用于治療敏感菌所致呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、耳鼻喉科、皮膚、軟組織等的感染。2020 年版《中國藥典（二部）》收載了頭孢克洛原料及制劑，在有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下規(guī)定了頭孢克洛峰與頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體峰之間的分離度應(yīng)不小于2.0，規(guī)定了單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總和的限度，但未對各已知雜質(zhì)進(jìn)行控制。頭孢克洛原料及制劑的有關(guān)物質(zhì)水合羥基化頭孢克洛［1］、頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體［2-4］均有系統(tǒng)報(bào)道，也有對頭孢克洛膠囊中12 種未知雜質(zhì)的檢測［5］，但尚未見用一測多評(píng)法對3種已知雜質(zhì)（頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體、水合羥基化頭孢克洛、雜質(zhì)Ⅰ）進(jìn)行定量控制的報(bào)道。高效液相色譜（HPLC）法是目前藥品有關(guān)物質(zhì)檢查最常規(guī)的手段，但其常用的外標(biāo)法常受雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲得困難等因素制約。一測多評(píng)法由于在日常檢驗(yàn)中省去了雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，又同時(shí)考慮了雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同所引起的測定誤差，準(zhǔn)確度較好［6-15］。本研究中探討了一測多評(píng)法用于控制頭孢克洛膠囊中3種已知雜質(zhì)的可行性，為該制劑的質(zhì)量控制提供了參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，包括紫外-可見分光檢測器（美國Waters公司）；MCM36型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.001 mg）。

1.2 試藥

頭孢克洛膠囊（某廠，批號(hào)分別為E382191102，E362191103，E392191104）；頭孢克洛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為130481 - 202007，含量84.1%）；頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體（歐洲藥典對照品，批號(hào)為C0640000，含量100%）；水合羥基化頭孢克洛對照品（批號(hào)為PITBK - 2- 20190112- 03，含量97.79%），雜質(zhì)Ⅰ對照品（批號(hào)為PITBK-E-EP-YN0529-01，含量97.74%），均購自廣州牌牌生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.78%磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉7.8 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，用磷酸調(diào)pH 至4.0；A）-［0.78%磷酸二氫鈉溶液pH 4.0 - 乙腈（55∶45，V/V）；B］，梯度洗脫（0～30 min 時(shí)95%A →75%A，30～45 min時(shí)75%A →0 A，45～50 min時(shí)0 A，50～51 min時(shí)0 A →95%A，51～61 min時(shí)95%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；樣品放置溫度：4 ℃。

2.2 溶液制備

取頭孢克洛對照品適量，精密稱定，用0.27%磷酸二氫鈉溶液（pH 2.5，下同）溶解并制成成每1 mL 約含頭孢克洛10 μg 的對照品溶液。分別取頭孢克洛、頭孢克洛δ- 3 - 異構(gòu)體、水合羥基化頭孢克洛和雜質(zhì)Ⅰ對照品各適量，精密稱定，用0.27%磷酸二氫鈉溶液（pH 2.5）制成1 mg/ mL 的單一對照品貯備液；分別精密量取頭孢克洛對照品貯備液0.1 mL、頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體對照品貯備液0.25 mL、水合羥基化頭孢克洛對照品貯備液0.25 mL、雜質(zhì)Ⅰ對照品貯備液0.15 mL，置10 mL 容量瓶中，用0.27%磷酸二氫鈉定容，搖勻，作為混合對照品溶液。取20粒樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取約相當(dāng)于頭孢克洛（按C15H14ClN3O4S）0.5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加0.27%磷酸二氫鈉溶液溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分離度考察：取混合對照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果出峰順序依次為頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體、頭孢克洛、水合羥基化頭孢克洛和雜質(zhì)Ⅰ，各峰間的分離度依次為10.9，6.3，5.1，均達(dá)到完全分離。詳見圖1。

圖1 分離度考察高效液相色譜圖1.Cefaclor δ - 3 - isomer 2.Cefaclor 3.Impurity Ⅰ 4.Hydrated hydroxylated cefaclorFig.1 HPLC chromatograms of resolution test

破壞性試驗(yàn)：取供試品（批號(hào)為E382191102）適量，約相當(dāng)于頭孢克洛0.5 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，分別按下述方法破壞。1）未破壞。加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。2）酸破壞。加入1 mol/L鹽酸1 mL，室溫放置1 h，加1 mol/L氫氧化鈉1 mL，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。3）堿破壞。加入1 mol/L 氫氧化鈉1 mL，室溫放置1 h，加1 mol/L 鹽酸1 mL，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。4）氧化破壞。加入30%過氧化氫溶液1 mL，室溫放置1 h，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。5）內(nèi)容物熱破壞。置80 ℃加熱1 h，取出放冷，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。6）溶液熱破壞。加適量0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）溶解，置80 ℃加熱1 h，取出放冷，加0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）稀釋并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。7）光破壞。取未破壞溶液適量，置5 000 lx 照度下光照24 h。取破壞后的溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果各降解雜質(zhì)與主峰均分離良好。詳見圖2。

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密量取頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體、水合羥基化頭孢克洛和雜質(zhì)Ⅰ的對照品貯備液各適量，用0.27%磷酸二氫鈉（pH 2.5）分別稀釋，制成系列對照品溶液，以質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程及線性范圍見表1。

2.3.3 檢測限與定量限考察

分別精密量取2.3.2項(xiàng)下最低質(zhì)量濃度溶液適量，倍比稀釋，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比為10∶1、3∶1時(shí)的進(jìn)樣量分別記作定量限、檢測限。詳見表1。

2.3.4 精密度試驗(yàn)

取2.3.2 項(xiàng)下最低質(zhì)量濃度溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體、水合羥基化頭孢克洛和雜質(zhì)Ⅰ峰面積的RSD分別為0.41%，0.18%，0.19%，0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取混合對照品溶液適量，于5 ℃條件下放置0，6，12，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體、水合羥基化頭孢克洛和雜質(zhì)Ⅰ峰面積的RSD均小于2.0%，表明混合對照品溶液在5 ℃放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，在5 ℃條件下放置0，6，12，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體、水合羥基化頭孢克洛、雜質(zhì)Ⅰ在5 ℃放置6 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，12 h 時(shí)雜質(zhì)Ⅰ峰面積變大，24 h時(shí)雜質(zhì)Ⅰ和水合羥基化頭孢克洛均已降解。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取樣品適量，精密稱定，各6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，頭孢克洛、頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體、水合羥基化頭孢克洛、雜質(zhì)Ⅰ含量的RSD分別為0.18%，0.18%，1.38%，1.32%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)為E382191102）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 頭孢克洛已知雜質(zhì)加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of cefaclor and three known impurities（n = 9）

2.4 相對校正因子（RCF）及相對保留時(shí)間（RRT）

以2.3.2 項(xiàng)下各線性回歸方程中頭孢克洛的斜率除以已知雜質(zhì)的斜率作為各成分的RCF。結(jié)果頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體、水合羥基化頭孢克洛、雜質(zhì)Ⅰ的RCF分別為0.83，1.07，1.34，RRT分別為0.87，1.10，1.05。

2.5 耐用性試驗(yàn)

精密量取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，考察不同液相色譜儀、品牌色譜柱、測定波長、柱溫、流動(dòng)相pH、流速條件下的RCF 及RRT。結(jié)果表明，色譜條件發(fā)生一定變化時(shí)無顯著影響。詳見表3、表4（表中色譜柱規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5μm）。

表3 相對校正因子的耐受性考察結(jié)果Tab.3 Results of the durability test of relative correction factors

表4 相對保留時(shí)間的耐受性考察結(jié)果Tab.4 Results of the durability test of relative retention time

2.6 有關(guān)物質(zhì)檢測

取3 批樣品各適量，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，按加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算各已知雜質(zhì)含量，并與外標(biāo)法計(jì)算結(jié)果比較。結(jié)果見表5，可見，2種方法對3種雜質(zhì)含量的測定結(jié)果基本一致。

3 討論

由破壞試驗(yàn)結(jié)果可見，頭孢克洛膠囊內(nèi)容物加熱破壞對峰影響較小，而對溶液加熱破壞最敏感，產(chǎn)生較多雜質(zhì)，在試驗(yàn)中溶液應(yīng)控制溫度，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和光破壞使頭孢克洛δ-3-異構(gòu)體與水合羥基化頭孢克洛含量均增加，氧化破壞在11 min 左右會(huì)產(chǎn)生較大破壞產(chǎn)物。因此加強(qiáng)產(chǎn)品包裝的密閉性和遮光性十分必要。

本研究中考察了不同色譜條件對RRT 的影響，確定了各已知雜質(zhì)相對主成分（頭孢克洛）的RRT，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定3種已知雜質(zhì)的校正因子，將供試品溶液稀釋500倍作為自身對照，采用加校正因子的主成分自身對照法，計(jì)算3 種已知雜質(zhì)的含量。所得結(jié)果與外標(biāo)法所得結(jié)果無明顯差異，表明RCF 的計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確。將測得的RRT 和RCF 載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可供常規(guī)檢驗(yàn)使用，能降低因主成分與雜質(zhì)的絕對校正因子不同而引起的測定誤差，且無須長期使用雜質(zhì)對照品，可替代外標(biāo)法用于準(zhǔn)確測定已知有關(guān)物質(zhì)的含量。

綜上所述，本研究中所建立的方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于頭孢克洛膠囊的雜質(zhì)檢測。