左雯騰 孟佳慧 盧孟柱 王留強(qiáng),2

（1.林木遺傳育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091；2.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京林業(yè)大學(xué) 南京 210037；3.省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 杭州 311300）

在植物次生生長中，植物激素起著重要的調(diào)節(jié)控制作用。其中，生長素是一類具有極性運(yùn)輸特性的天然植物內(nèi)源激素，普遍存在與低、高等植物中，處于植物生長發(fā)育的調(diào)控中心（Leyser, 2018）。它主要在莖尖、根尖及其它幼嫩組織合成后，以形態(tài)學(xué)上端向下端的極性運(yùn)輸方式成為長距離運(yùn)輸?shù)男畔y帶者，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的諸多生理過程，如維管組織形成、根伸長、不定根的形成、頂端優(yōu)勢、向性反應(yīng)、胚胎發(fā)生以及維持葉片和花的形態(tài)建成等（Bowmanet al., 2008）。研究表明，頂端分生組織產(chǎn)生的生長素不僅參與維管組織的分化和生長，還能促進(jìn)形成層細(xì)胞的增殖（Smetanaet al., 2019;Zhenget al., 2021）。Nilsson 等（2008）發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因雜交山楊（Populus tremula×P.tremuloides）中，生長素濃度的降低導(dǎo)致木質(zhì)部細(xì)胞分裂減少，同時還發(fā)現(xiàn)，生長素響應(yīng)基因PttHB8以及生長素/吲哚乙酸（Aux/IAA）家族基因的表達(dá)模式與生長素濃度有著密切的關(guān)系。Baba 等（2011）還發(fā)現(xiàn)雜交山楊在休眠期間由于形成層對生長素響應(yīng)能力降低，致使形成層細(xì)胞停止分裂。Hu 等（2022）揭示了生長素和赤霉素通過破壞DELLAARF7-AUX/IAA 三元復(fù)合體，釋放ARF7 對下游基因WOX4、PIN1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而協(xié)同調(diào)控形成層活動。因此，認(rèn)為一定濃度的生長素是形成層活動和次生維管組織發(fā)育所必須的，且發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

生長素在植物生長發(fā)育中通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來發(fā)揮重要的調(diào)控作用，而生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至少需要3個蛋白家族的成員進(jìn)行調(diào)控：生長素運(yùn)輸抑制劑F-box家族的TIR1/AFB 蛋白，生長素轉(zhuǎn)錄抑制因子Aux/IAA以及生長素應(yīng)答因子ARF（auxin response factor）（Yuet al., 2013）。其中，生長素受體是該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵因子，TIR1（transport inhibitor response 1）在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中首次被鑒定出來，是一個含有F-box 的蛋白質(zhì)（Rueggeret al., 1998）。在植物體內(nèi)，當(dāng)生長素濃度較低時，TIR1 不能與轉(zhuǎn)錄抑制因子Aux/IAA緊密結(jié)合，而Aux/IAA 與ARF 結(jié)合，抑制了ARF 的轉(zhuǎn)錄活性；當(dāng)生長素濃度較高時，細(xì)胞核中的IAA 與SCFTIR1復(fù)合體（泛素連接酶3）中的TIR1 結(jié)合，可以促進(jìn)SCFTIR1復(fù)合體與Aux/IAA 蛋白識別，形成SCFTIR1-Aux/IAA 復(fù)合體，啟動Aux/IAA 蛋白的泛素化過程，最終被26S 蛋白酶體降解，使ARF 啟動或抑制生長素下游響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控植物的生長發(fā)育（Salehinet al., 2015）。另 外，AFB1、AFB2、AFB3 與TIR1 具有類似的作用，都能夠作為生長素受體和生長素結(jié)合后，再與SCF 結(jié)合形成復(fù)合物，從而導(dǎo)致Aux/IAA 與之結(jié)合，參與生長素調(diào)節(jié)的反應(yīng)（Dharmasiriet al., 2005）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

銀腺楊雜種無性系84K 楊用于基因克隆、基因表達(dá)分析和遺傳轉(zhuǎn)化。所有植物材料均由中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并繁殖。楊樹組培苗于生根培養(yǎng)基（1/2 MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0.05 mg·L-1IBA，0.02 mg·L-1NAA，5 g·L-1瓊 脂 粉 和30 g·L-1蔗糖，pH 5.8～6.0）中培養(yǎng)，置于人工氣候室（25 ℃，16 h/8 h 光照/黑暗，50 μmol·m-2s-1光照強(qiáng)度）。生長20 天后，將其移栽至裝有營養(yǎng)土（土壤∶珍珠巖 =3∶1,V/V）的花盆（口徑×底徑×盆高=12 cm × 8 cm ×15 cm）中，置于同等條件下的培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。選取了培養(yǎng)60 天、生長狀態(tài)良好、且長勢一致的非轉(zhuǎn)基因84K 楊植株進(jìn)行PagFBL3基因組織表達(dá)特異性分析，所需的根、幼葉（頂端第3 片葉）、成熟葉（頂端第7 片葉）、1/2 株高處莖部、木質(zhì)部、維管形成層和韌皮部分別取自5 個獨(dú)立非轉(zhuǎn)基因84K 楊植株。選取了培養(yǎng)30 天、生長狀態(tài)良好、且長勢一致的轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因84K 楊植株，定量分析PagFBL3基因在不同基因型植株中的表達(dá)情況，所用的幼苗頂端第5片葉取自各5 個獨(dú)立植株。以上試驗(yàn)均重復(fù)取樣3 次，樣品液氮速凍置于-80 ℃保存用于RNA 提取。

本氏煙草（Nicotiana benthamiana）用于瞬時轉(zhuǎn)化。種子表面消毒后播撒于1/2 MS 固體培養(yǎng)基中，1 周后移栽至營養(yǎng)土（土壤與珍珠巖體積比為 3∶1）中，置于培養(yǎng)室（25 ℃，16 h/8 h 光照/黑暗）中繼續(xù)培養(yǎng)20 天后，取健康且平展的成熟葉片用于瞬時轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens），研究基因亞細(xì)胞定位。

1.2 載體和試驗(yàn)試劑

本研究所使用的中間載體pDNOR207、植物過表達(dá)載體pMDC32、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 及農(nóng)桿菌GV3101 菌種均由本實(shí)驗(yàn)室保存。PCR 引物合成和序列測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。高保真擴(kuò)增酶Primer STAR HS、普通擴(kuò)增酶PCR-Mix、定量試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit）、DNA marker 均為Takara 公司產(chǎn)品。膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒均為Omega 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析 利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析PagFBL3 蛋白的理化性質(zhì)。利用Phytozome 網(wǎng) 站（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）獲得擬南芥和毛果楊（Populus trichocarpa）生長素受體家族FBL 的氨基酸序列；同時，利用NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找獲取不同物種中FBL3 蛋白的氨基酸序列。利用DNAMAN和MEGA11 軟件分析FBL 蛋白氨基酸序列相似性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化樹采用鄰接法（neighborjoining method）構(gòu)建，節(jié)點(diǎn)旁的數(shù)字表示基于1 000 次重復(fù)次數(shù)的自展值（bootstrap）。

1.3.2 RNA 提取、cDNA 合成以及RT-qPCR 分析采用CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）法提取上述不同楊樹組織樣品的總RNA。利用RQ1 RNasefree DNase（Promega，Madison，WI，USA）處理總RNA去除DNA 污染。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit）合 成cDNA。使 用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa，Dalian，China），在實(shí)時熒光定量PCR 儀器Light Cycler 480（Roche Applied Science，Penzberg，Upper Bavaria，Germany）上進(jìn)行RT-qPCR 分析，以2 個84K 楊PagActin基因作為內(nèi)參，每個試驗(yàn)均設(shè)有3 次生物學(xué)重復(fù)和4 次技術(shù)重復(fù)，相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算。用于RT-qPCR 的基因特異性引物使用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)，其序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.3 基因克隆、載體構(gòu)建和84K 楊遺傳轉(zhuǎn)化 以84K 楊cDNA 為模板，利用特異性引物，擴(kuò)增PagFBL3基因編碼區(qū)序列，通過Gateway BP 反應(yīng)重組進(jìn)入中間載體pDNOR222 后，再通過Gateway LR 反應(yīng)亞克隆至終載體pMDC32，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化84K 楊（Liuet al., 2014）。簡言之，在含有200 mg·L-1特美汀和3 mg·L-1潮霉素的芽分化培養(yǎng)基上篩選抗性芽，隨后在含有同樣濃度抗生素的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。摘取幼苗葉片，提取基因組總DNA 和總RNA，利用PCR 技術(shù)對其進(jìn)行分子鑒定。

1.3.4 亞細(xì)胞定位分析 通過Gateway LR 反應(yīng)，將PagFBL3基因編碼區(qū)序列（不含終止子）亞克隆至pEarleyGate 101 載體上，構(gòu)建35S::PagFBL3-GFP 融合表達(dá)載體，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化瞬時侵染煙草葉片，黑暗培養(yǎng)48 h 后，在蔡司LSM510 共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）下觀察煙草表皮細(xì)胞內(nèi)的GFP 熒光信號。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因楊樹的表型鑒定和組織切片分析 選取20 天左右、生長狀態(tài)良好且長勢一致的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K 楊組培苗移栽至裝有營養(yǎng)土的塑料盆中，置于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)60 天后，對各個植株的株高、地徑和節(jié)間數(shù)進(jìn)行測定。每次試驗(yàn)至少3 次生物學(xué)重復(fù)，每次至少測量9 株材料。

尹軍平還表示，隨著“三通一達(dá)”、順豐、德邦等的陸續(xù)上市，整合大幕實(shí)際上已然拉開，而且行業(yè)內(nèi)并購標(biāo)的也在快速增加，一方面第一代物流企業(yè)家已到退休年齡，而很多二代不太愿意接班；另一方面，80、90年代出生的企業(yè)家家族觀念沒那么強(qiáng)，很多企業(yè)家創(chuàng)業(yè)成功后并不介意通過并購?fù)顺觥?/p>

同時，截取培養(yǎng)60 天的楊樹自頂端向下第6、12、15 節(jié)間中部（約0.5～1 cm）的莖部材料，將其放置固定于樣品架上，通過震蕩切片機(jī)（LEICA VT1000）進(jìn)行橫切（切片厚度為50 μm）。將切片置于0.05%甲苯胺藍(lán)O（Toluidine blue O，TBO）溶液中染色后，用Olympus BX51 顯微鏡進(jìn)行觀察并及時拍照，并利用Image J 軟件測量照片中木質(zhì)部的寬度，每次試驗(yàn)至少3 次生物學(xué)重復(fù)，每次至少測量3 個不同區(qū)域。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用Microsoft Excel 和SPSS Statistics 24 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并使用t檢驗(yàn)法分析差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 PagFBL3 基因克隆和序列分析

以84K 楊cDNA 為模板，使用特異引物通過PCR擴(kuò)增獲得PagFBL3基因編碼區(qū)序列。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果表明，PagFBL3基因與擬南芥、毛果楊的FBL3 同屬于一個系統(tǒng)發(fā)育分支，系統(tǒng)關(guān)系較近（圖1A）。多序列比對結(jié)果顯示，PagFBL3基因與擬南芥、毛果楊、柳樹（Salix babylonica）等物種的FBL3基因序列相似度較高（圖1B），其中與擬南芥和毛果楊核酸序列相似度分別為71.4%和98.48%，蛋白序列相似度為72.96%和97.72%，一些區(qū)域存在著明顯的保守序列，可能是重要的功能結(jié)構(gòu)域。PagFBL3基因編碼區(qū)全長1 716 bp，可編碼571 個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，蛋白分子量約為64.14 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為6.51。

2.2 PagFBL3 的組織表達(dá)和亞細(xì)胞定位分析

為了研究PagFBL3基因的組織表達(dá)特異性，采用RT-qPCR 技術(shù)分析了PagFBL3基因在84K 楊根、幼葉（頂端第3 片葉）、成熟葉（頂端第7 片葉）、1/2 株高處莖部、木質(zhì)部、維管形成層和韌皮部中的表達(dá)。結(jié)果顯示，PagFBL3基因在各組織中均有表達(dá)，并在成熟葉、次生莖及其次生木質(zhì)部中具有較高表達(dá)，在維管形成層和韌皮部中也有一定的表達(dá)量，相對較低（圖2A）。

圖2 PagFBL3 基因在84K 楊不同組織中的表達(dá)（A）及PagFBL3 的亞細(xì)胞定位分析（B）Fig.2 Expression of PagFBL3 in different tissues of 84K poplar(A) and subcellular localization (B) of PagFBL3

構(gòu)建35S::PagFBL3-GFP 融合表達(dá)載體，通過瞬時轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片，并檢測葉片中的GFP 信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GFP 熒光信號分布于細(xì)胞核，表明PagFBL3 是一個核定位蛋白質(zhì)（圖2B）。

2.3 過表達(dá)PagFBL3 轉(zhuǎn)基因楊樹的獲得及其表型鑒定

為了進(jìn)一步研究PagFBL3基因在楊樹生長發(fā)育中的作用，構(gòu)建了植物過表達(dá)載體35S::PagFBL3，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因楊樹，并通過再生芽、抗生素篩選和基因組DNA 分子檢測鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株，共鑒定了11 個獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系（OE1-OE11）（圖3A-D），進(jìn)一步采用實(shí)時定量PCR 檢測PagFBL3基因在各轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K 楊中的相對表達(dá)水平，與非轉(zhuǎn)基因84K 植株相比，PagFBL3在各轉(zhuǎn)基因株系中的相對表達(dá)量水平均有不同程度的提高，表明PagFBL3已成功轉(zhuǎn)入84K 楊中，并能夠過量表達(dá)（圖3E）。從中選取2 個表達(dá)量較高的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系（OE5 和OE7）用于后續(xù)的表型比較和功能分析。

圖3 過量表達(dá)PagFBL3 轉(zhuǎn)基因楊樹表型分析Fig.3 Phenotypes of transgenic plants overexpressing PagFBL3 gene

將20 天的生長狀態(tài)良好且長勢一致的過表達(dá)（OE5 和OE7）轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K 楊（對照）組培苗移栽至裝有人工土的塑料盆中，置于溫室培養(yǎng)60天后，觀察其表型變化，并測定其株高、地徑和節(jié)間數(shù)。與非轉(zhuǎn)基因84K 楊相比，兩個過表達(dá)轉(zhuǎn)基因的葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有差別，長度和寬度以及長寬比也沒有顯著差異（圖3F）。株高和節(jié)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，過表達(dá)PagFBL3轉(zhuǎn)基因植株的株高均顯著高于非轉(zhuǎn)基因84K 楊6.3%和6.9%，且差異隨著植株生長更加明顯，而二者的節(jié)間數(shù)則無明顯差異（圖3G，I）；地徑的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，過表達(dá)PagFBL3轉(zhuǎn)基因植株的地徑均大于非轉(zhuǎn)基因84K 楊，且存在顯著差異，分別增加了6.7%和8.5%（圖3H）。以上結(jié)果表明，PagFBL3基因參與了84K 楊莖部的次生生長和發(fā)育。

2.4 過表達(dá)PagFBL3 對楊樹生長和木質(zhì)部發(fā)育的影響

為進(jìn)一步揭示PagFBL3基因在楊樹莖部生長發(fā)育中的作用，對生長60 天過表達(dá)PagFBL3轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K 楊莖段的第6、12 和15 節(jié)間進(jìn)行解剖分析，并統(tǒng)計(jì)木質(zhì)部寬度。結(jié)果顯示，木質(zhì)部細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征也沒有明顯差異，但過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的第12 和15 節(jié)間木質(zhì)部寬度明顯大于非轉(zhuǎn)基因84K楊（圖4A）。其中，過表達(dá)PagFBL3轉(zhuǎn)基因第12 節(jié)間的木質(zhì)部寬度比非轉(zhuǎn)基因84K 楊高出11.6%和15.7%，第15 節(jié)間差異更顯著，高達(dá)17.3%和19.9%（圖4B）。以上結(jié)果表明過表達(dá)PagFBL3基因影響了植株次生生長，主要表現(xiàn)在株高、地徑和莖部木質(zhì)部發(fā)育方面。

圖4 過表達(dá)PagFBL3 對轉(zhuǎn)基因楊樹木質(zhì)部發(fā)育的影響Fig.4 Effects of PagFBL3 gene on xylem development of transgenic poplar

3 討論

生長素與生長素受體結(jié)合是研究生長素信號傳導(dǎo)途徑的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，生長素信號的傳導(dǎo)離不開生長素受體參與，作為生長素信號通路最上游的調(diào)控因子，控制著生長素信號傳導(dǎo)開關(guān)（Peer, 2013）。生長素受體基因（TIR1/AFBs）介導(dǎo)的生長素信號通路在植株生長發(fā)育過程中起著重要作用，如調(diào)控植物器官發(fā)生、子葉和根系發(fā)育，響應(yīng)生物逆境脅迫和非生物逆境脅迫，維持植株的正常發(fā)育等（Chenet al., 2015）。在本研究中，生長素受體基因PagFBL3能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因楊樹木質(zhì)部發(fā)育，顯著增加了木質(zhì)部寬度，提高了轉(zhuǎn)基因楊樹的徑向生長，同時增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因楊樹的高生長。因此，開展生長素受體相關(guān)研究對于揭示生長素在樹木次生生長中的作用機(jī)制具有重要意義。

目前，對于植物生長素受體基因的研究多集中在不定根發(fā)育方面。擬南芥TIR1基因明顯增加了側(cè)根的數(shù)量（Lakehalet al., 2019），AtAFB3可特異地響應(yīng)硝酸鹽信號調(diào)控主根長度及側(cè)根發(fā)生密度（Vidalet al.,2010），afb4缺失型突變體側(cè)根的數(shù)量明顯少于野生型幼苗（Huet al., 2012）。水稻TIR1和AFB2受miR393調(diào)控下調(diào)表達(dá)，導(dǎo)致主根和根冠增長，而過表達(dá)OsTIR1基因顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)基因水稻不定根和側(cè)根的發(fā)生，增加不定根數(shù)目和側(cè)根密度（Guoet al., 2021）。然而，對于植物地上部分的生長發(fā)育，尤其是次生生長研究較少。擬南芥生長素受體TIR1/AFB 通過參與生長素信號通路影響植株的葉片發(fā)生數(shù)目及子葉生長的偏上性狀（Si-Ammouret al., 2011）。水稻OsTIR1基因促進(jìn)分蘗，顯著增加轉(zhuǎn)基因植株地上部生物量（Guoet al., 2021）。在木本植物楊樹中，生長素受體FBL基因家族成員FBL1的較高表達(dá)促使轉(zhuǎn)基因楊樹比非轉(zhuǎn)基因植株具有了更寬的韌皮部、木質(zhì)部和更多的形成層細(xì)胞層；此外，過表達(dá)PagFBL1基因不僅能夠增加轉(zhuǎn)基因84K 楊的根系生物量（Shuet al., 2019），還能夠影響轉(zhuǎn)基因植株的株高、地徑和地上部分生物量等（舒文波等, 2015），以上結(jié)果表明，F(xiàn)BL1 介導(dǎo)的生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對木本植物生長發(fā)育具有重要的影響。

本研究克隆了銀腺楊生長素受體家族基因PagFBL3，序列分析和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析表明，該基因與毛果楊、擬南芥的FBL3基因序列相似度較高。實(shí)時熒光定量PCR 研究發(fā)現(xiàn)，PagFBL3基因主要在成熟葉和次生莖中表達(dá)量較高，且編碼蛋白定位于細(xì)胞核，這與前人的研究結(jié)果一致（Shuet al., 2015），該結(jié)果表明PagFBL3基因可能參與莖的次生生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步探究PagFBL3對莖生長發(fā)育的影響，本研究創(chuàng)制了過表達(dá)PagFBL3基因的轉(zhuǎn)基因楊樹，并比較了生長60 天的轉(zhuǎn)基因植株盆栽苗的生長和木質(zhì)部發(fā)育情況。與非轉(zhuǎn)基因84K 楊相比，過表達(dá)PagFBL3轉(zhuǎn)基因楊樹株高明顯高于非轉(zhuǎn)基因楊樹，說明了PagFBL3對楊樹高生長起著正調(diào)控作用（圖3）。同時，過表達(dá)PagFBL3促進(jìn)轉(zhuǎn)基因楊樹木質(zhì)部發(fā)育，顯著增加了木質(zhì)部寬度，提高了轉(zhuǎn)基因楊樹的徑向生長（圖4）。

以上結(jié)果表明PagFBL3 與PagFBL1 雖然是楊樹生長素受體不同的成員，但都可能作為生長素信號通路最上游的調(diào)控因子，通過過量表達(dá)增強(qiáng)生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起了下游相關(guān)基因表達(dá)（如Aux/IAA、ARF 等），促進(jìn)了楊樹莖段的次生生長。生長素能夠誘導(dǎo)楊樹Aux/IAA9-ARF5 模塊，直接激活兩個HDZIP III 轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，啟動維管形成層細(xì)胞向次生木質(zhì)部的分化，從而促進(jìn)木材形成（Xuet al.,2019），但生長素受體PagFBL3 是否與Aux/IAA9 或其它Aux/IAA 相互作用，又影響哪些下游相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控樹木次生生長尚不清楚；另外，本文僅對生長60 天以內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植株盆栽苗進(jìn)行了生長和木質(zhì)部發(fā)育檢測，對全生長季及多年生植株的表現(xiàn)尚不明確，且分子作用機(jī)制尚未探索，包括PagFBL3基因受哪些上游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，其具體上游分子調(diào)控機(jī)制有待解析，這些研究結(jié)果將對全面了解生長素受體在次生生長中的作用機(jī)制提供幫助，也為我國林木木材品質(zhì)遺傳改良提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從銀腺楊‘84K’中克隆了一個生長素受體基因PagFBL3，該基因編碼區(qū)全長1 716 bp，編碼571個氨基酸殘基的核定位蛋白質(zhì)。PagFBL3基因在根、莖和葉中均有表達(dá)，并在成熟葉和次生莖中表達(dá)量較高。與非轉(zhuǎn)基因楊樹相比，過表達(dá)PagFBL3轉(zhuǎn)基因楊樹株高明顯高于非轉(zhuǎn)基因楊樹，說明了PagFBL3對楊樹高生長起著正調(diào)控作用。同時，過表達(dá)PagFBL3促進(jìn)轉(zhuǎn)基因楊樹木質(zhì)部發(fā)育，顯著增加了木質(zhì)部寬度，提高了轉(zhuǎn)基因楊樹的徑向生長。以上研究結(jié)果表明，PagFBL3基因介導(dǎo)的生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對木本植物生長發(fā)育具有重要的影響，但其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)行深入解析。