葉有明， 廖政達(dá) ， 韋佳汝， 韋 華， 唐玉梅

（1.廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西 來賓 546199；2.廣西三江縣吉龍農(nóng)業(yè)科技開發(fā)責(zé)任有限公司，廣西 柳州 545500）

茶酒是以茶葉、 蔗糖和水為主要原料釀制而成的具有保健功能的酒（周丹丹等，2010），既具有茶的清香還具有抗氧化、抗菌消炎等作用（胡桂萍等，2016）。研究發(fā)現(xiàn)，茶酒釀造的副產(chǎn)物茶酒糟中仍然含有茶多酚、茶多糖、茶皂素、茶蛋白等較多的營養(yǎng)成分（羅發(fā)美等，2020）。茶蛋白是一種天然的植物蛋白，主要存在于植物細(xì)胞中（王威威等，2022）。 在茶蛋白中非水溶性蛋白約為80%，其中含有80%谷蛋白、13%醇溶性蛋白質(zhì)和少量球蛋白、白蛋白（陸晨，2012）。由于茶蛋白具有溶解性、起泡性、乳化性等較好的理化性質(zhì)以及抑菌性、抗氧化性等生理活性，可有效地抑制腐敗菌活性（王洪新等，2005），因此可作為天然的飼糧添加劑，在禽畜飼養(yǎng)中廣泛應(yīng)用。

目前， 非水溶性蛋白質(zhì)提取的方式主要有酶法、復(fù)合法和堿液浸提法（金紅等，2017；李永富等，2015；羅紅玉等，2010）。 其中利用堿液浸提茶酒糟中的蛋白質(zhì)是最傳統(tǒng)的方法， 堿性溶液對茶酒糟中蛋白質(zhì)的氫鍵具有破壞作用， 其可使蛋白質(zhì)的溶解性增加（譚曉妍等，2018），提高提取時(shí)蛋白質(zhì)的溶出。 酶法提取蛋白質(zhì)，條件比較溫和，能夠使得與蛋白質(zhì)相連的物質(zhì)水解， 提高蛋白質(zhì)的提取率（李圓圓等，2013）。 復(fù)合法采用微波、超聲波、酶法等結(jié)合提取茶渣中蛋白質(zhì)，極大增加了蛋白質(zhì)提取率（陳仕學(xué)等，2015）。本文以蒸餾茶酒酒糟為原料， 采用恒溫水浴振蕩輔助堿法提取茶酒糟中蛋白質(zhì)， 并對提取得到的茶蛋白進(jìn)行抗氧化和抑菌性能研究， 為茶蛋白作為飼料在禽畜飼養(yǎng)中應(yīng)用提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料及儀器

1.1 材料與試劑 茶酒糟：廣西三江吉龍農(nóng)業(yè)科技有限公司。菌種：大腸桿菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，學(xué)院保藏菌種。 氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉、甲醛、乙酰丙酮、硫酸銨、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、硫酸鉀、硫酸、95%乙醇：西隴科學(xué)股份有限公司；水楊酸、對硝基苯酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯基：合肥巴斯夫生物科技有限公司，所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：鶴壁市華泰儀器儀表有限公司，粉碎機(jī)：永康市紅太陽機(jī)電有限公司，水浴恒溫振蕩器：杭州旌斐儀器科技有限公司，可見分光光度計(jì)：北京北分瑞利分析儀器有限公司，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器生產(chǎn)廠，臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，電熱恒溫真空干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司，傅里葉紅外光譜儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 茶酒糟中蛋白質(zhì)的提取工藝流程 茶酒糟→烘干→粉碎→過篩（100 目）→熱水浸提→過濾去除上清液→茶酒糟水浴振蕩堿液提取→6000（r/min） 離心10 min→收集上清液→消化→測定吸光度值。

2.2 茶蛋白質(zhì)的測定 茶蛋白質(zhì)參照《GB5009.5-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》（2017）進(jìn)行測定。吸取試樣溶液和試劑空白溶液各2 mL 于25 mL 的具塞比色管中， 分別加入4 mL顯色劑和4 mL 乙酸鈉-乙酸緩沖溶液，混勻。 在100 ℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min， 將比色管取出冷卻后，置于1 cm 比色皿中，在最大吸收波長400 nm處測定其吸光度值， 利用所測得的氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算得到的提取液中氮的含量，按下式計(jì)算茶酒糟中蛋白質(zhì)的提取量。

式中：C 為提取液中氮的含量，μg；m 提取液的質(zhì)量，g；V1為提取液體積，mL；V2消化液體積，mL；V3為試樣溶液總體積，mL；V4試樣溶液體積，mL；1000 為換算系數(shù)；6.25 為轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2.3 茶蛋白質(zhì)提取的單因素試驗(yàn)

2.3.1 料液比對茶蛋白質(zhì)提取量的影響 稱取1 g茶酒糟粉末分別置于5 個(gè)干燥的錐形瓶中， 固定NaOH 溶液的濃度為0.3 mol/L， 料液比為1：15、1：20、1：25、1：30、1：35（g/mL），在50 ℃恒溫水浴中振蕩10 min，提取茶蛋白質(zhì)，研究料液比對茶蛋白質(zhì)提取量的影響。

2.3.2 浸提時(shí)間對茶蛋白質(zhì)提取量的影響 稱取1 g 茶酒糟粉末分別置于5 個(gè)干燥的錐形瓶中，固定料液比為1：25（g/mL），NaOH 溶液濃度為0.3 mol/L，在50 ℃恒溫水浴中分別振蕩6、8、10、12 min 和14 min，提取茶酒糟中蛋白質(zhì)，研究浸提時(shí)間對茶蛋白質(zhì)提取量的影響。

2.3.3 浸提溫度對茶蛋白質(zhì)提取量的影響 稱取1 g 茶酒糟粉末分別置于5 個(gè)干燥的錐形瓶中，料液比為1：25（g/mL），堿液濃度0.3 mol/L，在溫度分別為30、40、50、60 ℃和70 ℃的恒溫水浴中振蕩12 min，提取茶酒糟中蛋白質(zhì)，研究浸提溫度對提取茶蛋白質(zhì)的影響。

2.3.4 堿液濃度對茶蛋白質(zhì)提取量的影響 稱取1 g 茶酒糟粉末分別置于5 個(gè)干燥的錐形瓶中，固定料液比1：25（g/mL），按照NaOH 溶液濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 和0.5 mol/L，在60 ℃的恒溫水浴中振蕩12 min， 提取茶酒糟中蛋白質(zhì)，研究堿液濃度對茶蛋白質(zhì)提取量的影響。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)從茶酒糟中提取蛋白質(zhì)的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間和堿液濃度四個(gè)因素為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素， 以茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量為響應(yīng)值進(jìn)行工藝條件優(yōu)化。 采用Design-Expert8.0.6 軟件，設(shè)計(jì)Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)方案，本試驗(yàn)選取四因素三水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)， 響應(yīng)面安排表如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5 紅外光譜檢測

2.5.1 茶蛋白質(zhì)樣品的制備 將茶蛋白提取液濃縮后，置于電熱恒溫真空干燥箱24 h，將其烘干研磨，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 紅外光譜檢測方法 參照李圓圓（2013）的方法對茶蛋白進(jìn)行紅外表征，觀察其特征基團(tuán)。

2.6 茶酒糟中蛋白質(zhì)抗氧化活性測定

2.6.1 茶酒糟中蛋白質(zhì)提取液的制備 把最佳條件下制備得到提取液，在60 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至原來體積的1/2 后， 置于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2 羥自由基清除率測定 參照謝雨尋等（2022）的方法，按下式計(jì)算茶蛋白對羥自由基的清除率：

式中：Ao為空白組對照；Ai為樣品組的吸光度；Aj為樣品本底的吸光度。

2.6.3 DPPH 自由基清除率測定 參照參照謝雨尋等（2022）的方法，按下式計(jì)算茶蛋白對DPPH·的清除率：

式中：Ao為空白組對照；Ax為樣品組的吸光度；Ay為樣品本底的吸光度。

2.7 抑菌試驗(yàn) 抑菌試驗(yàn)主要參照蘇巧玲等（2022）的方法并作修改。選取大腸桿菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3 種菌種作為試驗(yàn)材料，采用牛津杯法測試茶蛋白的抑菌活性， 采用湯強(qiáng)等（2018）的方法配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

茶蛋白提取液經(jīng)濃縮，烘干。準(zhǔn)確稱取一定量的茶蛋白粗提物， 使用50 mL 的無菌水溶解，采用連續(xù)稀釋法，配制成8 組不同濃度（0、0.1559、0.3117、0.6233、1.2467、2.4934、4.9867、9.9734 mg/mL）溶液，紫外燈下滅菌30 min。

取直徑為6 mm 的濾紙片， 放到不同濃度的茶蛋白溶液浸泡2 h， 貼于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，使其充分?jǐn)U散后，放入培養(yǎng)箱，在37 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌水浸濕的濾紙片作空白，測量各抑菌圈直徑（趙建英等，2022）。 每個(gè)菌種分別在不同的茶蛋白濃度條件下做平行試驗(yàn)3 個(gè)，結(jié)果取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 茶蛋白質(zhì)提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比對茶蛋白質(zhì)提取量的影響 由圖1可知，在料液比為1：15 ～1：35（g/mL）時(shí)，茶蛋白質(zhì)的提取量隨NaOH 溶液體積的增大而增加，料液比1：25 （g/mL) 時(shí)蛋白質(zhì)提取量達(dá)到最大為17.93（mg/g）。 料液比在1：25（g/mL）之后，由于茶酒糟中的蛋白質(zhì)充分溶出， 蛋白質(zhì)的提取量不會(huì)隨之增多。因此，可以初步確定從茶酒糟中提取蛋白質(zhì)的最佳料液比為1：25（g/mL）。

圖1 料液比對茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量的影響

3.1.2 浸提時(shí)間對茶蛋白質(zhì)提取量的影響 由圖2 可知，浸提時(shí)間在6 ～12 min 時(shí)，隨著浸提時(shí)間的不斷延長，茶蛋白質(zhì)的提取量增加明顯，主要是由于浸提的是茶酒糟表面易溶出的谷蛋白和醇溶蛋白，在水浴振蕩時(shí)間為12 min 時(shí)，蛋白質(zhì)提取量達(dá)最大值18.60 mg/g。 當(dāng)時(shí)間過長時(shí)，部分蛋白在溶液中長時(shí)間受熱發(fā)生水解（梁杰等，2020），導(dǎo)致提取率下降。 因此，可以初步選擇12 min 為蛋白質(zhì)提取的最佳浸提時(shí)間。

圖2 浸提時(shí)間對茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量的影響

3.1.3 浸提溫度對茶蛋白質(zhì)提取量的影響 由圖3 可知， 水浴振蕩浸提茶蛋白質(zhì)的溫度在30 ～60 ℃時(shí)，隨著水浴振蕩溫度的不斷上升，茶酒糟中蛋白質(zhì)的提取量也不斷增加。 在浸提溫度為60 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取量最大可達(dá)19.10 mg/g，溫度過高提取率會(huì)下降， 原因是溫度過高蛋白質(zhì)會(huì)變性（梁杰等，2020），所以溫度升高，將不利于蛋白質(zhì)的提取。 因此，可以初步確定60 ℃為茶酒糟中蛋白質(zhì)提取的最佳浸提溫度。

圖3 浸提溫度對茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量的影響

3.1.4 堿液濃度對茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量的影響由圖4 可知， 在NaOH 溶液濃度為0.1 ～0.3 mol/L時(shí)， 茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量隨NaOH 溶液濃度的增大而增加，在堿液濃度為0.3 mol/L 時(shí)，蛋白質(zhì)提取量達(dá)最大值19.4 mg/g。 由于在較高濃度堿液的情況下，蛋白質(zhì)易變性和水解，造成蛋白質(zhì)分子之間肽鍵的斷裂， 導(dǎo)致提取液中的非蛋白物質(zhì)增多（林彬彬等，2018）。從而導(dǎo)致茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量減少。 因此，選擇NaOH 溶液濃度0.3 mol/L為最佳堿液濃度。

圖4 堿液濃度對茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量的影響

3.2 茶酒糟中蛋白質(zhì)提取的工藝優(yōu)化

3.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 使用Design-Expert8.0.6 軟件對表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 建立二次回歸方程，得到自變量料液比（A）、浸提時(shí)間（B）、浸提溫度（C）和堿液濃度（D）與響應(yīng)值茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=-45.06+7.32A+11.92B+9.73C+124.93D-8.15×10-3AB-2.85×10-3+0.98AD+5.09×10-3BC-1.83BD+1.53CD-0.15A2-0.48B2-0.08C2-366.33D2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)茶酒糟中蛋白質(zhì)提取試驗(yàn)結(jié)果

對上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)， 其結(jié)果見表3 所示。 表3 為各變量對茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量的方差分析， 從表中可看出模型P＜0.001，即此模型為極顯著， 失擬項(xiàng)P =0.0581＞0.05 為不顯著，說明該模型預(yù)測與實(shí)際試驗(yàn)相符，可用于茶酒糟中蛋白質(zhì)的提取。 在響應(yīng)面中復(fù)合相關(guān)系數(shù)R2=0.9581，R2Adj=0.9036， 表明該設(shè)計(jì)模型與試驗(yàn)的擬合程度良好。 各變量的F 值能反映出對茶酒糟中蛋白質(zhì)的提取量的影響強(qiáng)度，F(xiàn) 值越大對提取量的影響越大， 各變量對蛋白質(zhì)提取量的顯著性順序?yàn)榻釡囟龋玖弦罕龋窘釙r(shí)間＞堿液濃度， 因此可知浸提溫度直接影響蛋白質(zhì)提取量的大小，而料液比、浸提時(shí)間和堿液濃度對蛋白質(zhì)提取量的影響較小。

表3 茶酒糟中蛋白質(zhì)提取量響應(yīng)面回歸方程的方差分析

3.2.2 響應(yīng)面圖形分析 依據(jù)響應(yīng)面圖形分析的原則，判斷各因素間交互作用的顯著性，需結(jié)合圖形和方差分析表的結(jié)果綜合判斷。由圖5 可知，圖中（a）為料液比和浸提時(shí)間的交互作用，由圖可知料液比和浸提時(shí)間的曲線平緩，在設(shè)定的范圍內(nèi)，其結(jié)果變化幅度不大， 說明這兩個(gè)因素對蛋白質(zhì)的提取量影響較小。圖中（b）為料液比和浸提溫度的交互作用， 由圖可知料液比對提取量的影響不顯著，而浸提溫度的坡面比較陡峭，有明顯的上升和降低的趨勢， 說明浸提溫度對蛋白質(zhì)提取量的影響較大， 與方差分析表中浸提溫度對蛋白質(zhì)提取量影響為顯著的分析結(jié)果一致。 圖（c）（d）（e）（f）與上述分析一致，表明浸提溫度對蛋白質(zhì)提取量影響顯著，而料液比、浸提時(shí)間和堿液濃度對蛋白質(zhì)提取量的影響不顯著。

圖5 各因素交互作用

3.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過軟件分析， 可得從茶酒糟中提取蛋白質(zhì)的最佳試驗(yàn)條件為料液比為1：25 g/mL，堿液濃度0.3 mol/L，在60 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩12 min。 應(yīng)用最佳試驗(yàn)條件，進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)檢測提取液中蛋白含量， 得到蛋白質(zhì)提取量平均值為24.62 mg/g， 與預(yù)測最優(yōu)模型結(jié)果24.12 mg/g 相近，證明此試驗(yàn)方法重復(fù)性好，適用于茶酒中蛋白質(zhì)的提取。

3.3 紅外光譜檢測結(jié)果 由圖6 可知， 在3413 cm-1處有強(qiáng)吸收峰， 為O-H 伸縮振動(dòng)峰；2939 cm-1處有弱吸收峰，為C-H 拉伸引起；2312、2126 cm-1和1410 cm-1均為蛋白質(zhì)肽鍵或氨基中的NH 鍵形成的吸收峰，其中2312 cm-1處為蛋白中亞甲基和次甲基彎曲振動(dòng)的二倍頻區(qū)，2126 cm-1處為蛋白或氨基中N-H 鍵伸縮振動(dòng)或彎曲振動(dòng)的倍頻區(qū)和合頻區(qū)，1410 cm-1處為肽鍵和氨基中N-H 鍵伸縮振動(dòng)一倍頻區(qū)。 所以可以推斷出該樣品中有N-H 鍵和肽鍵等基團(tuán)，該樣品與蛋白質(zhì)中主要基團(tuán)一致。

圖6 茶酒糟中蛋白質(zhì)紅外光譜圖

3.4 茶蛋白質(zhì)抗氧化試驗(yàn)

3.4.1 茶蛋白質(zhì)對羥自由基清除效果 由圖7 可知，蛋白質(zhì)濃度為1 ～5 mg/mL 時(shí)，其對羥自由基的清除效果逐漸增強(qiáng)，最高時(shí)清除率可達(dá)26.6%。

圖7 茶酒糟中蛋白質(zhì)對羥自由基清除效果

3.4.2 茶酒糟中蛋白質(zhì)對DPPH·清除效果 由圖8 可知， 蛋白質(zhì)濃度為1 ～5 mg/mL 時(shí)， 其對DPPH·的清除效果逐漸增強(qiáng)， 最高時(shí)清除率為34.0%。

圖8 茶酒糟中蛋白質(zhì)對DPPH·清除效果

考慮到提取液本身色素影響，由于顏色較深不便于測定吸光度值， 所以未繼續(xù)測定在5 mg/mL之后濃度的提取液對羥自由基的清除效果， 但從茶蛋白質(zhì)對羥自由基和DPPH·的清除效果來看，茶蛋白質(zhì)具有一定抗氧化活性。

3.5 抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表4 可知，茶蛋白對不同菌種具有較強(qiáng)的抑菌能力， 因?yàn)槌瞬璧鞍拙哂幸欢ǖ囊志芰ν猓?茶酒糟提取得到的蛋白質(zhì)中含有茶多酚， 茶多酚也具有抑菌能力 （魏漢等，2022）。茶蛋白對不同菌種的抑菌效果與菌種的類型和提取液濃度有關(guān)， 對不同菌種的抑菌能力大小依次為大腸桿菌＞表皮葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌。 茶蛋白提取液對三種供試菌的最小抑制濃度分別為0.3117、0.6223、1.2467 mg/mL，其對細(xì)菌的抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。

表4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳提取工藝：NaOH 溶液濃度為0.3 mol/L，料液比為1：25（g/mL），60 ℃的水浴中振蕩12 min，在此條件下茶酒糟中蛋白質(zhì)的最大提取量為24.62 mg/g。 （2）對茶酒糟中提取的蛋白質(zhì)粗制品掃描紅外光譜， 可以推斷出該樣品中有N-H 鍵和肽鍵等基團(tuán)，該樣品與蛋白質(zhì)中主要基團(tuán)一致。（3）將從茶酒糟中提取出來的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)，當(dāng)茶蛋白提取液濃度為5 mg/mL 時(shí)，其對DPPH·和羥自由基清除率分別為34.0%和26.6%，表明茶蛋白具有一定的抗氧化性。 （4）抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶蛋白對大腸桿菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都有抑制作用， 抑菌效果與菌種的類型和提取液濃度有關(guān)， 抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。