李 森，馬 靈，李 婷，彭 爐，李莎莎，李慶業(yè)，周 曼，吳賀君

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014）

明膠（gelatin，G）是一種由廢棄動物骨頭、皮膚和結(jié)締組織中的膠原蛋白水解產(chǎn)生的高分子蛋白質(zhì)[1]，因其良好的成膜性、氣體阻隔性、耐油性以及資源豐富、成本低廉等優(yōu)勢，成為塑料包裝的一種潛在替代品[2-3]。明膠膜的易吸水性導(dǎo)致其易受到細菌和霉菌的污染，且生物活性低，因此應(yīng)用受到限制[4]。香芹酚（carvacrol，C）是一種揮發(fā)性單萜酚，天然存在于牛至、百里香、冬季香薄荷等唇形科植物中，具有非特異性的抗氧化、抗細菌、真菌等功效[5-6]，Kavoosi等[7]將香芹酚添加至明膠膜后得到的復(fù)合膜表現(xiàn)出優(yōu)異的功能活性，可用于制備廣譜高效的抗菌活性食品包裝材料。然而，香芹酚的快速揮發(fā)致使其存在抑菌時效短、利用率低的問題[8]。

為了抑制香芹酚活性成分的揮發(fā)，目前有研究將其封裝于埃洛石納米管等無機礦物制備抗菌復(fù)合體中，提升其長效抗菌效果[9-11]。然而埃洛石納米管對于細胞的潛在毒性可能會限制其在食品包裝中進一步應(yīng)用[12-13]。硅藻土（diatomite，D）是硅藻遺骸經(jīng)地質(zhì)作用形成的硅質(zhì)多孔沉積巖，其具有無毒、孔隙率高（高達80%，孔徑50～200 nm）、比表面積大、吸附性強以及價格低廉等優(yōu)點[14-15]。已有研究人員用硅藻土負載牛至精油[16]、百里酚[17]等制備包封效果好并具有緩釋特性的新型抗菌復(fù)合體。然而目前將這種硅藻土負載植物精油的新型抗菌復(fù)合體用于制備緩釋活性包裝膜的研究還相對較少?；诖?，本研究將硅藻土/香芹酚（D/C）復(fù)合體與明膠復(fù)合，探究D/C復(fù)合體添加量對明膠膜結(jié)構(gòu)與性能的影響并驗證其緩釋效果，為促進含香芹酚等植物精油的明膠基抗菌復(fù)合膜的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明膠（化學(xué)純）、硅藻土（純度99%、堆積密度0.47 g/cm3）、乙醇（分析純）（化學(xué)純） 成都科隆化學(xué)品有限公司；香芹酚（分析純） 上海瑞永生物科技有限公司；丙三醇（分析純） 成都金山化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 南京都萊生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂 杭州微生物試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）（ATCC29215）、大腸桿菌（Escherichia coli）（ATCC25922） 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物學(xué)實驗室；實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2A型恒溫磁力攪拌器 天津賽德利斯實驗分析儀器制造廠；SHZ-DIII型循環(huán)水式真空泵 北京市永光明醫(yī)療器械有限公司；SU-1510型掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀、Varioskan Flash型全波長多功能熒光酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；Rise-2006型激光粒度分析儀 濟南潤之科技有限公司；CM2300D型色差儀 日本柯尼卡美能達投資有限公司；WGW型光電霧度儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；HD-A821-1型電子拉力試驗機東莞市海達儀器有限公司；DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 D/C復(fù)合體的制備

D/C復(fù)合體的制備參考文獻[18]的方法并稍作修改。取一定質(zhì)量（m1/g）硅藻土混合足夠量的香芹酚，加入到抽濾瓶中，磁力攪拌10 min。再通過真空抽濾增大瓶內(nèi)內(nèi)部壓力，將硅藻土表面香芹酚壓入硅藻土的孔洞中，同時排出硅藻土孔洞中的空氣。以上抽濾操作重復(fù)6 次，每次40 s。抽濾結(jié)束后，將混合物加入至已稱質(zhì)量的離心管（m2/g）中，4 000 r/min離心10 min，回收離心游離香芹酚（上清液）于抽濾瓶中，重復(fù)上次操作，進行二次離心。再次稱量含有混合物的離心管總質(zhì)量（m3/g）。將離心出來的游離部分香芹酚回收至廣口瓶，可重復(fù)利用。硅藻土和香芹酚在D/C復(fù)合體中的相對含量分別按公式（1）、（2）計算。

1.3.2 D/C復(fù)合體的表征

1.3.2.1 外觀觀察

使用數(shù)碼相機拍攝硅藻土負載香芹酚前后的照片，觀察它們的顏色變化。

1.3.2.2 掃描電子顯微鏡觀察

將硅藻土和經(jīng)過40 ℃干燥12 h后的D/C復(fù)合體用導(dǎo)電樹脂固定在青銅樁上，在離子濺射鍍膜機上濺射金2 min，再利用SU-1510型掃描電子顯微鏡在20 kV下進行拍照觀察。

1.3.2.3 紅外光譜測定

采用溴化鉀壓片法，利用Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀對香芹酚、硅藻土和D/C復(fù)合體進行分析。分辨率為4 cm－1，測量記錄的波數(shù)范圍為650～4 000 cm－1，平均掃描32 次。

1.3.2.4 粒徑測定

采用Rise-2006激光粒度分析儀測定硅藻土負載香芹酚前后的粒徑。

1.3.3 明膠基抗菌復(fù)合膜的制備

根據(jù)文獻[19]的方法制備明膠基復(fù)合膜，具體步驟如下：首先稱取10 g明膠與2.5 g甘油，添加100 mL蒸餾水，在60 ℃恒溫水浴中磁力攪拌50 min后形成膜液；繼續(xù)冷卻攪拌降溫至40 ℃后，向膜液加入一定量D/C復(fù)合體，持續(xù)攪拌10 min，用膠頭滴管吸出多余氣泡；將膜液倒入自制230 mm×230 mm塑料成膜板，流延均勻后置于常溫環(huán)境（25 ℃）下進行自然風(fēng)干，1 d后揭膜；將薄膜置于溫度（23±2）℃、相對濕度（55±5）% 的恒溫恒濕箱中平衡24 h得到成品。

在制備含D/C復(fù)合體的復(fù)合膜時，復(fù)合體添加量分別為膠干質(zhì)量的0%、10%、20%、30%，分別記作空白組G-K、G-D/C1、G-D/C2、G-D/C3。在明膠膜中分別單獨添加與G-D/C3組等添加量的香芹酚和硅藻土制備復(fù)合膜作為對照，記作G-C和G-D。

1.3.4 明膠基抗菌復(fù)合膜的表征

1.3.4.1 掃描電子顯微鏡觀察

采用SU-1510型掃描電子顯微鏡觀察G-K、G-C、G-D/C3薄膜樣品截面以及表面的微觀形貌，加速電壓15 kV。

1.3.4.2 紅外光譜測定

從各組分薄膜上剪取一小塊樣品，利用Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀在ATR模式下直接測定，掃描范圍650～4 000 cm－1、分辨率2.0 cm－1、累加32 次。

1.3.4.3 厚度測定

根據(jù)GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片厚度測定 機械測量法》，用螺旋測微器在被測膜上隨機取點，測量5 次取平均值，以μm為單位。

1.3.4.4 色澤測定

薄膜顏色由CM2300D型色差儀測定薄膜的顏色指數(shù)（L、a、b）。L值代表亮度；a值代表紅綠色度，正值表示紅色程度，負值表示綠色程度；b值代表黃藍色度，正值表示黃色程度，負值表示藍色程度?？偵钪担é）按公式（3）計算。

式中：L*、a*、b*為標(biāo)準(zhǔn)白色板的色澤指數(shù)（L*＝99.76、a*＝－0.02、b*＝－0.40）。

1.3.4.5 透光率測定

參照GB/T 2410—2008《透明塑料透光率和霧度的測定》，將膜裁成正方形（50 mm×50 mm），采用WGW型光電霧度儀測定入射光通量（T1）和通過試樣的總透射光通量（T2），每組5 個平行，取平均值，按照公式（4）計算透光率（TS）。

1.3.4.6 力學(xué)性能的表征

參照GB/T 1040.1—2018《塑料 拉伸性能的測定第1部分：總則》，將薄膜剪成70 mm×15 mm尺寸的樣條，采用HD-A821-1型電子拉力試驗機測定樣品的拉伸強度（tensile strength，TS）和斷裂伸長率（elongation at break，EAB），設(shè)置初始間距為40 mm，拉伸速率為60 mm/min，測3 次取其平均值。

1.3.4.7 含水率和水溶性的測定

根據(jù)文獻[20]的方法測定薄膜含水率和水溶性，將膜樣（20 mm×20 mm）在室溫下稱質(zhì)量（m0/g），然后在105 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量（m1/g）。將干燥后樣品放入裝有50 mL蒸餾水的離心管中，于25 ℃條件下浸泡24 h，并定時攪動。將未溶解的膜取出，用濾紙吸干膜表面水分，于105 ℃干燥至恒質(zhì)量（m2/g）。根據(jù)公式（5）、（6）分別計算含水率和水溶性。

1.3.4.8 水蒸氣透過率測定

根據(jù)GB/T 1037—2021《塑料薄膜與薄片水蒸氣透過性能測定 杯式增重與減重法》，并略作修改后測定水蒸氣透過率。將4 mm×4 mm的薄膜預(yù)先放置在含直徑27.5 mm填充硅膠（相對濕度0%）的離心管口，并用橡膠圈密封，以確保濕度只通過薄膜遷移。將離心管儲存在一個含有飽和KNO3溶液的干燥器中，控制溫度為40 ℃、相對濕度為90%。每12 h檢測離心管質(zhì)量增加情況，連續(xù)測定7 d。所有分析均重復(fù)3 次，根據(jù)公式（7）計算水蒸氣透過率（water vapor permeation，WVP）。

式中：Δm表示每12 h的質(zhì)量差/g；d為樣品平均厚度/cm；A為離心管管口面積/cm2；Δt為測量間隔時間/s；ΔP為40 ℃下純水通過樣品的水蒸氣壓差/Pa。

1.3.4.9 氧氣透過率測定

根據(jù)文獻[21]的方法測定薄膜的氧氣透過率，取3 g脫氧劑加入到50 mL離心管，用薄膜封口后稱初始質(zhì)量（m1/g），然后將離心管放入盛有飽和氯化鋇溶液（相對濕度85%）的干燥器中48 h后稱質(zhì)量（m2/g）。每組測試重復(fù)3 次求平均值，根據(jù)公式（8）計算氧氣透過率（oxygen permeability，OP）。

式中：t為測定時間/h；A為離心管管口面積/m2。

1.3.4.10 抗氧化性測定

根據(jù)文獻[22]的方法測定DPPH自由基清除率。取25 mg膜樣于5 mL無水乙醇中浸泡過夜得到提取液。將每份提取液（0.1 mL）與3.9 mL 0.01 mmol/L DPPH溶液混合，劇烈搖晃后，在環(huán)境溫度下黑暗中靜置30 min，然后使用Varioskan Flash型全波長功能酶標(biāo)儀在517 nm波長處測定吸光度。用無水乙醇代替提取液制備對照樣品。每組樣品3 個平行。DPPH自由基清除率按公式（9）計算。

式中：Aα為對照樣品的吸光度；Aβ為測試樣品的吸光度。

1.3.4.11 抗菌性測定

參考文獻[17]采用瓊脂抑菌圈擴散法測定薄膜的抗菌性能。選用2 種細菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）作為測試菌種涂布于LB培養(yǎng)基上，將各明膠薄膜裁剪為直徑為15 mm的圓形膜樣品，浸入戊二醛中交聯(lián)1 min后，在去離子水中浸泡30 s，用濾紙吸干多余水分，將膜片貼附于培養(yǎng)基表面，在37 ℃培養(yǎng)24 h后，拍照并測量抑菌圈直徑。

1.3.4.12 香芹酚的釋放率測定

根據(jù)文獻[23]的方法測定香芹酚的釋放率。對復(fù)合膜中香芹酚在4 ℃、相對濕度50%條件下貯藏18 d過程中的釋放率進行測定。首先，將薄膜裁剪成20 mm×20 mm正方形片，稱質(zhì)量后加入裝有20 mL 95%乙醇溶液的60 mL封頂瓶中。室溫25 ℃下振蕩提取12 h，取0.1 mL提取液，進行梯度稀釋，利用VarioskanFlash型多模酶標(biāo)儀測定提取液在282 nm波長處的吸光度。將不同質(zhì)量濃度香芹酚溶解在95%乙醇溶液制備標(biāo)準(zhǔn)品并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程確定香芹酚質(zhì)量濃度。按公式（10）計算香芹酚的釋放率。

式中：ρ為釋放達到終點時香芹酚的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρt為測試樣品t時間點釋放出的香芹酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 27.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用方差分析和鄧肯多重范圍檢驗對數(shù)據(jù)進行顯著性分析（P＜0.05），以O(shè)rigin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 D/C復(fù)合體的表征

如圖1A所示，數(shù)碼照片顯示硅藻土為白色無機黏土，而負載香芹酚后，所得復(fù)合體粉末變?yōu)榈S色，Lei Hong等[24]通過坡縷石負載生姜精油前后的顏色變化確定了精油的成功負載；此外，掃描電子顯微鏡結(jié)果直接證實負載香芹酚后，硅藻土的多孔結(jié)構(gòu)被吸入孔洞的香芹酚完全覆蓋。由圖1B粒徑分布曲線可以看出，硅藻土、D/C復(fù)合體兩組樣品均為單峰分布，平均粒徑約在30 μm左右；而相對于硅藻土，復(fù)合體由于負載香芹酚后平均粒徑略微增加且分布略微變寬。上述表征結(jié)果共同說明多孔性的硅藻土成功負載了香芹酚。并由公式（1）、（2）計算出硅藻土和香芹酚在復(fù)合體中的相對含量分別約為32.56%和67.44%。

圖1 硅藻土和D/C復(fù)合體的結(jié)構(gòu)表征Fig. 1 Structural characterization of diatomite and D/C complex

如圖1C所示，香芹酚的特征吸收峰分別由在3 373 cm－1處和2 959 cm－1處羥基（—OH）和甲基（—CH3）的伸縮振動引起；1 250～1 750 cm－1區(qū)域出現(xiàn)的吸收峰與C—C鍵伸縮、—OH鍵彎曲和C—O鍵伸縮有關(guān)；811 cm－1處的吸收峰可能歸因于芳香族—OH的伸縮振動[25]。硅藻土的特征峰分別是在1 085 cm－1處硅氧烷（—Si—O—Si）的強吸收峰，以及在794 cm－1處SiO—H鍵的振動峰，以上這些特征峰的出現(xiàn)表明硅藻土主要由SiO2組成[26]。對于D/C復(fù)合體，香芹酚和硅藻土的主要特征吸收峰均有出現(xiàn)，說明兩者之間未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。與香芹酚的紅外光譜比較，D/C復(fù)合體紅外光譜在3 100～3 600 cm－1之間的吸收峰（與O—H伸縮振動有關(guān)）變寬且強度降低，并向更高的波數(shù)轉(zhuǎn)移，表明游離O—H鍵伸縮程度減弱。這可能是由于香芹酚與硅藻土表面羥基之間的氫鍵發(fā)生相互作用從而使兩者的界面結(jié)合能力提高[27]，機理如圖1D所示。

2.2 復(fù)合明膠薄膜的表征

2.2.1 薄膜微觀結(jié)構(gòu)分析

由圖2可知，G-K膜的截面和表面均連續(xù)、光滑且致密，無明顯缺陷，證實明膠基質(zhì)成膜性良好。而加入香芹酚后，G-C膜的表面與G-K膜相比變化不大，但橫截面明顯變得粗糙且厚度增大。這是由于香芹酚的增塑作用增加了明膠基質(zhì)分子鏈之間的距離，從而使膜結(jié)構(gòu)的致密性減弱[28-29]。當(dāng)加入D/C復(fù)合體后，G-D/C3薄膜的厚度進一步增大，同時因為復(fù)合體中的硅藻土密度較大，在溶液成膜干燥時容易沉積在下表面[17]，因此表面更為粗糙。此外，D/C復(fù)合體中香芹酚的酚羥基可與明膠基質(zhì)中的羥基、羧基和氨基等極性基團發(fā)生氫鍵等相互作用，提升了復(fù)合體與明膠基質(zhì)之間的界面相容性[30-31]，所以兩者結(jié)合較為緊密，并未出現(xiàn)明顯的界面分離。

圖2 G-K（A）、G-C（B）、G-D/C3（C）膜截面和表面的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 SEM images of cross-section and surface of G-K (A), G-C (B)and G-D/C3 (C) films

2.2.2 薄膜紅外光譜分析

如圖3A所示，純明膠薄膜3 296 cm－1處的峰對應(yīng)N—H拉伸和O—H拉伸，2 931 cm－1處的峰對應(yīng)C—H拉伸振動[32]；在大約1 634、1 549 cm－1和1 240 cm－1處的峰分別對應(yīng)酰胺I帶的C＝O拉伸、酰胺II帶的N—H變形和C—H拉伸，以及蛋白質(zhì)中酰胺III帶的C—H和N—H基團在平面上的振動[33]。摻入硅藻土和香芹酚，G-D/C3薄膜在3 000～3 600 cm－1處的頻帶強度明顯下降。此外，與G-K膜相比，G-D/C3膜的光譜中有明顯的酰胺I帶（1 690～1 630 cm－1）和酰胺II帶（1 655～1 590 cm－1）。由此可見，明膠基復(fù)合膜的帶位和強度發(fā)生了一些變化，但并未有新峰的產(chǎn)生，表明D/C復(fù)合體與明膠基質(zhì)之間沒有化學(xué)相互作用，只有物理分子間的相互作用[20]。這種作用可能是硅藻土對香芹酚的物理吸附和攜帶作用，以及蛋白基質(zhì)極性基團與D/C復(fù)合體中香芹酚的酚羥基之間的氫鍵相互作用[31]。

圖3 復(fù)合膜的傅里葉變換紅外光譜（A）和表觀形貌（B）Fig. 3 Fourier transform infrared spectra (A) and apparent images (B)of the composite films

2.2.3 薄膜的厚度、色澤、透光率

由表1可知，G-K膜的厚度僅為84.67 μm，而復(fù)合膜的厚度隨著D/C復(fù)合體添加量的增加而顯著上升（P＜0.05），膜的厚度主要取決于成膜液中非溶劑成分的含量。如圖3B所示，明膠薄膜本身成淡黃色，隨著D/C復(fù)合體添加量的增加，薄膜黃色逐漸加深，這是由于香芹酚作為添加物質(zhì)其顏色偏淡黃色，從而導(dǎo)致膜的a值降低、b值增大。此外，復(fù)合膜中硅藻土為白色粉末狀黏土，因此添加硅藻土的復(fù)合膜與G-K相比ΔE降低。復(fù)合膜的透過率同樣隨著薄膜復(fù)合體的添加量增加而顯著降低（P＜0.05），特別是相比于G-K膜，G-D/C3膜的透光率降低了近20%。這是由于硅藻土本身作為無機物質(zhì)，具有不透明性，在膜中會阻礙光線的透過。Akyuz等[34]發(fā)現(xiàn)在殼聚糖薄膜中添加硅藻土同樣會顯著改善薄膜的光阻隔性能。同時，溶質(zhì)的量增加導(dǎo)致膜厚度變大，也會進一步阻礙光線的透過。

表1 復(fù)合膜的厚度、色澤和透光率Table 1 Thickness, color difference and transmittance of the composite films

2.2.4 薄膜力學(xué)性能的表征

由圖4可知，可以觀察到G-C、G-D膜TS均較低。在復(fù)合薄膜中，隨D/C復(fù)合體添加量的增加，TS呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，由17.66 MPa（G-K）下降到了13.01 MPa（G-D/C3）。TS降低一方面是因為薄膜中香芹酚的揮發(fā)會致使薄膜出現(xiàn)孔洞結(jié)構(gòu)，從而破環(huán)薄膜本身完整結(jié)構(gòu)[35]；另一方面，過多的復(fù)合體則可能會導(dǎo)致其在膜中的分散性降低，使顆粒發(fā)生團聚，造成顆粒尺寸增大和周邊區(qū)域的應(yīng)力集中[36]。此外，G-C膜相比于G-D膜EAB顯著增加，因為香芹酚的存在會對明膠薄膜產(chǎn)生增塑作用，降低明膠單體之間的相互作用，阻礙聚合物的鏈-鏈相互作用[37]。最終在復(fù)合膜中，EAB由G-K薄膜組的61.06%提升至G-D/C3薄膜組的80.45%。在D/C添加量為20%時，復(fù)合膜具備優(yōu)異的力學(xué)性能，其TS為15.13 MPa，EAB為67.43%。總地來說，由于香芹酚的增塑作用，D/C復(fù)合體的加入可一定程度改善明膠膜的EAB。

圖4 復(fù)合膜的力學(xué)性能Fig. 4 Mechanical properties of the composite films

2.2.5 含水率、水溶性、水蒸氣透過率和氧氣透過率

由表2可知，復(fù)合膜的含水率和水溶性隨著D/C復(fù)合體添加量的增加而顯著降低，這歸因于D/C復(fù)合體中硅藻土作為無機填料不溶于水，增加了復(fù)合膜中不溶物質(zhì)的量。此外，香芹酚作為一種疏水性化合物，它的存在也有助于明膠膜的疏水性提升[34,38]。Hosseini等[28]將百里香、丁香、肉桂精油添加至殼聚糖中制備抗菌復(fù)合膜并測定其含水率和溶解度，也得到了類似的結(jié)果。然而值得注意的是，僅含有香芹酚的G-C膜水溶性最高，這可能是由于G-C膜中的香芹酚容易從明膠基質(zhì)遷移到浸泡的水中而損失[39]。

表2 復(fù)合膜的含水率、水溶性、WVP和OPTable 2 Water content, solubility, water vapor permeability and oxygen permeability of the composite films

G-C薄膜的WVP相較于G-K顯著增加。復(fù)合體中香芹酚的存在對明膠膜產(chǎn)生了一定的增塑作用，降低了明膠膜網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的內(nèi)聚力，從而導(dǎo)致WVP增加[7]。Kavoosi等[7]同樣發(fā)現(xiàn)在明膠膜中添加香芹酚可導(dǎo)致WVP的增加。G-D膜的WVP最高，為1.93×10－12g/（cm·s·Pa）。這是由于硅藻土顆粒的高孔隙率和聚集性，有利于水分子通過硅藻土內(nèi)部孔隙和聚合物基體界面區(qū)域的擴散[40-41]。結(jié)果表明，D/C復(fù)合體的加入會降低復(fù)合膜含水率和水溶性，但使其WVP增大。

食品在保存過程中的氧滲透性是影響食品保質(zhì)期的一個重要因素[21]。如表2所示，G-C薄膜的OP相較于G-K有所增加，這是因為香芹酚的增塑作用導(dǎo)致明膠基質(zhì)分子間距增大，進而使膜的連續(xù)性和緊密結(jié)構(gòu)受到影響；此外，隨著D/C復(fù)合體添加量的增加，復(fù)合膜的OP也呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，這是因為復(fù)合體中多孔性硅藻土的存在同樣會破壞明膠基質(zhì)致密完整的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進而促進空氣中氧分子的通過，造成復(fù)合膜的OP增大。說明與G-K相比，復(fù)合膜的阻隔性能有所降低。

2.2.6 薄膜的抗氧化性和抗菌特性

2.2.6.1 抗氧化性

在明膠基質(zhì)當(dāng)中添加抗氧化活性物質(zhì)能夠有效抑制食品的氧化反應(yīng)進而延長食品貨架期[42]。如圖5所示，G-K、G-D均具有一定DPPH自由基清除效果，這是由于硅藻土本身并不具有抗氧化活性，但明膠中多肽具有一定的抗氧化活性[22,43]。而G-C與G-D/C3均表現(xiàn)出最高的DPPH自由基清除率，且二者無顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)D/C復(fù)合體在明膠中添加量達到20%時，DPPH自由基清除率為56.33%。這是因為香芹酚具有較強的抗氧化活性，它的抗氧化能力除了取決于其環(huán)的空間位阻效應(yīng)和電子效應(yīng)外，還與羥基的存在有關(guān)，羥基能夠提供氫原子與氧原子結(jié)合[44]。因此，可以發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)合體添加量的增加，復(fù)合的DPPH自由基清除率顯著提升（P＜0.05）。

2.2.6.2 抗菌性

如圖6所示，由于明膠本身不具有抗菌活性，G-K組并未產(chǎn)生抑菌圈。隨著加入復(fù)合體的添加量增加，復(fù)合膜樣片周圍透明的抑菌圈逐漸增大，說明復(fù)合膜具有較好的抑菌活性。當(dāng)D/C復(fù)合體在明膠膜中添加量達到20%時，薄膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑可分別達到39.40 mm和23.70 mm（表3）。這主要歸因于D/C復(fù)合體中香芹酚能快速提高細菌細胞膜通透性及滲透壓，造成胞內(nèi)物質(zhì)外泄，并且進入細胞內(nèi)部的酚類物質(zhì)可改變細菌酶系統(tǒng)，導(dǎo)致微生物死亡[45-46]。此外，復(fù)合膜對金黃色葡萄球菌的抑菌性要強于對大腸桿菌的抑菌性。這是因為革蘭氏陰性菌細胞壁通常會多一層脂蛋白層或磷脂層和脂多糖層，限制了酚類物質(zhì)與細菌內(nèi)部蛋白結(jié)合[45]。對比G-D/C3與G-C兩組，雖然它們含有等量的香芹酚，但G-D/C3的抑菌效果要略差于G-C。這可能與香芹酚被硅藻土負載后，在D/C復(fù)合體的釋放速率較為緩慢有關(guān)，后續(xù)實驗將進一步證實此推測?？偟貋碚f，D/C復(fù)合體的加入成功賦予明膠復(fù)合膜優(yōu)異抗菌活性。

表3 復(fù)合薄膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone diameters of the composite films against S. aureus and E. coli

圖6 復(fù)合膜的抑菌性能Fig. 6 Antibacterial activities of the composite films

2.2.7 復(fù)合膜的香芹酚緩釋性能

2.2.7.1 G-D/C3和G-C薄膜貯藏過程中香芹酚的釋放率

香芹酚在薄膜放置過程中會因揮發(fā)而損失，導(dǎo)致復(fù)合膜的抗菌時效受到影響。由圖7可知，隨著貯藏時間的延長，精油香芹酚在G-D/C3復(fù)合膜中的釋放率始終低于G-C薄膜。G-C復(fù)合薄膜中香芹酚在第14天左右便釋放完全，而G-D/C3薄膜中香芹酚在第18天才完全釋放，比前者延遲了4 d。這是由于在G-D/C3復(fù)合膜中，香芹酚的釋放可分為兩個階段：第一個階段為游離精油的揮發(fā)釋放（與G-C組相似）；第二階段為負載在硅藻土內(nèi)部精油的遷移揮發(fā)[18]。添加D/C復(fù)合體后，硅藻土的吸附負載能夠減緩香芹酚釋放的速率，有效降低其在明膠復(fù)合膜成膜和儲存過程的損失，有利于延長復(fù)合膜的抗菌活性時效[47]。

圖7 G-D/C3和G-C膜中香芹酚的釋放率Fig. 7 Carvacrol release from G-D/C3 and G-C films

2.2.7.2 G-D/C3和G-C薄膜的抑菌性

基于上述實驗結(jié)果，進一步測定了G-D/C3和G-C兩組復(fù)合膜對金黃色葡萄球菌連續(xù)培養(yǎng)5 d過程中抑菌圈直徑的變化，結(jié)果如圖8所示。隨著培養(yǎng)時間的延長，兩組抑菌圈直徑均有所減小，這與香芹酚的揮發(fā)損失有關(guān)。放置4 d后，G-D/C3薄膜抑菌圈直徑在不再縮??；而G-C薄膜抑菌圈直徑仍在不斷縮小。印證了G-D/C3薄膜中香芹酚釋放更為緩慢的結(jié)論。同時，可以發(fā)現(xiàn)在4 d后G-C膜周圍出現(xiàn)多個單菌落，而G-D/C3膜中并未觀察到有類似明顯的變化。在貯藏結(jié)束時，G-D/C3薄膜抑菌圈直徑由0 d時的45 mm最終降低至37 mm，變化率為17.8%；而G-C薄膜抑菌圈直徑由0 d時的59 mm最終降低至44 mm，變化率為25.4%。以上實驗結(jié)果均有效證明了G-D/C3薄膜相較于G-C薄膜具有更加長效的抑菌效果。

圖8 貯藏5 d過程中G-D/C3和G-C膜對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑變化Fig. 8 Change in inhibition zone diameter of G-D/C3 and G-C films against S. aureus during storage for up to five days

3 結(jié) 論

本研究利用多孔性的硅藻土負載易揮發(fā)的香芹酚制備D/C復(fù)合體，并將其加入到明膠膜溶液中，利用流延成膜法制得活性復(fù)合膜，探究了不同D/C復(fù)合體添加量對復(fù)合膜結(jié)構(gòu)與性能的影響。通過掃描電子顯微鏡觀察和傅里葉變換紅外光譜分析證實了香芹酚成功物理吸附在硅藻土內(nèi)部孔洞與表面，且兩者之間可能存在氫鍵等相互作用而有效結(jié)合。D/C復(fù)合體的加入顯著改善了明膠基復(fù)合膜的光阻隔性能、水不溶性和EAB，但同時也會使TS、WVP和OP有所降低。更為重要的是，D/C復(fù)合體的加入賦予了明膠膜良好的抗氧化性和抑菌性能。此外，與含等量香芹酚的G-C膜相比，硅藻土的負載可以使G-D/C膜中香芹酚具有更緩慢的釋放速率，有利于延長復(fù)合膜的抗菌時效。本實驗研究結(jié)果能夠為以無機硅藻土負載植物精油制備新型緩釋抗菌明膠基復(fù)合膜的研發(fā)及其在食品包裝方面的應(yīng)用提供一定參考。