劉萍 胡利敏 田洪年 李敏 張文勝 楊夢(mèng)德 賈全 孫玉雙

(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 052165)

頭孢克洛(cefaclor)是第二代口服頭抱菌素衍生物，是EliLilly公司在1975年報(bào)道的新藥[1]，是廣泛應(yīng)用于抗感染的頭孢菌素類抗生素藥物。頭孢克洛抗菌譜主要是：葡萄球菌、肺炎雙球菌、大腸埃希菌等，其作用機(jī)制為使轉(zhuǎn)肽酶失活，干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，阻止黏肽原的交聯(lián)[2]。頭孢克洛雜質(zhì)包括合成過程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)以及在酸、堿、高溫和光照條件下產(chǎn)生的降解雜質(zhì)[3-4]。頭孢克洛在高溫和強(qiáng)光條件下均會(huì)降解產(chǎn)生羥基化降解物雜質(zhì)。頭孢克洛和水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見圖1。水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的化學(xué)名為(6R, 7R)-7-(R)-2-氨基-2-苯乙酰氨基)-3-氯-2-羥基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-3-烯-2-羧酸。水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)未被《歐洲藥典》10.0版(EP10.0)[5]收載在頭孢克洛原料藥項(xiàng)下?！吨袊幍洹?020版收載了頭孢克洛原料藥的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，未對(duì)各雜質(zhì)進(jìn)行單獨(dú)控制，未對(duì)水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)準(zhǔn)確定性定量研究，參照《中國藥典》2020版頭孢克洛原料藥等[6-7]有關(guān)物質(zhì)方法對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)考察，同時(shí)采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法和外標(biāo)法對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行定量研究。試驗(yàn)證明該方法操作簡便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可以采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法進(jìn)行定量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器、美國Agilent公司)；XS105電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；FE20 pH計(jì)(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試藥

頭孢克洛對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)130418-201606，含量94.4%)；水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)對(duì)照品(廣州牌牌生物科技有限公司，批號(hào)PITBKL-2-20190112-03，含量95.17%)；頭孢克洛原料藥(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)D1121903002)；磷酸二氫鈉、磷酸為分析純，乙腈為色譜純，水為純化水。

2 色譜條件

2.1 檢測(cè)波長的選擇

取水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)對(duì)照品用0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋制成0.1 mg/mL的溶液，在190～400 nm范圍紫外掃描，見圖2。譜圖顯示，水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)在220 nm處有最大吸收，與《中國藥典》2020版收載的頭孢克洛原料藥的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法中檢測(cè)波長一致。

2.2 色譜條件

參照《中國藥典》2020版收載的頭孢克洛原料藥的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法。色譜柱：資生堂CAPCELL PAK AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為0.78%磷酸二氫鈉溶液(取磷酸二氫鈉7.8 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用磷酸調(diào)pH至4.0)，流動(dòng)相B為0.78%磷酸二氫鈉溶液(pH4.0)-乙腈(55:45)；流速1.2 mL/min；檢測(cè)波長：220 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量20 μL；按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。

表1 梯度洗脫時(shí)間表Tab.1 Gradient elution schedule

2.3 溶液配制

2.3.1 對(duì)照品溶液

精密稱取水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)對(duì)照品6 mg，置于50 mL量瓶，加0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3.2 供試品溶液

取頭孢克原料藥約50 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3.3 系統(tǒng)適用性溶液

取供試品約50 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，精密量取對(duì)照品溶液1.5 mL置上述量瓶中溶解再加0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果見圖3，頭孢克洛與水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)分離度為4.67，大于1.5，證明該方法系統(tǒng)適用性良好。

3 校正因子的測(cè)定

3.1 雜質(zhì)峰定位

取“2.3.3”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，確定水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的保留時(shí)間，計(jì)算該雜質(zhì)相對(duì)于主成分頭孢克洛的相對(duì)保留時(shí)間(RRT=t雜質(zhì)/t頭孢克洛)，結(jié)果為1.11，見圖3。

3.2 雜質(zhì)校正因子的測(cè)定

3.2.1 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取頭孢克洛對(duì)照品和水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)對(duì)照品適量，用0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋制得濃度分別為定量限、0.010、0.020、0.025、0.030和0.035 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液濃度C為橫坐標(biāo)，色譜峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

分別配制3組頭孢克洛、水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)線性濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程，頭孢克洛與雜質(zhì)回歸方程式斜率之比即為校正因子，并計(jì)算校正因子的RSD值。

頭孢克洛和水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)線性重復(fù)性結(jié)果見表2，水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)校正因子計(jì)算重復(fù)性結(jié)果見表3。

表2 線性重復(fù)性結(jié)果Tab.2 Linear repeatable result

表3 校正因子計(jì)算重復(fù)性結(jié)果Tab.3 Correction factor calculation repeatability results

3.2.2 中間精密度試驗(yàn)

不同人員在不同日期使用不同的儀器，分別配制3組頭孢克洛、水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)線性曲線，通過計(jì)算頭孢克洛與水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)回歸方程式斜率之比，求得水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的校正因子，并計(jì)算校正因子的RSD值。具體試驗(yàn)過程同“3.2.1”項(xiàng)。

頭孢克洛和水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)線性中間精密度結(jié)果見表4，水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)校正因子計(jì)算中間精密度結(jié)果見表5。

表4 線性中間精密度結(jié)果Tab.4 Linear intermediate precision results

表5 校正因子計(jì)算中間精密度結(jié)果Tab.5 Correction factor to calculate intermediate precision results

結(jié)果表明：重復(fù)性和中間精密度中9個(gè)校正因子的RSD均小于5.0%；中間精密度與重復(fù)性數(shù)據(jù)比較，計(jì)算出水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)校正因子的18個(gè)數(shù)的RSD為0.53%，小于5.0%，說明該方法測(cè)定水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)校正因子中間精密度良好。水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)校正因子為1.02。

4 方法學(xué)考察

4.1 專屬性試驗(yàn)

以0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)為溶劑，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。在頭孢克洛和水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)處均無色譜峰出現(xiàn)，表明溶劑無干擾(圖略)。

4.2 檢測(cè)限和定量限

精密量取對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的檢測(cè)限(S/N=3.5)為5.5594ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度(5 mg/mL)的0.05559‰；定量限(S/N=10.5)為17.721ng，相當(dāng)于供試品溶液濃度(5 mg/mL)的0.1772‰。取定量限溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，主峰峰面積的RSD為3.47%，主峰保留時(shí)間的RSD為0.16%。

4.3 線性試驗(yàn)

具體試驗(yàn)過程見“3.2.1”項(xiàng)。水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的回歸方程為A=22012.3009c-0.9319。結(jié)果表明，水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)在9.108×10-4～3.400×10-2mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=1.0000)。

4.4 回收率試驗(yàn)

4.4.1 試驗(yàn)過程

精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為外標(biāo)法對(duì)照品溶液。

按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

精密量取“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為1%對(duì)照品溶液。

精密稱取頭孢克洛原料藥(批號(hào)D1120903002，水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)含量為0)約50 mg，共9份，分別置10 mL量瓶中，平均分成3組，每組分別加入“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.6、2.0和2.4 mL，用0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為回收率溶液。

分別精密量取外標(biāo)法對(duì)照品溶液、供試品溶液、1%對(duì)照品溶液和回收率溶液各20 μL注入液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以外標(biāo)法計(jì)算加入水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的回收率，同時(shí)分別采用外標(biāo)法與加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)加入的水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的含量進(jìn)行計(jì)算并比較結(jié)果。

4.4.2 試驗(yàn)結(jié)果

以外標(biāo)法計(jì)算加入水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的回收率，結(jié)果見表6，水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的平均回收率(n=9)為104.03%，RSD為0.82%。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 The results of sample recovery rate test

分別采用外標(biāo)法與加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)加入的水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表7。

表7 外標(biāo)法與校正因子法結(jié)果比較Tab.7 Comparison of the results of external standard method and correction factor method

4.5 溶液穩(wěn)定性考察

精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別在4℃條件下放置0、1、2、4、6、8、10、12和24h進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)照品峰面積的RSD為0.23%。表明水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)對(duì)照品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表8。

表8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 The results of solution stability test

4.6 耐用性考察

由于供試品中水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)未檢出，為了更準(zhǔn)確的測(cè)定水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)，使用加標(biāo)供試品溶液進(jìn)行試驗(yàn)。通過改變檢測(cè)波長(215、220和225 nm)、柱溫(20、25和30℃)、流速(1.0、1.2和1.4 mL/min)、流動(dòng)相B中磷酸鹽與乙腈比例(50:50、55:45和60:40，V/V)、流動(dòng)相A的pH值(3.8、4.0和4.2)，以及使用不同品牌的色譜柱(資生堂 CAPCELL PAK C18AQ色譜柱，4.6 mm×250 mm， 5 μm；Waters Sun fire?C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；島津ODS-SP色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm)來考察分析方法的耐用性。

4.6.1 試驗(yàn)過程

按“4.4.1”項(xiàng)下配制外標(biāo)法對(duì)照品溶液。

精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液4.5 mL，置100 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為稀釋劑。

精密稱取頭孢克洛原料藥約50 mg，置10 mL量瓶中，加入稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為加標(biāo)供試品溶液。

精密量取加標(biāo)供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用0.27%磷酸二氫鈉溶液(pH2.5)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為1%對(duì)照品溶液。

分別精密量取外標(biāo)法對(duì)照品溶液、加標(biāo)供試品溶液、1%對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。分別采用外標(biāo)法與加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算加標(biāo)供試品中水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的含量。

4.6.2 試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)試驗(yàn)，以上色譜條件變化均能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求，對(duì)供試品中水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的含量測(cè)定影響較小，采用外標(biāo)法與加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算加標(biāo)供試品中水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)含量的結(jié)果一致，水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的校正因子的耐用性考察見表9～11。水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間1.10～1.12，且保持穩(wěn)定，水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間耐用性考察見表12。

表9 校正因子的耐用性考察-檢測(cè)波長和柱溫Tab.9 The correction factor of durability test-detection wavelength and column temperature

表10 校正因子的耐用性考察-流速和流動(dòng)相A的pH值Tab.10 The correction factor of durability test- flow and pH of the mobile phase A

表11 校正因子的耐用性考察-流動(dòng)相B中磷酸鹽與乙腈比例和色譜柱Tab.11 The correction factor of durability test- the ratio of phosphate to acetonitrile in mobile phase B and column

表12 相對(duì)保留時(shí)間的耐用性考察Tab.12 Relative retention time of durability test

5 討論

5.1 校正因子的確定

本研究通過中間精密度6條曲線，共得出18個(gè)校正因子的平均值，確定水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的校正因子為1.02。在準(zhǔn)確度以及耐用性考察中，將加校正因子的主成分自身對(duì)照法和外標(biāo)法的結(jié)果對(duì)比，佐證了校正因子的準(zhǔn)確性，同時(shí)在耐用性試驗(yàn)中，對(duì)該雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行考察，確定該雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定。

參考ICH關(guān)于化藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中校正因子的指導(dǎo)原則，校正因子在0.9～1.1時(shí)，可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算含量。本研究中水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)可不予校正。

5.2 水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)的控制

水合羥基化頭孢克洛雜質(zhì)在高溫、強(qiáng)光條件下均會(huì)降解產(chǎn)生，在穩(wěn)定性放置過程中也會(huì)降解產(chǎn)生，在頭孢克洛原料藥穩(wěn)定性放置過程中含量會(huì)增加到0.3%左右。頭孢克洛原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中可以增加對(duì)該雜質(zhì)的單獨(dú)控制，采用相對(duì)保留時(shí)間定位，采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法定量研究，以確保原料藥的安全有效。