木 慧， 楊申明， 王振吉， 朱曉娟， 陳華紅， 李昱嫻

（楚雄師范學(xué)院資源環(huán)境與化學(xué)學(xué)院，云南 楚雄 675000）

松子（pine nut）為松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物的種子，又名松實(shí)、果松子等。 松子在我國東北、西北和西南地區(qū)均有出產(chǎn)，是我國常見的一種堅(jiān)果（仲美橋等，2022）。我國每年出口松子仁上萬噸，出口量逐年在增加，但產(chǎn)品主要是以初加工的松仁為主。 目前松子的主要開發(fā)利用是松子仁、松子膜衣，而加工生產(chǎn)的大量副產(chǎn)品松塔、松子殼當(dāng)作垃圾丟棄，造成資源浪費(fèi)，影響了松子的綜合利用價(jià)值。

松子殼中主要含有萜類、木質(zhì)素、黃酮、維生素類、脂肪等化學(xué)成分，其中萜類、揮發(fā)油、脂肪酸等均具有重要生理活性（王智航等，2009）。 多酚（polyphenols） 是一類多羥基酚類化合物 （米智等，2022），具有較強(qiáng)的抗氧化、抗病毒和抗炎等活性（段宙位等，2021；Ward，2016；Martin，2015；Zhang，2014；Khan，2012），在治療心腦血管、調(diào)節(jié)血壓、 血脂等方面有重要生理作用（Asyakina，2021；Shan，2021； 蔣榮華等，2015；Saliu，2012）。Selani 等（2021）研究表明，葡萄皮多酚能夠有效抑制雞肉冷凍時(shí)期的脂質(zhì)氧化作用， 孫承峰等（2005） 研究表明， 蘋果多酚能夠抑制豬肉氧化作用。 同時(shí)，多酚可作為食品功能有效成分與其他抗氧化劑起到協(xié)同作用 （孔方南，2020； 陳程等，2017）。 植物多酚因具有許多生物活性，且來源廣泛、無副作用、攝入后易被腸道消化吸收等特點(diǎn)， 是一種應(yīng)用前景十分廣闊的飼料添加劑（張佳等，2022）。 因此，研究PNSP 提取，把PNSP用于飼料添加劑中， 對提高松子資源綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 松子：產(chǎn)自云南楚雄，經(jīng)楚雄師范學(xué)院鑒定為云南松子（落水松子）；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98.0%）、福林酚（分析純）：北京縈萊寶科技有限公司；DPPH 自由基：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；維生素C：西隴科學(xué)股份有限公司；N-1-萘乙二胺鹽酸鹽： 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他所用試劑均為AR：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備 SK8210HP 超聲波儀： 上?？茖?dǎo)超聲波儀器公司；UV-550 型分光光度計(jì)：上海元析儀器公司；SHZ ⅢA 循環(huán)真空泵： 鞏義市予華儀器公司；CP224C 電子天平：奧豪斯儀器（上海）公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試材料處理 松子→去仁→得松子殼→烘干（60 ℃）→粉碎→過60 目篩→松子殼粉末→石油醚（沸程30 ～60 ℃）浸泡24 h 后，用索氏回流提取5 h（脫脂）→烘干（60 ℃）→得去除色素和油脂的松子殼干粉（備用）。

1.2.2 PNSP 制備 稱取已去除色素和脫脂的松子殼干粉1.0 g，放入100 mL 三角錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)46%乙醇32 mL，在50 ℃超聲波中提取92 min 后，用真空泵抽濾，把得到的濾液定容在100 mL 容量瓶中，得PNSP 溶液。

在實(shí)踐中，一些法定評估業(yè)務(wù)的委托人為了使評估對象評出預(yù)期的高價(jià)或者低價(jià)，達(dá)到非法目的，往往對評估專業(yè)人員施加非法干預(yù)，操控評估結(jié)果，使評估活動(dòng)無法做到獨(dú)立、客觀、公正，無法起到防止國有資產(chǎn)流失、維護(hù)公共利益的作用。為此，本法第二十七條明確規(guī)定，委托人不得串通、唆使評估機(jī)構(gòu)或者評估專業(yè)人員出具虛假評估報(bào)告。根據(jù)本條規(guī)定，委托人或者其他組織、個(gè)人非法干預(yù)評估行為和評估結(jié)果的，評估專業(yè)人員有權(quán)拒絕。同時(shí)，根據(jù)本法第十九條的規(guī)定，委托人要求出具虛假評估報(bào)告或者有其他非法干預(yù)評估結(jié)果情形的，評估機(jī)構(gòu)有權(quán)解除合同。

1.2.3 PNSP 含量測定 采用福林酚法測定PNSP含量。 參考丁建英等（2018）的方法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.12825C-0.01004（R2=0.999 03）。 PNSP 提取量計(jì)算公式為：

式中：C 為多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為PNSP提取液定容的體積，mL；N 為稀釋的倍數(shù)；M 為松子殼干粉質(zhì)量，g。

1.2.4 PNSP 提取條件優(yōu)化

1.2.4.1 單因素試驗(yàn) 本研究探究了液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波提取時(shí)間、超聲波提取溫度4個(gè)因素對PNSP 提取量的影響， 考察了4 個(gè)影響因素的水平及其固定條件，試驗(yàn)條件如表1。

表1 超聲輔助乙醇提取PNSP 工藝單因素試驗(yàn)

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 為了獲得較佳的PNSP 提取條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0 軟件， 以A 代表液料比，B 代表乙醇體積分?jǐn)?shù)，C 代表超聲時(shí)間，D 代表超聲溫度，Y 代表PNSP 提取量為響應(yīng)值， 由Box-Behnken 中心組合進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

1.2.5 PNSP 抗氧化能力測定 將本試驗(yàn)提取的PNSP 配 制成（0.0007、0.0022、0.0037、0.0052、0.0067 mg/mL）5 種質(zhì)量濃度， 以維生素C 為對照，研究PNSP 抗氧化性。 PNSP 對DPPH·清除作用參考劉煥云等（2019）和胡棟寶等（2020）方法測定，PNSP 對·OH 清除作用參考金建等 （2020）方法測定，PNSP 對NO2-清除作用參考李志英等（2011）方法測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)做3 個(gè)平行樣，采用origin 2019b 軟件處理數(shù)據(jù)、作圖，用Design-Expert 8.0 軟件對試驗(yàn)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對PNSP 提取量的影響 由圖1 可知， 隨著液料比的不斷增大，PNSP 的提取量呈現(xiàn)出先增大后減小趨勢。 出現(xiàn)這種情況可能是溶劑增加， 松子殼粉與溶劑接觸面增大，PNSP 提取量增加。 當(dāng)溶劑用量增大到液料比30:1（mL/g）時(shí)，PNSP 提取量最大達(dá)到6.39 mg/g， 之后繼續(xù)增大液料比，PNSP 提取量呈減小趨勢。 這可能是當(dāng)液料比增大到30:1（mL/g）時(shí)多酚物質(zhì)已基本被提取出來， 再增大液料比會(huì)讓PNSP 中其他雜質(zhì)被溶解出來，且過大的液料比會(huì)造成溶劑浪費(fèi)，增加生產(chǎn)成本。 因此， 選用液料比為20:1、30:1、40:1（mL/g）做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 液料比對PNSP 提取量的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對PNSP 提取量的影響 由圖2 可知， 隨著所用乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，PNSP提取量也在不斷增大。 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大至45%時(shí)，PNSP 提取量達(dá)最大值為5.91 mg/g，之后隨著所用乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，PNSP 提取量減小。 推測是體積分?jǐn)?shù)為45%的乙醇與松子殼內(nèi)多酚極性相近，有利于PNSP 被提取出來，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，溶劑極性增大，葉綠素等雜質(zhì)更容易被釋放， 導(dǎo)致多酚提取量減小 （周濃等，2020）。 因此， 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、45%、50%做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對PNSP 提取量的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對PNSP 提取量的影響 由圖3可知， 隨著超聲提取時(shí)間的增加，PNSP 提取量增大。 當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)增加到90 min 時(shí)PNSP 提取量達(dá)到最大值為5.91 mg/g， 之后隨著超聲時(shí)間的增加，PNSP 提取量又減小。這可能是由于超聲提取達(dá)到90 min 時(shí)，PNSP 已大部分提出， 繼續(xù)增加超聲提取時(shí)間會(huì)加速多酚氧化分解。 因此，選擇超聲提取時(shí)間為80、90、100 min 做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 超聲時(shí)間對PNSP 提取量的影響

2.1.4 超聲溫度對PNSP 提取量的影響 由圖4可知，隨著超聲提取溫度的逐步升高，PNSP 提取量也逐步增大。 這可能是由于適當(dāng)?shù)某暅囟瓤梢约涌旆宇愇镔|(zhì)的溶出，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)PNSP 提取量達(dá)到最大值為6.04 mg/g；之后再繼續(xù)升高超聲溫度，這時(shí)PNSP 提取量逐步減小，這可能是由于超聲溫度太高導(dǎo)致多酚發(fā)生降解（胡會(huì)剛等，2020）。 因此，選擇超聲溫度為45、50、55 ℃做響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 超聲溫度對PNSP 提取量的影響

2.2 運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化工藝

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，以PNSP 的提取量為響應(yīng)值，在探究了單因素試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝優(yōu)化， 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3。

2.2.2 線性回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0 軟件對表3 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸擬合， 得到PNSP 提取量與各因素變量間的回歸方程為：Y=6.69+0.21A+0.22B+0.09C+0.072D -0.16AB +0.13AC +0.0075AD +0.058BC -0.042BD-0.09CD-0.40A2-0.37B2-0.35C2-0.25D2。

方差分析結(jié)果見表4，從表4 分析可知，回歸方程的模型P＜0.0001，表明模型達(dá)到了極顯著；失擬項(xiàng)P =0.9299＞0.05，表示差異不顯著，說明該模型與實(shí)際情況擬合度較好。 由R2=0.9690，R2Adj=0.9590， 說明該方程模型能夠較好反映真實(shí)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。

表4 試驗(yàn)方差分析

方程模型中一次項(xiàng)A、B 兩項(xiàng)對PNSP 提取量的影響達(dá)到極度的顯著（P＜0.0001），C 項(xiàng)達(dá)到了高度的顯著（P＜0.01），D 項(xiàng)達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）， 說明所考察的液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對PNSP 提取量影響程度較大， 超聲波提取時(shí)間次之，超聲波提取溫度影響最小。因此在PNSP 提取中要嚴(yán)格控制液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)； 兩兩交互項(xiàng)中AB 項(xiàng)高度顯著（P＜0.01），AC 項(xiàng)顯著（P＜0.05），說明本試驗(yàn)的液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)兩兩因素交互作用對PNSP 提取量的影響較大， 液料比和超聲時(shí)間次之； 各因素的二次項(xiàng)均對PNSP提取量有顯著影響。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 各因素交互作用對PNSP提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖如圖5 所示。 由響應(yīng)面圖分析可知，液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對PNSP 提取量影響顯著。 根據(jù)等高線圖的分析可知，液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)、 超聲提取時(shí)間之間的交互作用對PNSP 提取量影響顯著， 其他因素之間交互作用不夠明顯，與試驗(yàn)方差分析結(jié)果一致。

圖5 兩因素之間的交互作用對PNSP 提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖

利用Design-Expert 8.0 軟件對PNSP 提取工藝參數(shù)優(yōu)化，得到最優(yōu)提取條件為液料比（乙醇體積與松子殼粉末質(zhì)量之比）32.37:1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)46.27%、 超聲時(shí)間91.80 min、 超聲溫度50.47 ℃，在該條件下，得到PNSP 提取量的模型預(yù)測值為6.75 mg/g。 考慮到實(shí)際操作條件情況，將工藝條件的理論值修正為液料比32:1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)46%、超聲時(shí)間92 min、超聲溫度50 ℃，在上述試驗(yàn)條件下得到PNSP 提取量為 （6.72±0.32）mg/g，與模型預(yù)測值（6.75 mg/g）接近，說明本試驗(yàn)優(yōu)化的工藝條件可靠，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

2.3 PNSP 抗氧化性測定結(jié)果

2.3.1 PNSP 對DPPH·清除效果 由圖6 可知，清除DPPH·的能力隨著PNSP 質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)， 當(dāng)PNSP 質(zhì)量濃度為0.0067 mg/mL 時(shí)，對DPPH·清除率為50.46%， 與維生素C 的清除率（56.25%）接近，這表明PNSP 對DPPH·有一定的清除效果。

圖6 PNSP 對DPPH 自由基的清除效果

2.3.2 PNSP 對·OH 清除效果 由圖7 可知，清除·OH 的能力隨著PNSP 質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)PNSP 質(zhì)量濃度為0.0067 mg/mL 時(shí)，對·OH清除率為43.10%，與維生素C 清除率（50.47%）相比稍弱，但PNSP 仍然有一定的清除·OH 能力。

圖7 PNSP 對羥基自由基的清除效果

2.3.3 PNSP 對NO2- 的清除效果 由圖8 可知，在所試驗(yàn)的PNSP 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著PNSP 質(zhì)量濃度的增大清除NO2- 的能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)PNSP 質(zhì)量濃度為0.0067 mg/mL 時(shí)， 對NO2- 清除率為48.92%，與維生素C 清除率（55.04%）相比稍弱，但PNSP 也表現(xiàn)出一定的清除NO2-能力。

圖8 PNSP 對亞硝酸根離子的清除效果

3 結(jié)論

運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取PNSP，最佳提取工藝條件為液料比32:1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)46%，超聲時(shí)間92 min，超聲溫度50 ℃，在該條件下，得到PNSP 提取量為（6.72±0.32）mg/g，與預(yù)測值（6.75 mg/g）接近，說明該工藝條件可靠，可用于PNSP 提取。

抗氧化性試驗(yàn)表明，PNSP 質(zhì)量濃度在0.0007 ～0.0067mg/mL 內(nèi)，隨著PNSP 質(zhì)量濃度的增大，清除DPPH·、·OH 和NO2-的能力增強(qiáng)， 當(dāng)PNSP 質(zhì)量濃度為0.0067 mg/mL 時(shí)，DPPH·、·OH 和NO2-的清除率分別為50.46%、43.10%和48.92%，這說明PNSP 具有一定的抗氧化能力。 本研究結(jié)果可為PNSP 的提取及在飼料工業(yè)和動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考。