于德涵，黎 莉，蘇 適

（綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化 152061）

黃酮是植物細胞中一種重要的次級代謝產(chǎn)物，能夠消除人體內(nèi)自由基，有較強抗氧化、抗衰老的功能[1]，在抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂等方面也頗有功效[2]。近年來，還有黃酮抗腫瘤的相關報道[3]。黃酮的傳統(tǒng)提取一般采用有機溶劑提取法，溶劑多選擇甲醇、乙醇、乙酸乙酯等。有機溶劑易揮發(fā)、不易降解，而且有毒，既污染環(huán)境，還會因溶劑殘留等問題限制黃酮提取物在醫(yī)藥、食品等領域的應用。

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）的概念最早于2003 年提出，是由氫鍵供體（hydrogen-bond donor，HBD）和氫鍵受體（hydrogen-bond acceptor，HBA）以一定比例組成的均相液態(tài)混合物[4]。目前，可采用熱混合、真空蒸發(fā)、冷凍干燥或研磨等多種方法[5]制備DESs，操作簡便，對設備要求低。DESs 有熔點低（低于組成DESs 的單一組分）、熱穩(wěn)定性好、化學穩(wěn)定性高、揮發(fā)量低的特性，又因其組分結(jié)構(gòu)中存在的羥基或羧基能與提取物之間形成氫鍵，增加目標化合物的提取率、保持其穩(wěn)定性，故可用于多酚、黃酮、多糖、蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)的提取。天然低共熔溶劑（natural deep eutectic solvents，NADESs）又稱綠色低共熔溶劑，是由初級代謝產(chǎn)物等天然成分組成的DESs，其被認為是天然存在于生物體中的、獨立于水和脂質(zhì)之外的第三個液相[6]。根據(jù)合成NADESs 時使用的化合物，可以將NADESs 分為離子液體型、中性型、中性酸型、中性堿型和含氨基酸NADESs 五大類[7]。目前，氯化膽堿（ChCl）是NADESs 中應用最多的HBA，它可以和多種HBD如尿素、醇、羧酸、糖等化合物組成NADESs。另外，甜菜堿和L-Pro 也常用作HBA。NADESs 的無毒性、可生物降解和可重復使用等和“綠色”有關的優(yōu)勢使其較其它DESs 在活性物質(zhì)提取領域有著更廣泛的應用，有望替代傳統(tǒng)有機溶劑解決天然化合物萃取過程中面臨的問題。

筆者查閱了近5 年國內(nèi)、外使用NADESs 萃取黃酮的相關文獻，并對其進行綜述。文章還詳細分析了影響萃取效率的各種因素，以期能為篩選出安全而高效地萃取黃酮類化合物的工藝提供參考。

1 NADESs 在萃取黃酮類化合物的應用

1.1 黃酮和黃酮醇

小分子多元醇基NAESs 常用于提取弱極性黃酮和黃酮醇類化合物。Nguyen 等[8]以芹菜籽為研究對象，篩選出甜菜堿/丙二醇NADES 作為提取芹菜素和木犀草素的最佳溶劑。同樣，Hang 等[9]也發(fā)現(xiàn)該NADES 在萃取野菊花芹菜素和木犀草素時，萃取效果顯著高于其它待選NADESs。Wang 等[10]發(fā)現(xiàn)ChCl/1,4 丁二醇在提取槐花中蘆丁、槲皮素等6 種黃酮醇化合物時具有顯著優(yōu)勢。Mansur 等[11]開發(fā)了一套不需要其它輔助技術(shù)，也不用任何揮發(fā)性溶劑提取蕎麥芽中葒草素、異葒草素等黃酮的新工藝，從20 種潛在NADESs 中篩選出最有利的HBA/HBD組合為ChCl/三乙二醇。Yu 等[12]建立了基于醇基NADESs 的高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)用于皂莢刺李屬素、異牡荊黃素和槲皮素等的提取和分離。小分子多元醇作為HDB 能夠給NADESs 體系提供足夠的羥基形成氫鍵，又不會像糖基一樣因空間位阻影響目標物質(zhì)與NADESs 的結(jié)合，所以小分子多元醇基NADESs 在弱極性黃酮提取方面的表現(xiàn)通常優(yōu)于其它類型NADESs。

另外，酸型NADESs 也常用于木犀草素、槲皮素等黃酮和黃酮醇的萃取。Ivanovi?等[13]首次報道了使用乳酸基NADESs 萃取蓍草中生物活性物質(zhì)，采用分光光度法和色譜法從提取物中鑒別出兩種黃酮成分（木犀草素、芹菜素）。Kaltsa 等[14]驗證了以氨基酸作為HBA 的多種NADESs，發(fā)現(xiàn)Gly/乳酸最有利于接骨木蘆丁的提取。Ciardi 等[15]證實酸型NADES（甜菜堿/羥基乙酸）對洋蔥皮中槲皮素的提取率比甲醇提取高2 倍多。Guo 等[16]發(fā)現(xiàn)三元NADES 氯化膽堿/乳酸/乙二醇對車前山奈酚和槲皮素的提取效果遠高于傳統(tǒng)溶劑，并發(fā)展出一套集提取、檢測、回收為一體的新工藝。Luo 等[17]以不同月份的杜仲葉為提取對象，依據(jù)黃酮類有效成分的提取量確定了理想的NADESs 提取試劑，經(jīng)條件優(yōu)化后明顯提高了蘆丁、白果苷等成分的提取率。Li等[18]為提高果渣的附加值，使用NADESs 對果渣中殘留的蘆丁和槲皮素進行提取，并對提取的蘆丁轉(zhuǎn)化率進行了測定。其發(fā)現(xiàn)對蘆丁和槲皮素提取率最高的兩種NADESs 分別是ChCl/乙二醇和ChCl/草酸，提取的蘆丁可以快速轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率可達8.72%/min，轉(zhuǎn)化率近乎100%。另有研究結(jié)果表明，ChCl/乳酸作為蘋果渣中槲皮素和蘆丁的提取溶劑也是可行的，提取率顯著高于傳統(tǒng)乙醇溶劑[19]。Brahmi-Chendouh等[20]發(fā)現(xiàn)檸檬酸基NADESs 能有效提取洋薊木犀草素和木犀草素糖苷。酸基NADESs 雖然能有效提取黃酮和黃酮醇類化合物，但酸性環(huán)境會促使黃酮苷中糖苷鍵水解，降低黃酮苷的提取量。

1.2 二氫黃酮

橙皮苷和柚皮苷主要存在蕓香科植物柑橘和柚子的成熟果皮中，甘草素是甘草的主要活性成分之一，它們都是典型的二氫黃酮類化合物。Liu 等[21]發(fā)現(xiàn)，使用甜菜堿/乙二醇對枳殼中蕓香柚皮苷、柚皮素、橘皮苷和新橘皮苷的提取較甲醇作為提取溶劑更有效。Toprak??等[22]建立了一種環(huán)保且低成本的回收檸檬皮中柚皮苷和橙皮苷的方法，目標產(chǎn)物的回收效率高，且能保持一定的抗氧化活性，為提高食物殘渣附加值提供了一條新思路。為了篩選出提取青柑中活性成分的最適合溶劑，Li 等[23]共制備了30個NADESs 進行實驗，發(fā)現(xiàn)使用Pro/尿素NADES在提取柚皮素和橙皮苷時提取率最高，并在此基礎上建立了產(chǎn)物回收程序，回收后的NADESs 可再次用于提取。Yu 等[24]報道了ChCl/1,3-丁二醇提取甘草中黃酮效果最好，而Shikov 等[25]和Xing 等[26]分別用同品種、不同產(chǎn)地甘草分離甘草素和甘草酸，都得到了ChCl/乳酸NADESs 是提取最佳組合的這一結(jié)論。使用NADESs 提取二氫黃酮類化合物，目標物與NADESs 通過氫鍵結(jié)合，保護目標物不被氧化，所以不但其提取率顯著高于甲醇、乙醇或水等溶劑，而且提取產(chǎn)物的抗氧化性也明顯增強。對于酸性的甘草酸等二氫黃酮，選擇pK 值與其接近的乳酸制成酸型NADESs 進行提取，效果更為顯著[25-26]。

1.3 異黃酮

異黃酮最早發(fā)現(xiàn)于豆科植物中，具有解酒護肝、降血糖、調(diào)血脂、緩解絕經(jīng)性骨質(zhì)疏松、心臟保護等作用[27]。Shang 等[28]檢測了20 種不同極性的NADESs 在提取鷹嘴豆芽中異黃酮的潛力和有效性，以4 種異黃酮的提取量、總黃酮提取量和抗氧化活性綜合評價提取效率，并通過響應面法優(yōu)化了最佳提取工藝。Duru 等[29]建立了一種高效環(huán)保的從葛根中提取大豆黃素、染料木素和葛根素等異黃酮的萃取工藝，并證實了NADESs 能有效降低異黃酮的降解。Huang 等[30]從ChCl、甜菜堿和L-Pro 三種常見HBA組成的25 種NADESs 中篩選出最適于提取葛根素的溶劑，該溶劑顯示出高于水和甲醇的葛根素提取能力，提取物的生物利用度也高。影響異黃酮萃取的最重要因素是NADESs 的含水量和萃取溫度，通過調(diào)整溶液的含水量改變NADESs 的粘度和極性能顯著影響異黃酮的萃取率；溫度在超過70 ℃后，異黃酮會因熱分解導致產(chǎn)率下降。

1.4 查爾酮

查爾酮是其它各類黃酮的前體物質(zhì)，具有抗胃潰瘍、抗脫發(fā)、抗病毒和抗腫瘤活性[31]。近年對查爾酮的提取研究主要以紅花素為主。為了探討紅花素的綠色提取工藝，提高紅花活性物質(zhì)的生物利用度，Tong 等[32]構(gòu)建了超聲輔助NADESs 提取紅花中活性成分的新工藝，最優(yōu)條件下的羥基紅花黃素A 和脫水紅花黃素B 提取量均高于水提取法和甲醇提取法，而且其生物利用度也明顯優(yōu)于水提物。另有證據(jù)證明，超聲輔助NADESs 還能有效提取梔子果實中的紅花素，提取的紅花素具抗糖功效和DNA 保護作用[33]。紅花素具有高親水性，NADESs 的含水量變化對其萃取率沒有明顯影響，影響萃取效果的顯著因素是料液比和萃取溫度，結(jié)合超聲輔助提取，能明顯提高提取效率。

1.5 黃烷醇

兒茶素和表兒茶素互為同分異構(gòu)體，是從茶葉等植物中提取出的一種活性黃烷醇類成分，具有多種藥理作用。阮懌航等[34]構(gòu)建了使用NADESs 從鐵觀音茶中高效提取兒茶素的新工藝，篩選出的最佳NADES 是甜菜堿/乳酸組合，并發(fā)現(xiàn)實驗中幾種NADESs 對兒茶素的提取率都高于超純水提取法。Wang 等[35]以羅布麻葉茶為原料采用NADESs 提取活性成分，從17 種待選NADESs 中篩選出最佳溶劑為ChCl/乙酰丙酸，提取的活性成分經(jīng)HPLC 鑒定以兒茶素等黃酮類物質(zhì)為主。另有研究證實，使用ChCl/蘋果酸NADES 提取的山核桃皮活性物質(zhì)中，兒茶素是主要成分[36]。兒茶素的多羥基結(jié)構(gòu)導致其在中性或堿性環(huán)境中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，所以實驗用NADESs 中，酸性基NADESs 對兒茶素和表兒茶素等黃烷類化合物的提取率顯著高于其它NADESs。當NADESs 的pH 略低于兒茶素的pKa，兒茶素在溶液中處于中性狀態(tài)時更容易被提取。

1.6 花色素類

花色素類黃酮中以花青素及花青素糖苷的研究最為廣泛，可用于染料、醫(yī)藥、化妝品等多領域[37]。甲醇、乙醇是提取花青素最常用的試劑，但醇提取物存在熱穩(wěn)定性差、半衰期短等不足，NADESs 替代醇溶劑提取花青素以克服上述缺點成近年研究熱點。Bi 等[38]試驗了使用6 種NADESs 對桑葚花青素的提取效果，發(fā)現(xiàn)其提取量均高于酸化乙醇，其中尤以ChCl/乳酸提取效果最好。Maclean 等[39]首次開發(fā)出用NADES 提取藍靛果花青素的綠色萃取工藝，證實了使用D-（+）-麥芽糖/檸檬酸提取藍靛果花青素是可行的。Lin 等[40]報道了一種超聲-微波輔助NADESs 結(jié)合HPLC-MS 綠色提取及快速鑒定黑果腺肋花楸花青素的方法，證實了ChCl/甘油可用作萃取黑果腺肋花楸花青素的媒介。同樣，ChCl/甘油組合也被Zannou 等[41]用于提取藍薊花中花色素。Benvenutti 等[42]研發(fā)了一種NADESs 結(jié)合加壓液體快速萃取巴西漿果加工副產(chǎn)品中花青素的工藝，該工藝可以在12 min 內(nèi)快速完成萃取工作，大大增加了該類原料的附加值。越桔是最重要的花青素來源之一，Jovanovi?等[43]開發(fā)出基于NADESs 的越桔花青素提取工藝。結(jié)果表明，以ChCl/山梨醇NADES 提取的越桔花青素抗氧化性和抗菌性最好，穩(wěn)定性也更高。另外，該研究者還利用環(huán)糊精改善NADESs 提取性能，有效提高了野櫻桃花青素的得率[44]?；ㄇ嗨氐奶崛÷屎腿芤旱乃岫扔嘘P，酸型NADESs 能保護非酰基化的花青素不被降解，提高萃取效率；非酸基NADESs 能保護花色苷糖苷鍵不被分解，提高提取產(chǎn)物中花色苷的比例。使用NADESs 萃取花青素，萃取率普遍高于傳統(tǒng)溶劑，又因為花青素和NADESs之間的氫鍵對花青素的保護作用，使其穩(wěn)定性更好，抗菌、抗氧化能力也更高。

1.7 雙黃酮

原花青素是一種雙黃酮類化合物，其抗氧化性和清除自由基能力較花青素更強。張欣[45]設計了一套完整的超聲輔助NADESs 提取和純化黑果腺肋花楸原花青素的方法，并對提取物的抗氧化性和抗菌能力進行了檢測，檢測結(jié)果理想。為探索油茶籽殼高值化利用途徑，侯黔靈等[46]采用多種環(huán)保NADESs 提取原花青素，結(jié)果顯示實驗中有3 種NADESs 的原花青素提取率都優(yōu)于60%乙醇提取液，其中ChCl/檸檬酸表現(xiàn)最佳，經(jīng)條件優(yōu)化后油茶籽殼中原花青素提取率可達5.26%。另一份關于油茶果殼原花青素提取的研究中顯示，ChCl/草酸的提取效果更加讓人滿意，在微波輔助的條件下，原花青素提取量相當于70%乙醇提取量的3.22 倍[47]。周佳悅等[48]則報道了ChCl/丙三醇NADES（實驗未篩選酸型NADESs）可用于提取紅松皮原花青素，為紅松皮的綜合利用提供了一個新思路。原花青素的提取量依賴于NADESs的酸度，故多元醇基NADESs 的提取量常低于羧酸基NADESs。在常見酸型NADESs 提取實驗中發(fā)現(xiàn)，原花青素的提取量隨著提取介質(zhì)的酸度增加而增加。

1.8 總黃酮

NADESs 在生物總黃酮的提取方面也有很多應用。NADESs 被證實可用于紅花總黃酮的提取，溶劑選擇ChCl/乙二醇[49]。此外，該溶劑還同樣適用于萃取金錢草[50]、紅豆杉葉[51]、鐵皮石斛花[52]、紅棗[53]、玉米芯[54]和番石榴葉[55]總黃酮。而在另一項針對鐵皮石斛總黃酮提取的研究中發(fā)現(xiàn)，ChCl/乳酸才是最優(yōu)試劑[56]。同時，ChCl/乳酸也是綠茶總黃酮的最佳提取溶劑[57]。孫平等[58]證實，使用ChCl/1,4-丁二醇NADES 結(jié)合超聲法提取野菊花總黃酮是可行的。另一份野菊花總黃酮提取的文章中報告最佳提取溶劑是ChCl/尿素，總黃酮提取率是72.32%，較孫平報道的總黃酮提取率提高了18%[59]。有最新研究報告指出，ChCl/尿素NADES 結(jié)合微波輔助技術(shù)，對大棗總黃酮的提取率最高，并能有效延長產(chǎn)物在暗處的保存時間[60]。Zhang 等[61]以番薯葉為研究對象，考察了幾種NADESs 對總黃酮提取率的影響，提供了一種綠色高效的提取強抗氧化性和抗菌性黃酮的新思路。不同材料中黃酮類成分差異較大，故各最佳NADESs 中HBD 各不相同，但多以萃取容量較大的乙二醇為主；又因黃酮結(jié)構(gòu)中多含酚羥基，常顯酸性，所以以乳酸、蘋果酸等有機酸作HBD 的NADESs 也常用于總黃酮的萃取。

總體而言，NADESs 在天然黃酮類物質(zhì)萃取方面表現(xiàn)優(yōu)異，產(chǎn)物得率普遍高于傳統(tǒng)提取法[8,16]，尤其是在高效、環(huán)保、重復利用、保持和提高產(chǎn)物活性、提高產(chǎn)物可及性，以及有助于后續(xù)快速分析和檢測等方面顯示出極大的優(yōu)越性。上文中未能詳盡舉例與總結(jié)的內(nèi)容請見表1。

2 影響NADESs 提取黃酮類化合物的因素

一般來說，DESs 對植物中生物活性化合物的提取能力取決于其組成（HBA 和HBD 的類型、摩爾比）、DESs 的物理化學性質(zhì)（極性、pH、粘度和表面張力）和DESs 與目的物間的相互作用[18,28]等因素，DESs 的含水量和溫度又會直接影響其極性、pH、粘度和表面張力等性質(zhì)。

2.1 NADESs 的組成和摩爾比

DESs 的組成決定了共晶體系能否形成以及是否能穩(wěn)定存在。HBD 能提供的基團數(shù)目是影響DESs 形成的關鍵因素，如甘氨酸和乳酸組成的NADES，HBD/HBA≤3（摩爾比）時，常溫條件下不能形成液體，只有HBD/HBA≥5 時，才能形成穩(wěn)定的DES[15]。但是HBD/HBA 過大又會導致DES 體系中HBA 相對濃度不足，影響氫鍵網(wǎng)絡的形成。

DESs 是高粘溶劑，溶劑體系中氫鍵結(jié)構(gòu)越強，粘度也就越大。DESs 的高粘度會影響其與目標化合物的接觸，阻礙目標化合物在溶液中的傳質(zhì)，降低目標化合物的提取率，也會對產(chǎn)物回收造成麻煩，所以調(diào)整DESs 的粘度處于適當水平是提高萃取率的有效手段。另外，HBD 分子的大小和基團的位置關系也會影響DESs 的萃取效率。HBD 分子過大或者羧基/羥基的位置不合理，都會導致DESs 體系內(nèi)部產(chǎn)生更大的空間位阻，影響目的物與DESs 組分的相互作用，降低提取率[62]。一些黃酮化合物的萃取率還會受到NADESs 的pH 的影響，如花青素需要在低pH 條件下才能穩(wěn)定存在，所以萃取花青素時，HBD常選擇有機酸或酸化多醇，而尿素基NADESs 中花青素提取量幾乎為零[38]。

2.2 NADESs 的含水量

DESs 的高粘度不僅來自體系內(nèi)的范德華力、氫鍵和靜電相互作用，還受含水量的影響。水會與DESs 中組分形成氫鍵，導致組分間的作用力減弱，含水量的增加能降低DESs 的粘度，有利于目的物的提取。加水還會增強DESs 的表面張力，利于NADESs與植物基質(zhì)之間的相互吸引作用，使NADESs 與目的物之間形成氫鍵，提高目標物的溶解度[34]。但過量的水會破壞DESs 組分間的氫鍵，導致目標化合物提取效率低下。水還能調(diào)節(jié)DESs 的極性，根據(jù)“相似相溶”的原理，目的物在極性相近的NADESs 中溶出度更高。

2.3 NADESs 的溫度

溫度與DESs 的粘度負相關。高溫會誘導DESs體系內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)重組，削弱離子間的相互作用，降低DESs 粘度[63]；另外，溫度提高時，DESs 分子的運動性增強，促進了DESs 對介質(zhì)細胞的滲透，增強DESs 與目標化合物之間的相互作用[64]。這兩方面的作用都能促進目標化合物在DESs 中的溶解，但要注意溫度的提升對溫度敏感化合物的熱穩(wěn)定性的影響。

2.4 其它因素

萃取時間也會對萃取率產(chǎn)生一定影響。萃取時間不足時，目的成分不能充分溶出，延長提取時間，萃取率會提高；目的物基本溶出后，再繼續(xù)增加萃取時間，不會對萃取率產(chǎn)生顯著影響，還會因為萃取時間過長導致DESs 內(nèi)部能量積累，促使目的產(chǎn)物分解[55]。

固液比對萃取率的影響和DESs 的萃取能力有關。萃取溶劑用量少，目標化合物溶出不完全，影響收率；適當增加溶劑用量則有助于目標產(chǎn)物快速、充分地溶出；過多的溶劑量不但會導致大量非目標化合物的溶出，影響后續(xù)分析和純化，還會因為過分吸收DESs 能量（熱能、空化能）降低提取率[48]。

超聲、微波、高壓凈水等輔助提取手段也會影響黃酮化合物的提取率。通過空化效應、微波能量輻照、震動、高壓等方式，促進介質(zhì)細胞的破碎、加強DESs 的滲入能力和目標化合物的運動能力、降低DESs 的粘度，能有效減少萃取時間，提高萃取效率。輔助提取技術(shù)的條件如功率[10]、溫度[16]、壓力[42]等都會對最終的提取結(jié)果有影響。

3 結(jié)論與展望

自NADESs 概念被提出以來，其綠色特性受到各個領域的關注，成為綠色化學的研究熱點，尤其是在黃酮類活性物質(zhì)提取領域，因其成本低廉、環(huán)境安全、操作簡便、靈敏度高和選擇性好等特性被廣泛應用，擁有極大地取代傳統(tǒng)提取溶劑的潛力。

就當前而言，在看到NADESs 優(yōu)勢的同時，也要充分認識其在天然產(chǎn)物提取領域存在的問題：a.NADESs 的種類不夠豐富，HBA 和HBD 的選擇主要集有限的幾種化合物范圍內(nèi)；b.NADESs 的粘度高，限制了此溶劑的滲透和傳質(zhì)，對活性物質(zhì)的提取會產(chǎn)生不利影響；c.對NADESs 的安全性研究不足，如NADESs 對提取的天然產(chǎn)物活性的影響、其與提取物的協(xié)同效應、提取產(chǎn)物在人體內(nèi)的安全性和對人體代謝的影響以及NADESs 在自然環(huán)境中的完全降解性等方面仍有待深入；d.對NADESs 的溶劑化特性研究較少，對該溶劑規(guī)律性的變化認識不足。

未來，針對NADESs 在活性物質(zhì)萃取領域存在的問題，研究可以主要著眼以下幾個方面：a.擴大HBA 和HBD 的篩選范圍，開發(fā)合成對活性物質(zhì)提取能力更強的NADESs，增加NADESs 在物質(zhì)提取方面的應用范圍，尤其是在針對非熱門活性物質(zhì)的提取方面，更有待深度發(fā)掘；b.在超聲、微波等傳統(tǒng)輔助技術(shù)的基礎上，采用新型萃取輔助技術(shù)協(xié)同NADESs，進一步提高NADESs 對目標產(chǎn)物的提取效率，新型輔助技術(shù)應重點關注高壓、勻漿等更有放大潛力的技術(shù)；c.深入分析NADESs 的萃取性能，從分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、作用機制等不同層面揭示NADESs 在應用領域的變化規(guī)律；d.完善對NADESs和萃取產(chǎn)物的安全性評價方法，闡明NADESs 殘留對環(huán)境和人體安全性的影響，尤其是對產(chǎn)物的生物活性、生物毒性和人體內(nèi)代謝方面的影響。

隨著對NADESs 研究的不斷深入，這種可持續(xù)的綠色溶劑在生物活性物質(zhì)提取領域的應用必然愈來愈廣。當然，要使其成為“最佳新興溶劑”仍需要不斷探索，但前景必定光明。