王曉龍， 楊 曌 ， 來永才， 鐘 鵬， 柴 華， 李莎莎，徐艷霞， 吳 玥， 王建麗， 高海娟， 李 莉， 張 楊， 李 偉

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，黑龍江 哈爾濱 150086；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性強、適口性好等優(yōu)良特性（趙一航等，2021；朱愛民等，2019）。但在我國北方地區(qū)種植，部分苜蓿品種存在越冬率偏低的問題，并且苜蓿品種不同表現(xiàn)出來的越冬率亦不同。黑龍江地區(qū)是我國重要的畜牧業(yè)發(fā)展基地， 特別是奶牛、肉牛等養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶動了苜蓿產(chǎn)業(yè)的全面發(fā)展。然而影響黑龍江地區(qū)苜蓿生長最為關(guān)鍵的因素之一是越冬。正因如此選擇適宜黑龍江地區(qū)種植的苜蓿品種，不僅要求高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，而且還應(yīng)具有較強的抗寒性（崔國文，2009）。 寒冷地區(qū)苜蓿引種或管理不當(dāng)會導(dǎo)致苜蓿越冬率偏低，甚至苜蓿植株大量死亡，給種植戶和企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前解決苜蓿越冬問題的關(guān)鍵是了解苜蓿對寒冷適應(yīng)的規(guī)律和特點，以及苜蓿根系對抗寒性的響應(yīng)（王曉龍等，2022；馬周文等，2016；Brumme 等，2002）。當(dāng)植物面臨低溫時，體內(nèi)會產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)，通過提高一些調(diào)節(jié)物質(zhì)如游離脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、超氧化物歧化酶（SOD）等含量和酶活性來保護植物免受低溫傷害，這些調(diào)節(jié)物質(zhì)常被作為評價植物抗寒性的重要指標(biāo)（馬周文等，2016）。 通常苜蓿在秋末冬初停止生長， 地上部的營養(yǎng)物質(zhì)會轉(zhuǎn)移至根部，以備翌年再生。 所以苜蓿根系既是植物生長時水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收器官，亦是苜蓿越冬時重要的貯藏器官，其存儲營養(yǎng)物質(zhì)的多少直接影響著植株的越冬與再生性。由于耐寒性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，僅靠單一指標(biāo)還無法判定苜蓿的抗低溫能力強弱，因此，如何選擇適宜的生理指標(biāo)來評價苜蓿品種抗寒性，已成為當(dāng)前寒區(qū)苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展亟須解決的一大難題（李波等，2021；Cunningham 等，2001）。所以本研究以國內(nèi)外不同苜蓿品種為試驗材料， 通過對苜蓿越冬期根系內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、 細胞膜脂質(zhì)過氧化和保護酶活性等物質(zhì)進行測定， 旨在探究苜蓿越冬期根系生理代謝響應(yīng)機制， 并評價出不同品種之間的抗寒性強弱等級， 為寒區(qū)苜蓿引種栽培及抗寒種質(zhì)資源鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況 試驗地位于齊齊哈爾市富拉爾基，E 123°24′36″，N 47°9′，最低溫度-39.5 ℃，年均氣溫3 ℃，積溫（≥10 ℃）2722.1 ℃，年均降水量約480 mm，無霜期132 d 左右。 試驗地土壤為黑風(fēng)沙土，有機質(zhì)19.89 g/kg，全氮1.19 g/kg，速效磷10.60 mg/kg，速效鉀124.84 mg/kg。

1.2 試驗材料 選取國內(nèi)外苜蓿材料5 份，其中草原3 號由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)提供； 公農(nóng)2 號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原所提供； 龍牧801 由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；皇后、賽迪苜蓿由百綠（天津）國際草業(yè)有限公司提供。

1.3 試驗設(shè)計 試驗小區(qū)面積20 m2（4 m×5 m），2021 年6 月進行人工條播，采用隨機區(qū)組設(shè)計，行距40 cm，3 次重復(fù)，以龍牧801 為保護行。 播前試驗小區(qū)均未施底肥，播種后及時鎮(zhèn)壓。 試驗期間進行灌溉、 除草、 病蟲防治等田間管理措施。 越冬期每隔60d（冷脅迫：10 月30 日；凍脅迫：12 月30 日）田間挖取苜蓿根系，以8 月30日為對照（CK），測定供試品種越冬期根系各項生理指標(biāo)。

1.4 測定方法 生理指標(biāo)測定參照史樹德等（2011）主編的《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》方法進行。游離脯氨酸（Pro）測定采用茚三酮法；可溶性糖（SS）測定采用蒽酮法；可溶性蛋白（SP）測定采用考馬斯亮藍法；丙二醛（MDA）測定采用硫代巴比妥酸法；SOD 測定采用氮藍四唑法； 相對電導(dǎo)率（EC）測定采用電導(dǎo)法。

1.5 統(tǒng)計分析 采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理， 用Sigma Plot 12.5 軟件作圖，SAS 9.0 軟件進行方差分析和相關(guān)性分析。 應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法（王曉龍等，2022；趙一航等，2021），綜合評價所測指標(biāo)，求各項生理指標(biāo)隸屬函數(shù)值，若測定指標(biāo)與苜蓿低溫抗寒性呈正相關(guān)：

測定指標(biāo)與苜蓿低溫抗寒性呈負相關(guān)：

式中：Fij為i 草種j 指標(biāo)值；Xij為鑒定i 草種j 指標(biāo)隸屬值；Ximax為所鑒定i 草種j 指標(biāo)最大值；Ximin為所鑒定i 草種j 指標(biāo)最小值。 將i 草種各項指標(biāo)函數(shù)值進行累加，求平均值，均值越大則苜蓿品種耐寒性越強。 最后將5 個苜蓿品種的耐寒性進行比較，得出品種間抗寒強弱順序。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖和游離脯氨酸 由圖1 可知，供試品種根系中可溶性糖和游離脯氨酸含量均呈先升后降的變化，可溶性糖含量由38.13 ～39.62 mg/g升至51.86 ～60.27 mg/g 又降至43.19 ～52.95 mg/g； 游離脯氨酸含量由364.88 ～374.44 nmol/g升至630.86 ～689.53 nmol/g 又降至463.60 ～628.21 nmol/g；冷脅迫下，各品種可溶性糖積累量呈現(xiàn)最高值，以品種龍牧801、草原3 號和公農(nóng)2 號的可溶性糖含量較高， 其次是皇后苜蓿（57.21 mg/g）， 而賽迪苜蓿可溶性糖含量顯著低于其他品種（P＜0.05）。 隨脅迫程度加劇，各品種可溶性糖含量有所下降， 其中龍牧801 和公農(nóng)2號的可溶性糖含量顯著高于其他品種（P＜0.05），而皇后和賽迪苜蓿較低。

圖1 苜蓿根系可溶性糖和游離脯氨酸含量變化

冷脅迫下， 各品種游離脯氨酸含量亦呈現(xiàn)最高值，與對照組相比增高72.36% ～84.15%，且各品種間差異較大， 其中龍牧801 和公農(nóng)2 號游離脯氨酸含量顯著高于其他品種（P＜0.05），草原3號次之， 而皇后和賽迪苜蓿游離脯氨酸積累量較低；凍脅迫下，龍牧801 的游離脯氨酸含量最高，相比游離脯氨酸最低賽迪高35.51%，且顯著高于其他品種（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，越冬初期，耐寒品種通過積累較多的可溶性糖和游離脯氨酸含量來抵御嚴(yán)冬， 反之抗寒性弱的品種可溶性糖和游離脯氨酸含量較低。

2.2 可溶性蛋白和SOD 由圖2 可知， 所有品種根系可溶性蛋白含量由37.96 ～38.58 μg/g 升至45.05 ～53.10 μg/g 又降至40.21 ～41.96 μg/g。冷脅迫下，各品種可溶性蛋白含量迅速增加，與對照相比增加18.67% ～37.64%， 且不同品種間差異也顯著增大， 其中龍牧801 的可溶性蛋白含量顯著高于其他品種（P＜0.05）；凍脅迫下，龍牧801和公農(nóng)2 號可溶性蛋白含量較高， 顯著高于皇后和賽迪（P＜0.05）。 上述結(jié)果表明，品種龍牧801和公農(nóng)2 號可溶性蛋白的增加可有效增強細胞的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高苜蓿耐寒性，反之皇后和賽迪苜蓿可溶性蛋白積累量較少，抗寒性較弱。

圖2 苜蓿根系可溶性蛋白和SOD 活力變化

各品種根系的SOD 活性由39.53 ～40.96 U/g FW 升至47.66 ～55.15 U/g FW 又降至42.93 ～47.83 U/g FW。 冷脅迫時，各品種根系的SOD 活性呈現(xiàn)最高值，其中龍牧801 和公農(nóng)2 號的SOD活性顯著高于其他品種（P＜0.05），而皇后和賽迪苜蓿的SOD 活性較低； 隨脅迫加劇，SOD 活力有所下降；凍脅迫下，龍牧801、公農(nóng)2 號和草原3號的SOD 活性較高，與其他品種相比差異顯著（P＜0.05）。 該結(jié)果表明，抗寒品種更易增強SOD 酶活性，SOD 可通過歧化反應(yīng)清除超氧陰離子自由基，進而提高苜蓿對低溫的適應(yīng)能力。

2.3 丙二醛和相對電導(dǎo)率 由圖3 可知，各品種的丙二醛含量由起初的52.45 ～53.02 nmol/g 升高至64.53 ～97.42 nmol/g。 與對照相比，龍牧801和草原3 號冷脅迫下丙二醛上升較為緩慢， 而皇后和賽迪苜蓿的丙二醛迅速升高， 分別比對照增加37.90%和47.88%。 隨脅迫強度加劇，各品種在凍脅迫下丙二醛呈現(xiàn)最高值， 以品種皇后和賽迪苜蓿的丙二醛含量較高， 而龍牧801 和草原3 號的丙二醛含量顯著低于其他品種（P＜0.05）。

圖3 苜蓿根系丙二醛和相對電導(dǎo)率變化

越冬期各品種相對電導(dǎo)率隨冷凍脅迫增加呈現(xiàn)升高的變化， 相對電導(dǎo)率由8.16%～8.38%升至54.08%～70.70%。 與對照相比，各品種冷脅迫時的相對電導(dǎo)率增加252.12% ～366.70%； 凍脅迫時，各品種的相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)最高值，以賽迪苜蓿的相對電導(dǎo)率最高， 顯著高于其他品種 （P＜0.05），而龍牧801、草原3 號和公農(nóng)2 號的相對電導(dǎo)率較低。

2.4 綜合評價 相關(guān)性結(jié)果表明，苜蓿耐寒指標(biāo)游離脯氨酸與SOD、可溶性糖、蛋白之間呈極顯著或顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.916、0.869 和0.566，即脯氨酸含量越高，可溶性糖、蛋白、SOD的含量和活性增加， 細胞滲透調(diào)節(jié)和抗氧化能力增強，則苜蓿的耐寒性越強。丙二醛與相對電導(dǎo)率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01；0.851），說明低溫下品種的丙二醛含量越高， 則品種的細胞膜傷害程度較重，膜透性增大，相對電導(dǎo)率升高（表1）。 運用隸屬函數(shù)對品種的抗寒性進行綜合評價，最終得出抗寒強弱順序依次為： 龍牧801 （0.529）＞公農(nóng)2 號（0.523）＞草原3 號 （0.514）＞皇后 （0.468）＞賽迪（0.463）（表2）。

表1 相關(guān)性分析

表2 隸屬函數(shù)分析

3 討論

滲透調(diào)節(jié)是植物通過積累脯氨酸、糖類、蛋白等物質(zhì)使低溫下的植物細胞維持一定的膨壓，以減少細胞內(nèi)水分的流失， 避免因結(jié)冰對植物細胞造成損害（邱乾棟等，2009）。 低溫下，植物細胞滲透調(diào)節(jié)過程的關(guān)鍵是細胞內(nèi)溶物的主動積累（Haagenson 等，2003）。 由于滲透調(diào)節(jié)的暫時性和有限性，滲透調(diào)節(jié)并不能維持整個生理過程（郭子武等，2004）， 因此通過滲透調(diào)節(jié)抵御寒冷有一定的局限性。苜蓿遇冷脅迫時，組織可溶性糖含量表現(xiàn)為增加趨勢，抗寒品種龍牧801、草原3 號和公農(nóng)2 號的可溶性糖含量顯著高于其他品種， 隨脅迫加劇，可溶性糖含量有所下降，這與陶雅和孫啟忠（2008）的研究結(jié)果相一致，說明抗寒品種之所以在寒冷環(huán)境中表現(xiàn)出強抗寒性， 與其自身積累較多的可溶性糖密切相關(guān)（孫予璐等，2017）。游離脯氨酸作為一種細胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)， 其積累與低溫相關(guān)，低溫脅迫下苜蓿游離脯氨酸普遍增加，本研究中， 冷脅迫下龍牧801 和公農(nóng)2 號游離脯氨酸含量較高；隨脅迫加劇，游離脯氨酸含量有所降低，而龍牧801 的脯氨酸含量仍最高，說明品種在寒冷環(huán)境中細胞失水后， 可通過提高根系內(nèi)游離脯氨酸的含量， 增加細胞液濃度以對根系細胞起保護作用， 即游離脯氨酸可作為細胞冰凍保護劑保護原生質(zhì)體（王小華和莊南生，2008），低溫下，苜?？扇苄缘鞍鬃兓厔蓊愃朴谟坞x脯氨酸，也與抗性相關(guān)。 抗寒能力越強， 品種可溶性蛋白含量越高， 如龍牧801 在冷脅迫下可溶性蛋白積累量達到峰值，并且顯著高于其他品種，說明抗寒品種通過積累可溶性蛋白來增強根系保水能力，減輕低溫傷害（張麗娟，2008）。

低溫時， 膜系統(tǒng)尤其是作為連接細胞與環(huán)境界面的質(zhì)膜為最初受害部位。 低溫凍害首先作用于質(zhì)膜，通常表現(xiàn)為膜透性變大，電解質(zhì)及小分子有機物滲漏（陳衛(wèi)東等，2021）。丙二醛為膜系統(tǒng)的過氧化產(chǎn)物，其含量高低可反映植物受害程度。保護酶SOD 具有清除自由基的作用，其活力變化可作為植物的耐寒指標(biāo) （江福英等，2002；Mckersie等，2000）。本研究中，各品種丙二醛含量隨低溫脅迫加劇呈上升趨勢，相同低溫（凍脅迫）下與耐寒性弱的品種相比， 抗寒品種 （龍牧801 和草原3號）根系中丙二醛積累量和增幅較小，細胞膜損傷程度較輕，抗氧化能力較強。楊秀娟（2006）在研究苜蓿根莖與抗寒性的關(guān)系時指出，根莖中SOD 酶活性隨溫度降低呈先升后降變化趨勢。本研究中，越冬初期各品種SOD 活性增加迅速， 且品種間SOD 酶活性差異較大，如龍牧801 和公農(nóng)2 號的SOD 活性最高； 隨脅迫加劇，SOD 酶活性有所降低但仍維持較高水平， 說明抗氧化酶活性與品種遺傳特性有關(guān)， 保護酶活力持久性能體現(xiàn)品種抗寒性（Brouwer 等，2000）。 越冬期不同苜蓿相對電導(dǎo)率隨溫度降低呈現(xiàn)增加趨勢，凍脅迫下，以賽迪和皇后相對電導(dǎo)率較高。 苜?？购耘c低溫下細胞膜透性存在一定關(guān)聯(lián)， 抗寒品種可通過降低細胞膜透性以減輕傷害，進而增強根系耐寒能力，反之則非抗寒品種細胞膜透性增大， 相對電導(dǎo)率升高（王運濤等，2012）。 抗寒性越高的品種，其根系內(nèi)游離脯氨酸、可溶性糖、蛋白含量與SOD 活性在冷凍脅迫下顯著高于其他品種。據(jù)此，越冬期根系內(nèi)含物含量與活性的變化是鑒別品種抗寒性強弱的有效手段，經(jīng)隸屬函數(shù)評定得出龍牧801、公農(nóng)2 號和草原3 號為強抗寒品種。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，隨地溫降低，根系內(nèi)游離脯氨酸、可溶性糖、蛋白含量和SOD 活性呈先升后降的變化，丙二醛和相對電導(dǎo)率則呈上升趨勢。抗寒性強的品種根系內(nèi)含物的含量和活性在低溫下顯著高于其他品種。簡言之，越冬期根系內(nèi)含物含量與活性的變化是鑒定品種抗寒性強弱的有效手段， 依此排列的品種抗寒強弱順序依次為： 龍牧801＞公農(nóng)2 號＞草原3 號＞皇后＞賽迪。