錢 玉，劉 帥，金 龍，孫 美，顏 玲，劉長虹，董保磊,*，鄭 磊,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230031；2.洽洽食品股份有限公司，安徽合肥 230031）

堅果富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，是重要的膳食補(bǔ)充食品[1]。近年來我國堅果及相關(guān)產(chǎn)業(yè)規(guī)模增長迅速，已經(jīng)位列休閑食品首位。巴旦木是薔薇科植物巴旦杏Amygdalus communisL.的成熟種子[2-3]，在我國也被俗稱為薄殼杏仁、巴旦杏、扁桃等[4]。巴旦木含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素類、多酚類化合物和不飽和脂肪酸等，具有調(diào)節(jié)人體血糖與血脂，改善人體腸道菌群等有益的功效[5]。隨著巴旦木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及消費(fèi)量的逐年增加，其產(chǎn)品的品質(zhì)也受到了消費(fèi)者更多的關(guān)注。油脂含量豐富的巴旦木在采收、貯藏和加工等過程中易受光照、氧氣等因素的影響而發(fā)生氧化酸敗并伴隨哈敗味[6-7]。巴旦木氧化程度的加劇不僅嚴(yán)重破壞了其獨(dú)特的口感和風(fēng)味，降低了營養(yǎng)價值，甚至可能對消費(fèi)者的健康產(chǎn)生危害，導(dǎo)致食品安全問題。因此對巴旦木的氧化程度進(jìn)行快速且精準(zhǔn)的檢測是提升堅果產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價值和保障食品安全的重要手段。目前國內(nèi)外針對巴旦木等油性堅果氧化程度的檢測方法主要有感官評價，理化指標(biāo)檢測，以及儀器分析檢測等[8]。然而上述方法多存在缺陷，例如感官評價耗時長，主觀性強(qiáng)等，評價結(jié)果往往受測評人員自身因素影響。國標(biāo)法通過測定油性堅果的過氧化值和酸價等理化指標(biāo)檢測來判定其氧化程度，存在操作繁瑣耗時，有機(jī)試劑用量大且檢測靈敏度低等問題?；跉庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用等儀器分析方法可以用于測定油性堅果的氧化程度，然而目前與巴旦木氧化程度相關(guān)的特征性揮發(fā)成分仍然不明確[9]；此外氣相色譜等儀器分析方法也具有檢測過程繁瑣、檢測成本昂貴且專業(yè)性要求高等不足，因而限制了其在巴旦木等油性堅果氧化程度快速檢測中的應(yīng)用。

拉曼光譜是光子的一種非彈性散射現(xiàn)象，即入射光中的光子會與待測物質(zhì)的分子發(fā)生相互作用，部分反射光子的頻率會發(fā)生變化。通過拉曼光譜可以獲得待分析物質(zhì)的指紋圖譜，進(jìn)而對分子結(jié)構(gòu)等信息進(jìn)行分析[10]。然而普通拉曼光譜的信號非常微弱，因而限制了其在實(shí)際樣品檢測中的應(yīng)用。近年來表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）因具有光譜信息豐富、靈敏度高、檢測響應(yīng)迅速等顯著優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于分析傳感、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等眾多領(lǐng)域[11-12]。因此，利用SERS 技術(shù)實(shí)現(xiàn)油性堅果氧化程度的快速測定是保障其品質(zhì)安全的一種高效的技術(shù)手段[13]。目前有報道表明，堅果所含有的油脂及其氧化產(chǎn)物類物質(zhì)的拉曼散射截面低，這在很大程度上限制了通過直接測定樣品拉曼信號的方式來判定油性堅果的氧化程度[14-15]。因此，亟需建立一種基于新型增強(qiáng)基底的SERS 方法實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確且高效的油性堅果氧化程度的鑒別方法。針對目前適用于油脂樣品的SERS 基底存在的種類少、制備復(fù)雜且成本高等問題。

本研究開發(fā)一種基于表面配體交換的方法以實(shí)現(xiàn)將水熱法合成的金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）轉(zhuǎn)相到甲苯溶液，制備出油溶性AuNPs。配體輔助的轉(zhuǎn)相策略是一種制備適用于非水相基質(zhì)SERS 基底的新型高效的手段，基于該策略構(gòu)建的SERS 檢測方法也逐漸應(yīng)用于食品中有害化合物的檢測。Xing 等[16]通過還原法制備了檸檬酸保護(hù)的Au@AgNPs，在油胺配體輔助下轉(zhuǎn)相制備出油溶性的納米粒子用作SERS 基底，實(shí)現(xiàn)了結(jié)晶紫的高靈敏檢測。Li 等[17]利用水熱還原法合成銀納米粒子（Silver nanoparticles，AgNPs），AgNPs 在十八烷基胺輔助下于正己烷-水界面形成納米膜可用于食品中Hg2+的痕量檢測。Zhang 等[18]研究表明聚4 乙烯基吡啶可以促進(jìn)AuNPs 在水-氯仿界面共組裝成納米膜SERS 基底，可以用于食品中多種抗生素殘留檢測?；谏鲜龅难芯拷Y(jié)果，油溶性AuNPs可作為有效的增強(qiáng)基底用于油脂的原位SERS 檢測。本研究基于油溶性AuNPs 基底所建立的SERS方法可以實(shí)現(xiàn)巴旦木氧化程度的快速檢測，結(jié)合PCA分析法可以實(shí)現(xiàn)不同氧化程度樣品的快速分類，可為巴旦木等油性堅果的品質(zhì)控制供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的巴旦木 洽洽食品有限公司，采購自美國加州，-20 ℃冰箱中放置備用；甲苯、乙醇、石油醚（沸點(diǎn)30～60 ℃）、氯金酸、檸檬酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十八烷硫醇 分析純，TCI 化學(xué)試劑有限公司。

ATR3110 便攜式拉曼光譜儀 廈門奧普天成有限公司；Tecnai G2 F20 場發(fā)射高分辨透射電鏡 美國FEI NanoPorts 公司；SU5000 場發(fā)射掃描電鏡日本日立公司；Zetasizer Nano ZS 激光粒度儀 英國Malvern Instruments 公司；精密型電子天平 德國Sartorius 公司；微量可調(diào)移液器 德國Eppendorf公司；5425R 型離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；集熱式加熱磁力攪拌器 德國IKA 公司；渦旋混合器海門其林貝爾有限公司；Milli-Q 超純水儀 Millipore 公司；Evolution 紫外可見分光光度計 美國Thermo-Fisher 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水溶性AuNPs 的制備 采用經(jīng)典的“水熱還原法”制備平均尺寸為40 nm 的水溶性球形AuNPs[19]，具體步驟如下：將3.0 mL 的檸檬酸鈉溶液（濃度35.0 mmol/L）和1.0 mL 的氯金酸溶液（25.0 mmol/L）依次加入到100.0 mL 沸騰的超純水中，持續(xù)加熱并攪拌30 min 后，得到呈酒紅色的溶液并攪拌并自然冷卻至室溫，最終獲得平均粒徑為40 nm 的水溶性AuNPs。制備的AuNPs 表面由檸檬酸鈉配體穩(wěn)定，其納米形貌和分散性等特征通過透射電鏡和粒度分析儀等進(jìn)行表征鑒定。

1.2.2 油溶性AuNPs 的轉(zhuǎn)相制備 本研究中通過借助配體交換策略實(shí)現(xiàn)將檸檬酸鈉配體穩(wěn)定的水溶性AuNPs 轉(zhuǎn)化為十八胺配體穩(wěn)定的油溶性AuNPs[20-21]。具體轉(zhuǎn)相制備步驟如下：將制備的水溶性AuNPs 溶液與十八胺的甲苯溶液（1.0 mmol/L）以5:1 的體積比混合；混合液劇烈渦旋振蕩3 min 后靜置至溶液分層，水相中AuNPs 會轉(zhuǎn)移到油相的甲苯溶液中。分離并收集轉(zhuǎn)移后的油相AuNPs 溶液，以上所有的操作均在室溫條件下進(jìn)行。

1.2.3 巴旦木樣品的處理及拉曼光譜測定油脂氧化程度

1.2.3.1 樣品處理 北美當(dāng)季新鮮的巴旦木與室溫儲藏9、11、13、15 和17 個月的5 組巴旦木實(shí)際樣品均由洽洽公司提供，將新鮮的巴旦木放置在溫度為60 ℃的恒溫恒濕箱中進(jìn)行加速氧化處理。參照GB 5009.227-2016《食品中過氧化值的測定》中的方法提取60 ℃加速氧化巴旦木和5 組巴旦木實(shí)際樣品的油脂，并測定60 ℃加速氧化巴旦木油脂的過氧化值。

1.2.3.2 拉曼光譜條件 拉曼信號采集條件參數(shù)：激光功率為25 mW，溫度為25 ℃，積分時間為30 s，掃描次數(shù)為1 次，掃描范圍為200～2500 cm-1。常規(guī)拉曼信號采集方法：取20 μL 巴旦木油脂加入石英微孔板中，調(diào)整拉曼光譜儀的激光頭高度至合適信號強(qiáng)度后固定并進(jìn)行測定，采集每個樣品的拉曼光譜。油脂的表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）信號采集方法：巴旦木油脂與油相AuNPs 的體積比、孵育溫度、孵育時間經(jīng)優(yōu)化后選擇適宜的實(shí)驗(yàn)條件采集油脂的SERS 光譜信號；其他條件同常規(guī)拉曼信號采集方法一致。

1.2.3.3 SERS 檢測條件的優(yōu)化 為獲得SERS 檢測巴旦木油脂的最佳性能，本研究對巴旦木油脂與油相AuNPs 的體積比、孵育溫度、孵育時間三個實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。為優(yōu)化巴旦木油脂與油相AuNPs的體積比，將新鮮的巴旦木油脂與油相AuNPs 以1:1、2:1、3:1、4:1、3:2、4:3 的體積比例混合，50 ℃水浴1 h，采集油脂的SERS 信號，以1655 cm-1處SERS強(qiáng)度為指標(biāo)得到油脂與油相AuNPs 的最佳體積比。為優(yōu)化巴旦木油脂與油相AuNPs 的孵育溫度，新鮮的巴旦木油脂與油相AuNPs 以3:2 的體積比混合，分別于40、45、50、55、60 ℃水浴中孵育1 h，采集油脂的SERS 信號，以1655 cm-1處SERS 強(qiáng)度為指標(biāo)得到油脂與油相AuNPs 的最佳孵育溫度。為優(yōu)化巴旦木油脂與油相AuNPs 的孵育時間，新鮮的巴旦木油脂與油相AuNPs 以3:2 的體積比混合，于50 ℃分別孵育0.5、1、1.5、2、2.5 h，采集油脂的SERS 信號，以1655 cm-1處SERS 強(qiáng)度為指標(biāo)得到油脂與油相AuNPs 的最佳孵育時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

油脂的過氧化值平行測定5 次，油脂常規(guī)拉曼光譜和SERS 光譜每個樣品均采集20 條，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 2020 Pro 軟件進(jìn)行檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，得到拉曼光譜信號值與加速氧化時間之間的線性關(guān)系。使用Matlab R2016a軟件進(jìn)行拉曼光譜的主成分分析（Principal component analysis，PCA）數(shù)據(jù)處理和擬合，建立巴旦木新鮮度的分析模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 金納米粒子的制備與轉(zhuǎn)相

基于金納米材料的增強(qiáng)基底具有穩(wěn)定性高、增強(qiáng)效果好等優(yōu)點(diǎn)，可以有效提高SERS 的檢測靈敏度[22-23]。AuNPs 因具有易于制備、成本低、性質(zhì)穩(wěn)定等突出的優(yōu)勢，是目前應(yīng)用最為廣泛的一類SERS基底[24-25]。甲苯等有機(jī)相中通過還原法制備的金納米粒子通常粒徑小于10 nm，過小粒徑的金納米粒子不利于拉曼信號的有效增強(qiáng)，因此難以用作SERS 檢測的基底[26]。因此，本研究通過水熱還原法制備水溶性的AuNPs，進(jìn)一步采用配體交換的轉(zhuǎn)相策略實(shí)現(xiàn)較大金納米粒子從水溶液到非極性有機(jī)相的成功轉(zhuǎn)相[20-21]。

本研究選用甲苯作為有機(jī)油相，采用長鏈脂肪胺類化合物—十八烷基胺作為油相配體進(jìn)行金納米粒子的轉(zhuǎn)相。AuNPs 的轉(zhuǎn)相過程如圖1 所示，水熱還原法制備AuNPs 的表面由檸檬酸配體包覆，可以良好地分散于水溶液。十八烷基胺的甲苯溶液加入AuNPs 溶液后，會與水溶液之間形成明顯的界面。十八烷基胺分子會通過界面向水溶液中進(jìn)行擴(kuò)散，且十八烷基胺分子與AuNPs 的親和力要高于檸檬酸分子與AuNPs 的親和力。AuNPs 與檸檬酸配體是通過靜電作用力相結(jié)合，而含有氨基的化合物可以取代AuNPs 表面的檸檬酸根，AuNPs 與十八烷基胺的相互作用力高于與檸檬酸根的靜電作用力[20,27]。因此在上述的界面擴(kuò)散過程中，十八烷基胺分子會取代AuNPs 表面原有的檸檬酸分子，使得AuNPs 改變?yōu)殡娭行缘氖杷砻妫M(jìn)而可成功分散于非極性的甲苯溶液中。

圖1 基于配體交換策略的油相AuNPs 制備流程示意圖Fig.1 Preparation of oil-phase AuNPs based on ligand exchange strategy

如圖2a 所示的SEM 結(jié)果表明，水熱還原法制備AuNPs 的粒徑分布均勻；圖2b 所示的TEM 結(jié)果表明其平均粒徑約為40 nm。動態(tài)光散射測試（DLS）表明水溶液中AuNPs 的平均水合粒徑為49 nm，與電鏡表征的結(jié)果相一致（圖2c）。UV-vis吸收光譜測試表明水溶液中AuNPs 的最大吸收波長為522 nm。通過水熱還原法制備的金納米粒子具有良好的水溶性，但是難以用于油相樣品的SERS檢測。因此本研究首先合成水相的AuNPs，通過油相配體交換的轉(zhuǎn)相策略實(shí)現(xiàn)了油相的AuNPs 的制備。從圖2d 中TEM 圖像中可發(fā)現(xiàn)，相轉(zhuǎn)移后得到的油相AuNPs 分散性良好，粒子的納米形貌未發(fā)生明顯的變化，上述結(jié)果表明配體交換介導(dǎo)的轉(zhuǎn)相過程不會明顯地改變金納米粒子的分散性與形貌尺寸，可以開展進(jìn)一步的研究。UV-vis 吸收光譜表明相轉(zhuǎn)移后的油相AuNPs的最大吸收波長從522 nm 紅移到528 nm（圖2e）。相轉(zhuǎn)移過程中，AuNPs 表面負(fù)電荷的檸檬酸鈉配體被電中性的十八烷基胺分子所取代，進(jìn)而導(dǎo)致了上述吸收光譜紅移現(xiàn)象的發(fā)生。綜上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用配體交換的策略，可以成功地將水溶液中的AuNPs轉(zhuǎn)相到非極性甲苯中。轉(zhuǎn)相后的AuNPs 表面被十八烷基胺分子包覆，使其可以很好地分散到油脂中，進(jìn)而起到拉曼增強(qiáng)基底的作用。

2.2 油相金納米粒子SERS 增強(qiáng)信號評價

為了驗(yàn)證油相溶液中油溶性AuNPs，可以通過表面配體交換的方式來實(shí)現(xiàn)對待測物的拉曼信號增強(qiáng)，本研究中采用十八烷基硫醇作為模式SERS 信號分子開展評估試驗(yàn)，并進(jìn)一步測定油溶性AuNPs 的SERS 增強(qiáng)性能。十八烷基硫醇分子可以通過表面配體交換的方式，以形成金-巰等形式結(jié)合到AuNPs的表面[28-29]。本研究通過測定十八烷基硫醇的SERS 信號增強(qiáng)，來計算油溶性AuNPs 的增強(qiáng)因子[30]，進(jìn)而評估其增強(qiáng)性能。根據(jù)文獻(xiàn)報道，金-巰鍵的特征性拉曼信號位于300 cm-1至350 cm-1范圍內(nèi)[31-32]。圖3a 是用甲苯稀釋后濃度為10 μmol/L 的十八烷基硫醇溶液的常規(guī)拉曼光譜與SERS 光譜，從圖中的結(jié)果中可知，常規(guī)拉曼光譜中難以分辨出十八烷基硫醇中巰基所對應(yīng)的拉曼信號峰?；谟拖郃uNPs 作為增強(qiáng)基底的十八烷基硫醇的SERS 光譜中344 cm-1處的特征峰對應(yīng)AuNPs 表面形成的金-巰鍵。從光譜結(jié)果的對比可知，十八烷基硫醇分子中巰基基團(tuán)經(jīng)過表面增強(qiáng)以后信號強(qiáng)度比常規(guī)拉曼有顯著的增加，表明油相AuNPs 可以用于增強(qiáng)基底用于油脂樣品的檢測。為了評估SERS 檢測信號的可重復(fù)性，在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中收集50 個隨機(jī)點(diǎn)處十八烷基硫醇的SERS光譜。如圖3b 和圖3c 所示，對344 cm-1處峰值強(qiáng)度的統(tǒng)計分析表明相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.86%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的可重復(fù)性。綜上，經(jīng)過轉(zhuǎn)相制備的油溶性AuNPs 可以作為良好的增強(qiáng)基底，實(shí)現(xiàn)油相溶液中待測物的原位SERS 檢測。

圖3 油相AuNPs 的SERS 增強(qiáng)信號與重復(fù)性Fig.3 SERS enhanced signal and repeatability of oil phase AuNPs

2.3 加速氧化過程中巴旦木油脂拉曼光譜信號的特征變化

在常規(guī)理化分析中，過氧化值是鑒定油性堅果氧化程度的重要指標(biāo)之一，反映了油脂初級氧化產(chǎn)物的濃度。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19300-2014：《堅果與籽類食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，巴旦木等油性堅果樣品的過氧化值要低于0.08 g/100 g（以提取油脂計）。加速氧化過程中巴旦木的過氧化值變化情況如圖4a 所示，隨著加速氧化時間的延長，其過氧化值總體呈上升趨勢。實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，即使經(jīng)過60 ℃條件下存儲30 d，巴旦木樣品的過氧化值仍然只達(dá)到0.04 g/100 g，其值仍小于國標(biāo)限量。但是上述氧化后的巴旦木出現(xiàn)了嚴(yán)重的酸敗氣味，不符合國標(biāo)規(guī)定的感官要求。因此上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在實(shí)際應(yīng)用中，過氧化值等單一的理化指標(biāo)難以有效且真實(shí)地反映巴旦木的氧化程度變化。巴旦木油脂氧化過程中，樣品的拉曼信號的變化主要由氧化導(dǎo)致的油脂結(jié)構(gòu)的變化而引起。圖4b 是新鮮的巴旦木油脂與加速氧化30 d 后的巴旦木油脂的常規(guī)拉曼光譜（因結(jié)果圖相似度較高，部分天數(shù)未呈現(xiàn)）。由圖4b可知巴旦木油脂的拉曼信號峰主要集中于700～1800 cm-1的范圍內(nèi)，巴旦木油脂的特征拉曼光譜區(qū)域主要包含：860 cm-1附近處的拉曼峰，對應(yīng)-（CH2）n-基團(tuán)的伸縮振動；968 cm-1處的拉曼峰，對應(yīng)的反式雙鍵（=C-H）彎曲振動；1264 cm-1處的順式雙鍵（=C-H）彎曲振動；1302 及1442 cm-1處的亞甲基（-CH2-）彎曲振動；1655 cm-1處的順式雙鍵（C=C）伸縮振動；1747 cm-1處的酯鍵（-C=O）伸縮振動等[33]。

圖4 60 ℃加速氧化巴旦木油脂的過氧化值和常規(guī)拉曼光譜Fig.4 Oxidation value and conventional Raman spectra of almonds oil at 60 ℃

在巴旦木油脂的氧化程度加深的過程中，油脂中不飽和脂肪酸分子的順式雙鍵發(fā)生異構(gòu)化并趨向于通過分子重排成為穩(wěn)定的反式雙鍵構(gòu)型[34]。如圖4b所示，隨著氧化程度的加深，巴旦木油脂中不飽和脂肪酸的反式雙鍵（=C-H）在967 cm-1處拉曼信號強(qiáng)度較弱且信噪比偏低；順式雙鍵δ（=C-H）在1264 cm-1處的拉曼信號強(qiáng)度變化無明顯規(guī)律， 1747 cm-1（-C=O）處峰強(qiáng)度在氧化過程中發(fā)生的變化較微小。在加速氧化過程中，巴旦木油脂不飽和鍵被破壞是氧化過程中最典型的變化，即順式雙鍵在減少。巴旦木油脂的拉曼光譜信號測定過程中，樣品的提取試劑及測試時的條件等會引起測試信號的差異。本研究選擇1655 cm-1處的順式雙鍵（C=C）作為特征拉曼信號，選擇波長較為接近的酯鍵的1747 cm-1作為參比信號，用I1655/I1747值表征巴旦木油脂的氧化程度隨加速氧化時間的變化。圖4c 結(jié)果表明I1655/I1747值的整體趨勢是隨著加速氧化天數(shù)的增加而降低，說明總不飽和脂肪酸在降低。此外由圖4b 中的結(jié)果也可知，常規(guī)拉曼光譜存在基線噪聲信號較大，信噪比較低且與氧化程度相關(guān)的特征峰變化不顯著等不足，限制了其在精確監(jiān)測油脂氧化程度中的應(yīng)用。

2.4 基于SERS 光譜的巴旦木氧化程度的快速檢測

巴旦木油脂與油溶性AuNPs 的體積比、孵育溫度以及時間會對油脂的SERS 強(qiáng)度產(chǎn)生影響，如圖5所示以油脂1655 cm-1處特征峰的SERS 強(qiáng)度為指標(biāo)優(yōu)化檢測條件。圖5a 顯示了油脂與油溶性AuNPs的體積比對SERS 強(qiáng)度的影響，油脂體積越大，SERS強(qiáng)度有所降低，增加AuNPs 的體積SERS 強(qiáng)度增加，當(dāng)油脂與油相AuNPs 的體積比為3:2 時，SERS強(qiáng)度最大，因此選定油脂與油相AuNPs 的體積比為3:2。油脂與油溶性AuNPs 的孵育溫度和時間也會影響到SERS 強(qiáng)度，如圖5b 和圖5c 所示。溫度升高，SERS 強(qiáng)度增加，50 ℃時達(dá)到峰值，溫度繼續(xù)增加SERS 強(qiáng)度降低，50 ℃是最佳的孵育溫度。在油脂與油溶性AuNPs 的孵育0.5 h 時SERS 強(qiáng)度最大，增加孵育時間SERS 強(qiáng)度會降低，0.5 h 是最佳的孵育時間。綜上所述，油脂與油溶性AuNPs 的體積比為3:2，孵育溫度是50 ℃，孵育時間是0.5 h。

圖5 SERS 檢測條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of conditions for SERS measurement

為了嘗試解決常規(guī)拉曼光譜的不足，本研究通過使用油溶性AuNPs 作為增強(qiáng)基底，測定巴旦木油脂的SERS 信號。巴旦木油脂氧化程度相關(guān)的SERS 信號的主要通過氧化的脂肪類分子與油溶性AuNPs 表面的十八胺分子發(fā)生配體交換引發(fā)。油溶性AuNPs 可以與巴旦木油脂均勻地混合，在原位SERS 檢測過程中，巴旦木油脂的氧化產(chǎn)物吸附到油相AuNPs 的表面，通過測定SERS 信號的強(qiáng)弱可以得出油脂的氧化產(chǎn)物的相對含量，從而精確地反映出巴旦木油脂的氧化程度。圖6a 是加速氧化后巴旦木樣品油脂的SERS 光譜。由于AuNPs轉(zhuǎn)相中采用甲苯為溶劑，所以空白的油溶性AuNPs在1002 cm-1處存在甲苯分子的特征拉曼峰。在巴旦木油脂的反式雙鍵特征峰（968 cm-1）附近，甲苯分子的存在具有較大的干擾作用，因此在分析樣品的SERS 光譜時舍棄了968 cm-1位置的拉曼特征峰。

圖6 60 ℃加速氧化巴旦木油脂和5 組實(shí)際樣品的SERS 分析結(jié)果Fig.6 SERS analysis results of accelerated oxidation of oil of almonds at 60 ℃ and 5 groups of actual samples

本研究同樣采用內(nèi)參法對巴旦木油脂的SERS特征峰的信號強(qiáng)度變化進(jìn)行分析，采用1655 cm-1處的順式雙鍵（C=C）作為特征拉曼信號，選擇波長較為接近的酯鍵的1747 cm-1作為參比信號，用相對強(qiáng)度來分析巴旦木油脂的SERS 光譜，進(jìn)而評價分析巴旦木的氧化程度。圖6b 中展示了采用SERS 光譜監(jiān)測巴旦木樣品的油脂在加速氧化過程中的變化趨勢，I1655/I1747值隨著氧化程度的增加而顯著降低，歸因于油脂中順式結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸分子的消耗。為了驗(yàn)證SERS 檢測方法在快速判定巴旦木氧化程度的能力以及闡明SERS 信號強(qiáng)度和氧化程度之間的關(guān)系，將60 ℃加速氧化不同時期巴旦木油脂的SERS 的相對強(qiáng)度和其加速氧化時間進(jìn)行了曲線擬合，得到了擬合模型（圖6b），R2達(dá)到0.98，顯示出良好的擬合效果并可用于評價巴旦木的氧化程度?，F(xiàn)對洽洽公司庫存的5 組不同儲藏時間的巴旦木實(shí)際樣品提取油脂后測定SERS 光譜，如圖6c 所示，5 個巴旦木實(shí)際樣品SERS 光譜的I1655/I1747值，與其實(shí)際儲藏時間具有良好的相關(guān)性，表明該方法可以用于實(shí)際巴旦木樣品氧化程度的初步判定。

本研究進(jìn)一步使用SERS 光譜結(jié)合PCA 分析用于巴旦木氧化程度的快速判定和分類。PCA 可以在光譜數(shù)據(jù)分析中用于轉(zhuǎn)換原始的多維冗余光譜變量，可以有效消除重疊和不相關(guān)的信息。實(shí)驗(yàn)中首先通過收集來自不同加速氧化天數(shù)的巴旦木油脂的10 組SERS 光譜進(jìn)行PCA 分析。圖6d 中的分析結(jié)果表明，采用3D 分析圖進(jìn)行PCA 識別分析可以實(shí)現(xiàn)良好的效果，通過前三個主成分可以很好地實(shí)現(xiàn)對新鮮巴旦木以及分別加速氧化6、15、24 及30 d 的巴旦木樣品的分類，前三個主成分的貢獻(xiàn)率分別是79.21%、19.97%和0.52%。針對上述5 個巴旦木實(shí)際樣品的PCA 分析同樣取得了良好的分類效果，可對5 個不同儲藏時間的樣品進(jìn)行分類，前三個主成分的貢獻(xiàn)率分別是93.47%、4.44%和0.78%。上述研究結(jié)果表明借助SERS 光譜和PCA 分析方法可成功實(shí)現(xiàn)不同氧化程度的巴旦木樣品的分類分析。

堅果的新鮮度是其營養(yǎng)與品質(zhì)的一個重要影響因素，目前堅果新鮮度的檢測方法包括感官檢測、理化檢測和快速檢測等[35]，然而這些檢測技術(shù)存在操作繁瑣及檢測靈敏度低等問題。與肉類產(chǎn)品、水果等相比，巴旦木等堅果具有油脂含量高、水分含量低且微生物不易滋生等特點(diǎn)，因此其各成分的氧化程度是其新鮮度的最重要體現(xiàn)。巴旦木等堅果的不飽和脂肪酸等容易發(fā)生氧化，因此采用油脂的氧化程度來表示巴旦木等堅果新鮮度是一種便捷且準(zhǔn)確的方法[36]。本研究建立的基于SERS 光譜的巴旦木油脂氧化程度快速檢測方法可以實(shí)現(xiàn)對巴旦木新鮮度的快速判定，為保障堅果的品質(zhì)安全提供了新的技術(shù)手段。

3 結(jié)論

本研究成功建立了基于SERS 光譜的巴旦木氧化程度快速檢測方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。針對適用于油脂類食品的拉曼增強(qiáng)基底存在的種類較少、制備復(fù)雜等不足，本研究采用表面配體交換的策略，成功實(shí)現(xiàn)了將水熱法合成的AuNPs 轉(zhuǎn)相到甲苯溶液。本研究制備的油溶性AuNPs 可作為有效的增強(qiáng)基底用于油脂類樣品的原位SERS 檢測，同時具有成本低、制備過程簡潔等顯著優(yōu)勢。基于油溶性AuNPs 基底所建立的SERS 方法可以實(shí)現(xiàn)巴旦木氧化程度的快速檢測，建立了SERS 信號的相對強(qiáng)度（I1655/I1747）和氧化天數(shù)之間的分析模型，為定性分析巴旦木的氧化程度提供了一種新方法。同時本研究結(jié)合使用PCA 分析方法對不同氧化程度的巴旦木進(jìn)行快速分類，結(jié)果表明了不同氧化時間樣品之間區(qū)分較好。綜上所述，本研究表明基于SERS 光譜的快速檢測方法展示了對巴旦木氧化程度的快速檢測和分類的能力，為食品快速檢測提供了新的思路。