高 寬，何述棟

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，農(nóng)產(chǎn)品精深加工安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601）

蕓豆，學(xué)名菜豆（Phaseolus vulgarisL.），是世界各地廣泛種植和消費(fèi)的古老經(jīng)濟(jì)豆類之一[1]。蕓豆生長(zhǎng)期短、對(duì)溫度和土壤要求不嚴(yán)格且栽培過(guò)程簡(jiǎn)單，因此，蕓豆在我國(guó)種植區(qū)域廣泛[2]，對(duì)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展有顯著促進(jìn)作用。目前，我國(guó)是世界重要的蕓豆生產(chǎn)、出口大國(guó)，種植面積位列前三，年產(chǎn)量超過(guò)82萬(wàn) t[3]。近年來(lái)，我國(guó)蕓豆出口量保持在30萬(wàn) t以上，與大宗糧食相比，價(jià)格更具優(yōu)勢(shì)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值顯著[4]。蕓豆中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高（20%～25%），碳水化合物（50%～60%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、維生素、膳食纖維和礦物質(zhì)含量豐富[5]，是葉酸的良好來(lái)源[6]，因此，蕓豆也是許多溫帶、亞熱帶和熱帶國(guó)家飲食中的重要原料[7]。然而，在日常生活中，使用未加工及加工不當(dāng)?shù)氖|豆食品極易引發(fā)食物中毒。Xie Lei等[8]對(duì)我國(guó)1994—2010年的食物中毒報(bào)告進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，因食用蕓豆產(chǎn)生的食物安全事件排名第一，占總事件的34.6%，影響人數(shù)達(dá)到1 066 人；且僅在2021年內(nèi)，蕓豆引起的食物中毒報(bào)道人數(shù)達(dá)到2 047 人，為植物性食物安全事件第一位，占比53.46%[9]。可見(jiàn)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，蕓豆在現(xiàn)代飲食和食品加工中的利用程度越來(lái)越高，所引發(fā)的食物安全事件頻率也在不斷的增加，亟需相關(guān)科研工作者關(guān)注其飲食安全性。

Sun Yufeng等[10]在對(duì)蕓豆蛋白的相關(guān)危險(xiǎn)分析中發(fā)現(xiàn)，蕓豆中的凝集素蛋白可能是誘發(fā)其造成食物毒理學(xué)安全事件的主要原因。對(duì)凝集素蛋白的傳統(tǒng)認(rèn)知為非免疫來(lái)源的碳水化合物結(jié)合糖蛋白，能夠特異性識(shí)別和可逆地結(jié)合碳水化合物，但不會(huì)改變其結(jié)構(gòu)[11]。據(jù)報(bào)道，蕓豆種子中總蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在17%～23%之間，其中2.4%～5.0%是蕓豆凝集素蛋白[12]。有研究表明，豆科凝集素蛋白可以產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)作用，是一種典型的“抗?fàn)I養(yǎng)因子”[13]。純化的蕓豆凝集素蛋白在較高劑量（50 mg/kgmb）時(shí)會(huì)誘導(dǎo)Sprague-Dawley大鼠腸道增生、改變絨毛結(jié)構(gòu)、降低二糖酶活性、增加腸道通透性和激活免疫系統(tǒng)等，破壞腸道黏膜的完整性[14-15]，導(dǎo)致整個(gè)動(dòng)物體出現(xiàn)厭食癥狀，營(yíng)養(yǎng)（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和VB12）吸收受影響，生長(zhǎng)緩慢[16-17]，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)胸腺和脾臟萎縮，胰島素分泌減少，腹脹時(shí)四肢萎縮、負(fù)氮平衡甚至是死亡[18]。同時(shí)，有研究表明，由凝集素蛋白誘導(dǎo)腸道損傷引起的腸道生態(tài)失調(diào)，易導(dǎo)致消化水解凝集素蛋白的菌群或者酶功能降低，這可能是凝集素蛋白誘發(fā)毒理學(xué)作用的另一個(gè)重要機(jī)制[16,19]。在使用煮熟蕓豆進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)與使用分離凝集素蛋白和生豆粉相同的機(jī)體反應(yīng)癥狀，這可能由于蕓豆凝集素蛋白熱變性，易被胃腸道所消化，不會(huì)以完整蛋白結(jié)構(gòu)造成毒理學(xué)作用或者透過(guò)腸道被抗原遞呈細(xì)胞（腸道一般為樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC））所攝取[20]。而保持蛋白完整形式可能正是凝集素蛋白引起致敏反應(yīng)的前提條件，即存在潛在的致敏性，在對(duì)攝入凝集素蛋白的BALB/c小鼠研究中，小鼠腸道受損的同時(shí)出現(xiàn)了明顯的過(guò)敏癥狀[21]。

近年來(lái)，在印度、巴基斯坦、加拿大、澳大利亞和英國(guó)等國(guó)家，有關(guān)蕓豆引起的過(guò)敏反應(yīng)事件時(shí)有發(fā)生[22-24]。英國(guó)報(bào)告了25 起由生的或未煮熟的紅蕓豆引起的食物過(guò)敏反應(yīng)事件，總計(jì)患者約100 人[25]。在2003—2014年間，我國(guó)報(bào)告了124 起與蕓豆相關(guān)的致敏事件，患者達(dá)到7 526 人[10]。在摩洛哥的114 名過(guò)敏患者（76 名兒童和38 名成年人）中，51%的兒童和39%的成年人血清中含有對(duì)白蕓豆蛋白有特定反應(yīng)的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE），表明摩洛哥人口對(duì)蕓豆蛋白過(guò)敏原非常敏感[26]。Kasera等[27]發(fā)現(xiàn)蕓豆中有4 種潛在的蛋白致敏原，分別是凝集素、菜豆素、α-淀粉酶抑制劑前體和第3組晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白，通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，確定凝集素為蕓豆中主要的過(guò)敏原蛋白。Bender等[28]研究發(fā)現(xiàn)，蕓豆凝集素蛋白誘發(fā)的致敏通常出現(xiàn)在食用未處理完全的蕓豆2 h后，表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉和腹痛等癥狀。

目前，已有較多研究表明蕓豆飲食不當(dāng)導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)均與凝集素蛋白未失活有高度的相關(guān)性[29-30]，但在我國(guó)還未引起足夠的重視。因此，為明晰蕓豆凝集素蛋白的相關(guān)作用機(jī)制，本文總結(jié)了近期關(guān)于蕓豆凝集素蛋白的毒理學(xué)和致敏性研究報(bào)道，以期為蕓豆安全食品研發(fā)和利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 蕓豆凝集素蛋白結(jié)構(gòu)

凝集素存在于許多可食用的植物中，特別是在豆科植物中[31]。作為儲(chǔ)藏蛋白，不同豆類凝集素蛋白的含量差異也很大。蕓豆籽粒中總蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在17%～23%之間，其中2.4%～5.0%是凝集素；大豆含有34%的蛋白質(zhì)，其中0.8%是凝集素；利馬豆凝集素約占總蛋白質(zhì)量的0.8%，而豌豆凝集素約為總蛋白質(zhì)量的0.6%[32-34]。目前，已有超過(guò)70 種不同類型的凝集素實(shí)現(xiàn)從豆科植物中分離和純化[35]。如圖1所示，蕓豆凝集素蛋白含有紅細(xì)胞凝集素和白細(xì)胞凝集素的兩種單體，特異性識(shí)別N-乙酰乳糖胺型的復(fù)雜聚糖[36]，一般為典型的同源四聚體構(gòu)型β-三明治結(jié)構(gòu)[37]。

2 蕓豆凝集素蛋白致敏性

早期研究一直關(guān)注于蕓豆凝集素蛋白的抗?fàn)I養(yǎng)性質(zhì)及毒性，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)蕓豆凝集素蛋白具有一定的致敏性。圖2匯總了蕓豆凝集素致敏性的研究認(rèn)知過(guò)程。1992年，意大利一名患有胃腸道念珠菌病8 個(gè)月的年輕女士（26 歲）在注射蕓豆凝集素蛋白后5 min，注射區(qū)域表現(xiàn)出明顯的過(guò)敏反應(yīng)，眼瞼水腫，經(jīng)免疫和過(guò)敏測(cè)試發(fā)現(xiàn)，凝集素蛋白在體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性，表明凝集素蛋白可能會(huì)引起I型免疫反應(yīng)[38]。2011年，據(jù)Allergy期刊報(bào)道，一名來(lái)自法國(guó)的沒(méi)有特應(yīng)性病史的23 歲女性食用煮熟的蕓豆后，引發(fā)全身反應(yīng)，且30 min后出現(xiàn)過(guò)敏性休克，皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)（skin prick test，SPT）結(jié)果表明蕓豆凝集素蛋白呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的IgE結(jié)合能力，因此，蕓豆凝集素蛋白被認(rèn)為是一種潛在的食物過(guò)敏原[39]。2013年，印度學(xué)者首次報(bào)道對(duì)蕓豆蛋白過(guò)敏原進(jìn)行純化研究，確定其主要為分子質(zhì)量31 kDa的凝集素蛋白，對(duì)25 名易過(guò)敏志愿者中的14 人進(jìn)行皮膚測(cè)試，11 人（78%）的SPT為蕓豆凝集素的蛋白陽(yáng)性，并且在蕓豆凝集素蛋白陽(yáng)性患者樣本（n＝15）中發(fā)現(xiàn)組胺水平顯著提高[40]。以上研究表明蕓豆凝集素蛋白是一種食物過(guò)敏原，在醫(yī)療診斷中具有臨床相關(guān)性。

圖2 蕓豆凝集素蛋白致敏性的研究過(guò)程[38-40]Fig. 2 Flow chart of research on the allergenicity of kidney bean lectins[38-40]

3 蕓豆凝集素蛋白的抗原表位分析

凝集素呈現(xiàn)致敏性的根本原因在于其表面或者內(nèi)部的抗原表位?？乖砦挥址Q抗原決定簇，是指免疫應(yīng)答中，能與T細(xì)胞或B細(xì)胞表位受體或抗體發(fā)生特異結(jié)合的蛋白特定結(jié)構(gòu)和氨基酸序列[41]。目前普遍認(rèn)為，在機(jī)體的免疫反應(yīng)過(guò)程中，免疫細(xì)胞表面受體難以識(shí)別整個(gè)過(guò)敏原蛋白質(zhì)分子，所以只能針對(duì)抗原表位，即特異性地識(shí)別抗原上的一段氨基酸序列，而不是針對(duì)完整的抗原分子[42]。過(guò)敏原蛋白的免疫原性，主要由其抗原表位決定，即由抗體識(shí)別的蛋白質(zhì)部分，按與抗原受體結(jié)合細(xì)胞的不同，分為B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位[43]。

近年來(lái)，許多豆科凝集素蛋白過(guò)敏原的蛋白三維結(jié)構(gòu)和抗原表位已經(jīng)通過(guò)先進(jìn)的生物信息學(xué)方法被分析和討論。大量研究發(fā)現(xiàn)具有低空間位阻（表面暴露）、高柔韌性及表面可及性的多肽片段更有可能參與特異性抗體的結(jié)合，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面，與抗體結(jié)合的幾率較大，具有高抗原表位的可能性[44-45]。凝集素蛋白如果空間結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，那么可能難以在胃腸道中被消化，從而完整地透過(guò)腸道，誘導(dǎo)免疫產(chǎn)生。有研究分析了已知3D結(jié)構(gòu)（實(shí)驗(yàn)或建模結(jié)構(gòu)）過(guò)敏原中連續(xù)IgE表位的氨基酸分布情況，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)界面的疏水殘基，如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸，出現(xiàn)在表位界面中的概率較低，而丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、甘氨酸和賴氨酸更有可能出現(xiàn)在表位中，尤以賴氨酸最為突出[45]。

He Shudong等[44]在對(duì)黑龜豆凝集素蛋白B細(xì)胞表位的研究中發(fā)現(xiàn)，氨基酸組成占比較高的是組氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺和賴氨酸殘基。前人研究表明，酪氨酸和組氨酸殘基的存在將促進(jìn)蛋白質(zhì)界面中心的形成，具有高IgE結(jié)合能力[46]。同時(shí)，過(guò)敏原蛋白外部帶正電荷的氨基酸，如丙氨酸和亮氨酸，可提高其表面可及性，顯著增加其抗原表位肽的IgE結(jié)合能力[47]。而高疏水性氨基酸更易出現(xiàn)在T細(xì)胞抗原表位肽中，且抗原表位肽區(qū)域內(nèi)的多個(gè)位置都表現(xiàn)出高的抗原性[44]。所以，高疏水性帶正電荷的氨基酸殘基可能在黑龜豆凝集素蛋白抗原表位構(gòu)成中發(fā)揮重要作用。趙金龍[48]利用同源建模研究黑龜豆凝集素蛋白的結(jié)構(gòu)，并對(duì)B及T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附、促淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)，成功鑒定出了黑蕓豆凝集素蛋白的4 個(gè)B細(xì)胞抗原表位（B1、B2、B3和B4）和2 個(gè)T細(xì)胞抗原表位（T1和T2）（圖3），所有抗原表位表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性和電正性，且B1、B2、B3、B4和T1細(xì)胞抗原表位分布在蛋白表面，具備較強(qiáng)的表面可及性。

圖3 黑龜豆凝集素蛋白潛在的抗原表位分布[49]Fig. 3 Localization of the sequential epitopes identified at the molecular surface of the black turtle bean erythroagglutinating homotetramer[49]

4 蕓豆凝集素蛋白的致敏機(jī)制研究

Kumar等[50]采用柱色譜、IgE免疫印跡和反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatographic，RP-HPLC）技術(shù)對(duì)紅蕓豆致敏蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)凝集素蛋白具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和抵抗蛋白水解酶的能力，通過(guò)BALB/c小鼠構(gòu)建致敏模型，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為29.5 kDa的PHA-L能促進(jìn)更高水平的總IgE、特異性IgE和組胺表達(dá)，表明PHA-L具有過(guò)敏原的特征。Kumar等[51]使用蕓豆凝集素蛋白對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔注射致敏，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)IgE和免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）水平顯著性升高，與對(duì)照組相比，在PHA處理的小鼠中觀察到血漿組胺、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）和肥大細(xì)胞蛋白酶1（mast cell protease-1，mMCPT-1）水平分別增加2.0、2.5 倍和2.0 倍，而這3 種因子在誘導(dǎo)食物過(guò)敏中起到關(guān)鍵作用[52-55]。

Rougé等[56]確定蕓豆凝集素蛋白（120 kDa，四聚體形式）是蕓豆中的主要蛋白過(guò)敏原，由耐熱變性和消化蛋白水解的低聚蛋白組成，表面具有易與IgE結(jié)合的表位，這可能是其致敏的主要原因。Kasera等[40]使用Q-瓊脂糖柱（陰離子交換劑）純化蕓豆過(guò)敏原，使用凝膠過(guò)濾和RP-HPLC收集高濃度洗脫物，純化出31 kDa的凝集素蛋白分子，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附和免疫印跡分析可知，該蛋白分子可以引起88%的蕓豆陽(yáng)性患者產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。

如圖4所示，目前認(rèn)為蕓豆凝集素蛋白的過(guò)敏反應(yīng)主要是IgE介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)也存在非IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，例如IgE和IgG共同介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)或免疫復(fù)合物介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[57]。

圖4 蕓豆凝集素致敏機(jī)制Fig. 4 Mechanism of sensitization to kidney bean lectins

蕓豆凝集素蛋白過(guò)敏原初次進(jìn)入機(jī)體后，未被胃腸道消化的凝集素蛋白進(jìn)入腸道，因腸道細(xì)菌和上皮細(xì)胞都攜帶凝集素蛋白的糖受體（N-乙酰氨基葡萄糖），這使得凝集素能夠與腸道細(xì)菌、腸道上皮細(xì)胞或兩者都結(jié)合。凝集素與上皮細(xì)胞的結(jié)合可能導(dǎo)致炎癥、緊密連接的損傷和腸漏，這被認(rèn)為是凝集素蛋白的毒理學(xué)作用，同時(shí)也是其進(jìn)入自身免疫的途徑[58-60]。凝集素蛋白穿過(guò)腸道，被抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs）所捕獲，通過(guò)胞吞作用將凝集素內(nèi)化，經(jīng)泛素選擇性地依附在內(nèi)溶酶體，被降解為小分子肽段，如果其中含有抗原表位肽，那么過(guò)敏原信息將會(huì)以人類主要組織相容性復(fù)合體-抗原肽復(fù)合物的形式分布在遞呈細(xì)胞表面。然后，抗原表位肽被特異性T細(xì)胞受體上的初始CD4＋T細(xì)胞所識(shí)別，導(dǎo)致其增殖并分化成1型/2型輔助性T細(xì)胞（helper T cell 1/ helper T cell 2，Th1/Th2）。通過(guò)誘導(dǎo)包括細(xì)胞因子和來(lái)自于樹(shù)突細(xì)胞的共刺激分子的釋放可促進(jìn)初始T細(xì)胞的活化。

Th1細(xì)胞的主要效應(yīng)功能在于細(xì)胞介導(dǎo)免疫和炎癥，包括活化其他免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和CD8＋細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞溶解和其他效應(yīng)功能[61]。在Th1細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用的兩種細(xì)胞因子分別是IFN-γ和IL-12。APCs分泌的IL-12能活化信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白4，從而促進(jìn)0型輔助性T細(xì)胞分化為Th1。而信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白4能活化轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1和T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（T-box expressed in T cells，T-bet）促進(jìn)IFN-γ產(chǎn)生，這是Th1分化的另一個(gè)因素。T-bet被認(rèn)為是Th1分化的主要調(diào)節(jié)因子，因?yàn)樗T導(dǎo)更多的IFN-γ表達(dá)，形成增強(qiáng)Th1細(xì)胞極化的正反饋環(huán)[62-63]。最終，Th1細(xì)胞促使B細(xì)胞釋放IgG和IgM，形成II、III型超敏反應(yīng)。在II型超敏反應(yīng)中，IgG和IgM可高效激活補(bǔ)體和釋放過(guò)敏毒素，導(dǎo)致平滑肌收縮，血管通透性增加，肥大細(xì)胞隨著組胺和TFN-α的釋放而活化[64]。并可與巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，產(chǎn)生抗體促進(jìn)吞噬作用和抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用等[65]。對(duì)于III型超敏反應(yīng)，抗原和抗體在血管和組織中形成免疫復(fù)合物，在體液免疫應(yīng)答不足的情況下，免疫復(fù)合物可以持續(xù)存在并聚集在血管壁和組織中并引起炎癥反應(yīng)，而且反復(fù)接觸過(guò)敏原會(huì)導(dǎo)致過(guò)量的IgG抗體，伴有局部超免疫和免疫復(fù)合物的形成，免疫復(fù)合物通過(guò)Fcγ受體與白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞結(jié)合，激活它們并引起炎癥反應(yīng)[64]。

Th2細(xì)胞可產(chǎn)生對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)中具有重要作用的細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13等。在Th2細(xì)胞的輔助下，可促使抗原特異性B淋巴細(xì)胞分化為能產(chǎn)生IgE抗體類別轉(zhuǎn)換的漿細(xì)胞，也稱效應(yīng)B細(xì)胞。分泌的IgE參與血液循環(huán)，并與含有特異性IgE受體（FcεRI）的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面結(jié)合，導(dǎo)致這些細(xì)胞對(duì)特定過(guò)敏原形成敏感性[57,66]。當(dāng)機(jī)體再次接觸同一過(guò)敏原后，過(guò)敏原蛋白吸附IgE抗體和FcεRI產(chǎn)生交聯(lián)。此結(jié)合可激活免疫受體酪氨酸激活基序，最終打開(kāi)與非受體酪氨酸激酶的對(duì)接位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)一系列的復(fù)雜反應(yīng)之后，鈣離子從細(xì)胞中釋放，并且造成肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的脫粒。這一脫粒過(guò)程可導(dǎo)致組胺、氨基己糖苷酶、白三烯和前列腺素D等致敏中間介質(zhì)的釋放，這些介質(zhì)才是Th2途徑過(guò)敏癥狀的直接原因，表現(xiàn)為I型超敏反應(yīng)[57,67]。

Haas等[68]發(fā)現(xiàn)凝集素蛋白具有誘導(dǎo)人嗜堿性粒細(xì)胞分泌IL-4和IL-13的能力，由于凝集素可以在口服后進(jìn)入循環(huán)，因此它們可能在誘導(dǎo)早期IL-4分泌中發(fā)揮作用，以將免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)換為Th2反應(yīng)和I型過(guò)敏反應(yīng)。同時(shí)，Shibasaki等[69]發(fā)現(xiàn)蕓豆凝集素蛋白與IgE有很強(qiáng)的親和能力，誘導(dǎo)組胺釋放。另有研究者利用紅蕓豆凝集素蛋白構(gòu)建小鼠致敏模型，發(fā)現(xiàn)小鼠中TNF-α、IFN-γ、趨化因子配體5、趨化因子配體2、轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合蛋白3、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17和T-bet水平顯著提高，同時(shí)增強(qiáng)了特異性IgE、IgG等免疫球蛋白水平，使過(guò)敏癥狀更為突出，并利于β-己糖苷酶和其他過(guò)敏介質(zhì)的釋放，表明凝集素蛋白可引起Th1和Th2途徑的同時(shí)表達(dá)[70]；另外，在喂養(yǎng)生蕓豆的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了IgG水平的顯著增長(zhǎng)[71]；此外，口服和靜脈注射小鼠蕓豆凝集素蛋白，在小鼠體內(nèi)均會(huì)發(fā)現(xiàn)血清特異性IgG和免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）抗體[72-73]；對(duì)小鼠腹腔注射凝集素蛋白，發(fā)現(xiàn)還會(huì)增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的有絲分裂能力，強(qiáng)化巨噬細(xì)胞的吞噬能力[74]。以上研究表明，蕓豆凝集素蛋白的過(guò)敏機(jī)制較為復(fù)雜，存在多種形式。

5 食品加工控制措施

5.1 物理處理

加熱可誘發(fā)食物蛋白過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)變化，包括蛋白質(zhì)展開(kāi)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變、分子內(nèi)和分子間共價(jià)和非共價(jià)相互作用的形成等，可以通過(guò)破壞或暴露構(gòu)象表位來(lái)改變致敏性[75]。此外，加熱還可以提高蕓豆凝集素蛋白在胃腸道中的消化敏感性，從而進(jìn)一步降低其致敏性[76]。先前的研究表明，瞬時(shí)高壓處理后扁豆種子的凝集素蛋白IgE結(jié)合能力顯著降低[77]。純化的紅蕓豆凝集素蛋白在50 MPa靜水壓處理下結(jié)構(gòu)開(kāi)始展開(kāi)，然后逐漸形成熔融球狀；當(dāng)壓力不低于450 MPa時(shí)，蕓豆凝集素蛋白可能發(fā)生分子重排和分子聚合，從而喪失致敏性[78-79]。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)被25 kGy的γ射線輻照處理后，蕓豆凝集素蛋白的特異性IgE結(jié)合率降低了約34%[80]。在干燥或50%水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，蕓豆凝集素蛋白經(jīng)過(guò)輻照劑量不高于30 kGy的γ射線輻照處理后，結(jié)構(gòu)仍然保持完整，但在10 kGy劑量的水溶液中觀察到凝集素蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)完全被破壞，表明在輻照處理中水分條件的重要性[81]。

5.2 化學(xué)改性

研究表明，使用聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯（polyethylene glycol-succinimidyl carbonate，PEG-SC）、聚乙二醇-琥珀酰亞胺丁二酸酯（polyethylene glycolsuccinimidyl succinate，PEG-SS）和聚乙二醇-琥珀酰亞胺基丙酸酯（polyethylene glycol-succinimidyl propionate，PEG-SPA）偶聯(lián)修飾黑蕓豆凝集素蛋白可以提高空間位阻，降低凝血活性和致敏性，并改善蕓豆蛋白粉的凝膠特性[82-83]。也有研究表明，在pH＜1.5的酸性環(huán)境下孵育蕓豆凝集素，發(fā)現(xiàn)蛋白α-螺旋比例顯著降低，伴隨著聚合物的解離，二硫鍵斷裂，疏水性顯著增加；同時(shí)，黑蕓豆凝集素蛋白的酶解位點(diǎn)暴露增多，消化率顯著提高[84]。當(dāng)pH值調(diào)節(jié)為中性時(shí)，酸性條件下展開(kāi)的凝集素蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)重新折疊，但在蛋白結(jié)構(gòu)重組時(shí)可能會(huì)發(fā)生錯(cuò)位，約有15%的構(gòu)象差異，此時(shí)，凝集素蛋白的血凝活性降低了50%，IgE結(jié)合能力也降低，表明糖結(jié)合位點(diǎn)與致敏性可能有一定的相關(guān)性[85-86]。

5.3 生物誘導(dǎo)

在萌發(fā)處理24 h后，黑龜豆樣品中的凝集素蛋白含量降低了46%，48 h后減少76%[87]。萌發(fā)4 d紅蕓豆的凝集素蛋白含量降低了86%[88]。同樣，萌發(fā)處理7 d后，白蕓豆凝集素蛋白含量下降了85%[89]。在萌發(fā)處理過(guò)程中，蛋白水解和碳水化合物官能團(tuán)的一些修飾可能會(huì)顯著降低凝集素的活性[90]。此外，發(fā)芽24 h后協(xié)同高壓（121 ℃）滅菌30 min可以完全消除蕓豆中凝集素蛋白活性[88]。發(fā)酵超過(guò)72 d可以破壞扁豆中幾乎所有的凝集素活性[91]。在自然發(fā)酵和乳酸發(fā)酵過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)了凝集素蛋白含量的降低[92]。在發(fā)酵過(guò)程中，食物蛋白過(guò)敏原的線性表位和構(gòu)象表位會(huì)被水解，酸化誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象改變[93]。酶水解方法主要通過(guò)使用蛋白水解酶或細(xì)胞酶來(lái)破壞線性抗原表位。用堿性蛋白酶和風(fēng)味酶處理后，蕓豆中可溶性蛋白提取物的IgE結(jié)合能力降低了（62.2±7.7）%，嗜堿性粒細(xì)胞中組胺的釋放量明顯減少，并且只有10%的患者表現(xiàn)出過(guò)敏癥狀[94]。

目前，還有些技術(shù)雖然未被用于蕓豆凝集素的研究當(dāng)中，但是已經(jīng)在其他豆類過(guò)敏原蛋白的研究中進(jìn)行了驗(yàn)證。如RNA干擾技術(shù)已成功用于抑制花生中過(guò)敏蛋白Ara h 2的形成[95]。糖基化修飾有助于降低大豆凝集素過(guò)敏原的敏感性[96]。一些分子，如多酚，可以與蛋白質(zhì)過(guò)敏原結(jié)合，通過(guò)阻礙IgE表位的暴露來(lái)抑制IgE識(shí)別。例如，藍(lán)莓果實(shí)中的原花青素C1和綠原酸用于與花生過(guò)敏原Ara h 2相互作用，可以改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使IgE結(jié)合能力分別降低了37%和50%[97]。在超聲波作用下，食物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到空化現(xiàn)象和傳質(zhì)增強(qiáng)的影響而發(fā)生改變，最終影響其致敏特性[96,98]。已有研究表明，超聲（300 W）處理30 min后大豆凝集素IgE結(jié)合能力降低了51.39%[99]。在胰蛋白酶作用下連續(xù)超聲處理花生，花生過(guò)敏原Ara h 1和Ara h 2的免疫反應(yīng)性降低50%[100]。還有低溫等離子體處理、脈沖光處理、脈沖電場(chǎng)等技術(shù)，也可以使大豆和花生的過(guò)敏原蛋白發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而影響致敏性的變化[101-103]。

6 結(jié) 語(yǔ)

蕓豆的食用安全意義重大。目前，關(guān)于蕓豆蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)逐漸讓人們意識(shí)到，凝集素蛋白不僅具備毒理學(xué)特性，更具有致敏免疫特點(diǎn)。雖然凝集素蛋白的致敏性在體內(nèi)或者體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得以驗(yàn)證，但凝集素蛋白如何在細(xì)胞和分子層面被抗原遞呈及對(duì)細(xì)胞極化和對(duì)細(xì)胞因子釋放的細(xì)節(jié)還不清晰。因此，可在未來(lái)研究過(guò)程中以致敏細(xì)胞模型和動(dòng)物模型為對(duì)象，深入開(kāi)展相關(guān)免疫機(jī)制研究。凝集素蛋白的空間構(gòu)象、抗原表位分析是凝集素免疫調(diào)控機(jī)制的研究基礎(chǔ)。在現(xiàn)代食品加工過(guò)程中，已經(jīng)運(yùn)用一定物理、化學(xué)、生物等技術(shù)手段有效抑制凝集素蛋白的致敏性，但是在這些處理方法中存在一些特殊的增加致敏性的情況發(fā)生，這主要是由于蛋白構(gòu)象的變化與致敏性的關(guān)系尚不明確。所以，積極開(kāi)展凝集素蛋白結(jié)構(gòu)研究，尤其是明確抗原表位的具體位置、協(xié)同食品加工技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)凝集素蛋白的靶向修飾或改性，將是未來(lái)蕓豆低敏食品開(kāi)發(fā)的重要研究方向。