張 婷，胡來麗，時(shí) 源，楊 果，何世興

（1.四川郎酒股份有限公司，四川古藺 646523；2.四川省醬香型白酒生態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646523）

為準(zhǔn)確定量白酒中乳酸含量，本研究采用高效液相色譜法，選用磷酸二氫鈉作為流動(dòng)相體系，加入不同比例甲醇，用5%乙醇制備標(biāo)準(zhǔn)溶液以排除乙醇對(duì)乳酸、乙酸保留時(shí)間的干擾，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過精密度和加標(biāo)回收試驗(yàn)，以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。利用該方法找出不同香型白酒中有機(jī)酸的差異性，并選取原酒蒸餾過程中的前段、中段、尾段酒樣進(jìn)行分析，以期為白酒中乳酸含量測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：醬香、濃香、清香3 種香型酒樣各10 個(gè)，市購；選取原酒蒸餾過程前段、中段、后段酒樣各1個(gè)。

試劑：甲醇（fisher）、乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）、乳酸（天津市光復(fù)化工研究所）、乙酸（天津市光復(fù)化工研究所）均為色譜純；磷酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司）、磷酸二氫鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）均為優(yōu)級(jí)純。

儀器設(shè)備：Waters 2695 超高效液相色譜儀，配2489 紫外檢測(cè)器；Milli-Q（IQ7010）純水系統(tǒng)；pH儀，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；0.22 μm有機(jī)濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 流動(dòng)相配制

配制濃度為20 mM磷酸二氫鈉，并用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.7。

1.2.2 樣品前處理

總之，迪士尼樂園與色彩豐富的美國西海岸攝影藝術(shù)都曾在斯各格蘭德身上打下印記。同時(shí)出現(xiàn)在其作品中的，還有美國恐怖電影的痕跡，以及美國中產(chǎn)階級(jí)的焦慮——斯各格蘭德擅長以諷刺手法來表現(xiàn)這一點(diǎn)。她的作品中顯然飄蕩著一種城郊居民的憂郁氣息。她承認(rèn)對(duì)平庸充滿興趣，“我自己也出身于中產(chǎn)階級(jí)，從品味來看，我的階層正是我做出許多選擇的根源?！?/p>

將樣品稀釋過0.22 μm 水系濾膜，待上機(jī)分析。

1.2.3 定性實(shí)驗(yàn)

分別配制乳酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)乳酸、乙酸保留時(shí)間定性。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取0.10 g 乳酸、乙酸至100 mL 容量瓶，分別用不同濃度乙醇溶液溶解并定容到100 mL，配制成濃度為100 mg/100 mL 乳酸、乙酸儲(chǔ)備液。用該儲(chǔ)備液配制濃度為0 mg/100 mL，5 mg/100 mL，10 mg/100 mL，25 mg/100 mL，50 mg/100 mL，100 mg/100 mL 的乳酸、乙酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：XSelect HSST3 (4.6 ×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相A 為磷酸二氫鈉，B 為甲醇；配紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長為210 nm，分別在A∶B=95∶5 和A∶B=90∶10的流動(dòng)相比例下進(jìn)行測(cè)定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

白酒樣品中主要成分為乙醇和水，考慮基質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的影響，分別用純水和10 %乙醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1 和圖2 可看出，乙醇影響分離程度，乳酸保留時(shí)間為5.5 min。

圖1 純水配制標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 10%乙醇配制標(biāo)準(zhǔn)曲線

XSelect HSS T3 5 μm 4.6×250 mm為反相色譜柱，通過加入5 %、10 %甲醇提高色譜柱分離程度。圖3 為流動(dòng)相中加入5%甲醇、用10%乙醇作為溶劑建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，乳酸、乙酸保留時(shí)間提前，出現(xiàn)乳酸峰前移及乙酸峰拖尾現(xiàn)象。

圖3 流動(dòng)相中加入5%甲醇、10%乙醇作為溶劑建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 為流動(dòng)相中加入10 %甲醇、10 %乙醇作為溶劑建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，乳酸保留時(shí)間提前至4.0 min，峰分離效果好。

圖4 流動(dòng)相中加入10%甲醇、10%乙醇作為溶劑建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線

考慮乙醇對(duì)保留時(shí)間及結(jié)果的影響，將樣品分別稀釋至1 %vol、2 %vol、3 %vol、4 %vol、5 %vol、6 %vol、7 %vol、8 %vol、9 %vol。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸保留時(shí)間不變，乙酸保留時(shí)間受乙醇濃度影響，隨乙醇濃度增加而提前。酒精度范圍在10%vol 內(nèi)，乙酸保留時(shí)間差異為0.1 min（見圖5）。根據(jù)流動(dòng)相中不同乙醇濃度對(duì)保留時(shí)間的影響，綜合考慮將該方法優(yōu)化為濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉流動(dòng)相中加入10%甲醇，用5%vol 乙醇溶液配制乳酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5 不同乙醇濃度對(duì)乳酸、乙酸保留時(shí)間的影響

2.2 線性關(guān)系及檢出限

采用濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉，加入10%甲醇流動(dòng)相，用5%乙醇作為溶劑建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)配制的不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。乳酸、乙酸的保留時(shí)間、線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。

表1 乳酸乙酸HPLC分析標(biāo)準(zhǔn)曲線

相關(guān)系數(shù)R2均＞0.9999，可滿足定量檢測(cè)要求。以信噪比（S/N)=3確定檢出限，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)需求[5]。

2.3 精密度試驗(yàn)

配制濃度為2 mg/100 mL、20 mg/100 mL、80 mg/100 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用上述方法進(jìn)行6 次平行測(cè)定，計(jì)算乳酸和乙酸在不同濃度下測(cè)定結(jié)果的平均值及RSD。由表2 可知，乳酸、乙酸精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜1.0 %，說明該方法的精密度良好，可用于白酒樣品的檢測(cè)。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 （n=6)

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在含量約為40 mg/L 的標(biāo)樣中，加入40 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，平行測(cè)定3次，計(jì)算平均回收率和RSD，結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

由表3 可知，乳酸的加標(biāo)回收率在102 %～103%之間，乙酸的加標(biāo)回收率在104%～106%之間，RSD 均＜0.5%，表明該方法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度較好。

2.5 3種香型白酒四大酸的測(cè)定分析

選取3 種香型不同廠家酒樣各10 個(gè)，稀釋為乙醇濃度≤5%vol 樣品，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，進(jìn)行乳酸、乙酸測(cè)定，用氣相色譜法進(jìn)行丁酸、己酸分析，用指示劑法對(duì)總酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

對(duì)比得出不同香型白酒四大酸存在差異性，其中醬香型白酒乳酸、乙酸和總酸較高；濃香型白酒己酸較高；清香型白酒乙酸較高。初步得出白酒四大酸指標(biāo)差異性可影響白酒風(fēng)格及香型[7]。

2.6 前、中、尾段酒樣四大酸結(jié)果分析

選取原酒蒸餾過程前段、中段、尾段酒樣，用此方法進(jìn)行四大酸分析，結(jié)果見表5。對(duì)比得出，有機(jī)酸隨著餾酒時(shí)間的延長呈上升趨勢(shì)，有機(jī)酸與餾酒時(shí)間呈正相關(guān)。鑒于此，可進(jìn)一步開展白酒餾分風(fēng)味物質(zhì)的分析，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際對(duì)白酒餾酒工藝提供技術(shù)指導(dǎo)[7]。

表5 前段、中段、尾段酒樣四大酸含量 (g/L)

3 結(jié)論

本研究確立了高效液相色譜法檢測(cè)白酒中乳酸、乙酸含量的方法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、精密度、加標(biāo)回收率均能滿足試驗(yàn)要求。通過研究不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)乳酸、乙酸保留時(shí)間和峰形的影響，在濃度為20 mM、pH2.7 磷酸二氫鈉加入10 %甲醇流動(dòng)相，以便于增加乳酸、乙酸分離程度，用5%乙醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品稀釋為乙醇含量低于5%vol時(shí)，可以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

利用該方法對(duì)醬香、濃香、清香3 種香型白酒的乳酸、乙酸進(jìn)行測(cè)定，用氣相色譜法對(duì)己酸、丁酸進(jìn)行測(cè)定，用指示劑法對(duì)總酸進(jìn)行測(cè)定，可準(zhǔn)確檢測(cè)出各酒樣中乳酸、乙酸、丁酸和己酸的含量差異。對(duì)餾酒過程中前段、中段、尾段酒樣中的四大酸進(jìn)行測(cè)定，可知有機(jī)酸含量與餾酒時(shí)間呈正相關(guān)。本研究所提出的方法可用于白酒樣品中乳酸、乙酸的檢測(cè)，所得結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。