趙 青，劉 欣，牛洪梅，朱華劍，潘馨葉，劉陽泰，楊捷琳，董慶利,*

（1.上海理工大學材料與化學學院，上海 200093；2.上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093；3.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135）

細菌活的不可培養(yǎng)（viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)，通常是指細菌在不利于自身生存環(huán)境條件下失去可培養(yǎng)性的一種休眠狀態(tài)[1]。Xu Huaishu等[2]最早于1982年發(fā)現(xiàn)了VBNC狀態(tài)存在的直接證據(jù)，其后Mukamolova等[3]發(fā)現(xiàn)了黃體微球菌分泌的蛋白質Rpf（復蘇促進因子），為VBNC狀態(tài)的研究提供了一個良好的開端。現(xiàn)已有大量的實質性證據(jù)表明，大多數(shù)細菌在處于對其生長繁殖不利的環(huán)境條件時，都能夠進入VBNC狀態(tài)休眠或是降低細胞活性，以規(guī)避不良環(huán)境條件的影響[4]，這種狀態(tài)下的細菌仍具有致病性或潛在致病性，并在適宜的條件下可以復蘇，因此對食品和環(huán)境存在潛在的威脅[5-6]。2018年，Schottroff等[7]闡述了VBNC細菌的存在可能會引起食品安全狀況誤判，由此引起食品安全事件，并再次強調了VBNC細菌對食品安全的威脅，使VBNC狀態(tài)細菌的關注度提升。

迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的100多種在逆境條件下可以進入VBNC狀態(tài)的微生物絕大多數(shù)為食源性致病菌[8-9]。食源性致病菌可通過受污染的水或食物傳播，消費者攝入之后會在人體內(nèi)引起嚴重疾病，是影響食品安全的重要隱患，包括沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌（以下簡稱單增李斯特菌）、空腸彎曲桿菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、阪崎克羅諾桿菌等[10]。研究發(fā)現(xiàn)當食源性致病菌在食品加工加工過程中遇到低溫[11]、高壓[12]、低強度光照、高/低鹽度[13]、紫外[14]、氯脅迫[15-16]和電化學處理[17]等條件時，有較大可能會進入VBNC狀態(tài)。進入VBNC狀態(tài)的致病菌雖然暫時喪失了生長繁殖的能力，但仍具有致病菌原本的抗原成分、毒力因子，且部分致病菌在VBNC狀態(tài)下可以直接表達毒性因子[18]。細菌處于VBNC狀態(tài)時，采用常規(guī)的檢測手段易造成漏檢，但當VBNC狀態(tài)的致病菌遇到適宜的條件后又可以復蘇，重新對周圍環(huán)境和人類安全造成一定的威脅。不同食源性致病菌在VBNC狀態(tài)下的毒性表達能力也有所不同。因此，出于對食品安全和公眾健康的考慮，對食源性致病菌VBNC狀態(tài)生理生化特性及其檢測方法的研究具有積極和重要的意義。

基于此，本文總結了細菌VBNC狀態(tài)的定義發(fā)展、形態(tài)特征、生理生化性質、毒力因子等，再將近年來VBNC狀態(tài)誘導因素和復蘇條件進行梳理歸納，最后著重介紹了檢測VBNC狀態(tài)的分子生物學、流式細胞儀、光學檢測方法，并比較分析了3 種方法的優(yōu)劣。通過進行進一步的學術探討，圍繞細菌進入VBNC狀態(tài)的影響因素和復蘇條件進行全面的總結，為防控食源性致病菌的潛在危害提供參考。

1 VBNC狀態(tài)的定義及特征

1.1 VBNC狀態(tài)的定義

VBNC狀態(tài)是指細菌在受到不利于自身生長環(huán)境下導致的一種休眠狀態(tài)，常規(guī)培養(yǎng)條件下細菌不能增殖，但是仍具有代謝活性，給予適宜條件時細菌可復蘇[19]。通常，保持在VBNC狀態(tài)的細菌保留了毒力基因和致病基因，復蘇后會產(chǎn)生致病性和感染性[20]。如圖1所示，VBNC狀態(tài)細菌菌體中細胞質密度、蛋白質、核糖體、DNA的改變會引起菌體收縮變小，細胞壁和細胞膜也會分離。從近年來的研究看，VBNC狀態(tài)并沒有一個固定的解釋，有學者認為其是細菌在不利環(huán)境條件下生存的一種休眠狀態(tài)[21]，另外一些學者認為其是細菌為了延續(xù)生命而采取的一種特殊的生存策略[22-24]，總地來說，各種對于VBNC狀態(tài)的定義都具有不可培養(yǎng)這一共同的外部特征，但對細菌本身缺少一個明確的特征指標。

圖1 細菌進入VBNC狀態(tài)后形態(tài)、生理和毒力特征的變化[25]Fig. 1 Changes in morphological, physiological and virulence characteristics of bacteria after entering the VBNC state[25]

1.2 VBNC狀態(tài)的特征

關于VBNC細胞的特征研究有很多，以下從細胞形態(tài)、細胞組織結構、蛋白質大分子方面分別闡述。

1.2.1 細胞形態(tài)

從細胞形態(tài)看，VBNC狀態(tài)細胞與指數(shù)中期和壞死狀態(tài)的細胞間存在明顯差異。Wei Caijiao等[26]用掃描電子顯微鏡觀察不同狀態(tài)的細菌細胞發(fā)現(xiàn)，處于指數(shù)中期的細胞呈典型的棒狀，表面光滑、大小正常、分布均勻；死亡的大腸桿菌O157:H7細胞表面相對粗糙、聚集，甚至部分細胞表面出現(xiàn)損傷；而在VBNC狀態(tài)下，細胞由典型的棒狀變?yōu)槎贪魻?，細胞體積減小，細胞相對粗糙、萎縮，形狀不規(guī)則，部分細胞趨于成簇。

1.2.2 組織結構

Bai Hong等[27]從細胞組織結構方面開展典型特征研究，用透射電子顯微鏡觀察未誘導和誘導第20天的VBNC細胞，發(fā)現(xiàn)兩者有著同樣明顯的形態(tài)學變化?；谖⒂^分子層面，許多未誘導的細胞處于分裂期，細胞壁完整光滑，細胞膜緊密貼合。細胞質和細胞核物質被新生的細胞壁均勻地分離，核糖體均勻分布于整個細胞質基質中，位于細胞中心的類核具有致密、濃縮的結構。與未誘導的細胞相比，VBNC細胞質中電子密度增加，部分細胞出現(xiàn)細胞膜與細胞壁之間的間隙，導致細胞壁有一定程度的變形，使VBNC細胞形態(tài)不規(guī)則，這可能是細胞質濃縮所致。另一方面，與未誘導的細胞相比，VBNC細胞的細胞核區(qū)域出現(xiàn)了電子密度下降的現(xiàn)象，表現(xiàn)為明亮的中空或呈放射狀分布的淺色結構。

1.2.3 蛋白質大分子

Bollen等[28]討論了VBNC狀態(tài)與蛋白質聚集的關系；Kan Yumin等[29]采用同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術比較了西瓜噬酸菌VBNC細胞、復蘇細胞和對數(shù)期細胞的蛋白圖譜，在VBNC細胞和對數(shù)期細胞的對比中有60 個蛋白差異表達，在VBNC細胞和復蘇細胞的對比中有469 個蛋白差異表達。Zhong Qingping等[30]同樣采用iTRAQ技術對副溶血性弧菌復蘇后與VBNC狀態(tài)和指數(shù)期的蛋白質組學進行分析，證明了復蘇細胞中蛋白全面上調，主要包括參與蛋白質合成、跨膜轉運、分泌系統(tǒng)、運動、黏附等生命過程的蛋白；Se Jing等[31]研究了在低水分的情況下細菌細胞的形態(tài)、蛋白質合成和DNA復制能力；Ye Chengsong等[32]通過轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，在VBNC狀態(tài)下，大腸桿菌共有16 個基因表達顯著上調，其中包括3 個編碼毒性蛋白的基因（ygeG、ibsD、shoB）。以上研究表明在VBNC狀態(tài)下，細菌細胞的培養(yǎng)能力、蛋白質合成和DNA復制能力降低，其中參與DNA復制和重組、糖類運輸和代謝的蛋白均下調，與鞭毛運動、致病性和營養(yǎng)吸收相關的蛋白均上調；同時，該研究也證實了處于VBNC狀態(tài)的細菌在復蘇后表達致病蛋白，對人類健康安全構成威脅。

2 細菌進入VBNC狀態(tài)的因素及復蘇條件

2.1 VBNC狀態(tài)細菌形成

1982年，Xu Huaishu等[2]首次在海洋和河口水中分離獲得VBNC細胞并對其狀態(tài)進行了描述，之后在自來水、海底沉積物或土壤中都檢測到了VBNC狀態(tài)細胞存在。此外，在一些食品中也發(fā)現(xiàn)了VBNC狀態(tài)細菌的存在，如飲用水、葡萄酒、啤酒、葡萄果汁、成熟蘋果果核、生菜、歐芹等[33]。這是因為在食品加工及貯藏過程中存在著許多能夠導致食品中所含致病菌被迫進入VBNC狀態(tài)的環(huán)境因素，主要包括低溫、高溫、高滲透壓、低氧濃度、極端pH值、寡營養(yǎng)等[20]。換言之，在外界環(huán)境中能使細菌偏離最佳生長條件的脅迫因素（包括物理因素和化學因素）均可能使細菌進入VBNC狀態(tài)。

圖2為VBNC細菌的形成機制示意圖，主要涉及4 條通路，包括毒素-抗毒素（toxin-antitoxi，TA）系統(tǒng)、嚴緊反應、一般應激反應和細胞膜作用。1）在TA系統(tǒng)中，對細菌VBNC狀態(tài)起調控作用的毒素基因（mazF、relE、higB、hipB、vapC、parE2）干擾翻譯，抑制細菌生長，使細菌進入VBNC狀態(tài)。TA系統(tǒng)又受嚴緊反應調節(jié)，因為外切聚磷酸激酶（polyphosphokinase，PPK）和鳥苷五磷酸磷酸水解酶（guanosine pentaphosphate phosphohydrolase，GPPA）具有鳥苷四磷酸[(p)ppGpp]磷酸水解酶活性，導致降解多聚磷酸鹽（polyphosphates，PolyP）積聚，從而激活蛋白酶Lon/ClpP并降解抗毒素，促進細菌進入VBNC狀態(tài)（圖2A）。2）在嚴緊反應中，由于氨基酸饑餓而激活RelA蛋白，(p)ppGpp又受RelA催化合成，進而影響DNA、RNA和蛋白質的合成，導致生長停滯（圖2B）。3）一般應激反應系統(tǒng)Sigma因子RpoS和轉錄調控因子OxyR作為調節(jié)應激反應的主要信號因子對VBNC細菌的形成和作用具有重要的激活作用，RpoS也受嚴緊反應和ClpX蛋白酶的調控，clpX基因突變導致RpoS降解減少，最終延遲細胞進入VBNC狀態(tài)（圖2C）。4）細胞膜上的毒素轉錄激活因子ToxR的降解也會導致細菌進入VBNC狀態(tài)，其功能可能是對環(huán)境信號的響應[25]（圖2D）。

圖2 VBNC細胞的形成機制[25]Fig. 2 Formation mechanism of VBNC cells[25]

2.2 VBNC狀態(tài)細菌復蘇

VBNC狀態(tài)細菌復蘇是一個復雜的過程，并不只是通過簡單除去環(huán)境脅迫因素來實現(xiàn)，有時還需要添加營養(yǎng)物質、化學物質或依靠食品基質來實現(xiàn)，而且并不是所有的VBNC菌株都可以復蘇。處于VBNC狀態(tài)的細菌具有一定的可復蘇的“復蘇窗口期”[34]，一旦過了這個窗口期，復蘇難度較大，并且窗口期在不同菌株之間差異很大。目前關于VBNC狀態(tài)菌的研究較多，但研究VBNC狀態(tài)復蘇成功與否卻存在爭議，關于復蘇的是亞致死細胞還是VBNC細胞尚不清楚，且這兩者有極大的相似之處。亞致死狀態(tài)是由于化學或物理過程而受到細胞結構的損傷，但沒有被殺死，并且有能力在適當?shù)臈l件下修復它們的損傷時，它們就處于亞致死狀態(tài)。亞致死細胞是休眠的初始階段，隨后是VBNC狀態(tài)[33]。此外，同樣的復蘇方法對不同種類的細菌有不同的復蘇效果，甚至同一細菌不同菌株的復蘇效果也不一樣。例如，Pinto等[35]發(fā)現(xiàn)氨基酸可以使溶血性大腸桿菌的VBNC細胞復蘇，但不能使VBNC腸出血性大腸桿菌O157:H7復蘇。Wagley等[36]研究發(fā)現(xiàn)菌株的“年齡”也可影響VBNC的形成和復蘇。在Afari等[37]的研究中，大腸桿菌O157:H7撤去應激條件，升溫加丙酮酸鈉和吐溫20即復蘇成功，但同樣條件下單增李斯特菌的復蘇卻未成功。

復蘇VBNC狀態(tài)下的細胞一般為消除壓力因素或添加營養(yǎng)物質，但復蘇的分子機制并不是一個簡單的逆轉過程，圖3為VBNC狀態(tài)細胞復蘇機制示意圖[38]。在靶向自誘導信號分子（autoinducer-2，AI-2）缺失的情況下，其受體由周質結合蛋白LuxP和酶傳感器LuxQ結合LuxPQ作為激酶催化組氨酸磷酸化，磷酸鹽隨后轉移到酶蛋白LuxU和轉錄調節(jié)因子LuxO。LuxU和轉錄調節(jié)因子σ54結合促進了sRNAs的轉錄，sRNAs與伴侶Hfq一起破壞了轉錄因子LuxR的編碼。LuxR是RpoS的正調控因子，LuxR被破壞后，RpoS活性降低，過氧化氫酶KatG的產(chǎn)生也會隨之減少，進而導致細胞對過氧化氫的敏感性和不可培養(yǎng)性（圖3A）。當AI-2濃度較高時，LuxPQ結合AI-2，并作為磷酸酶剝奪LuxO和LuxU的磷酸基，低活性LuxO導致LuxR失去抑制后，RpoS活性的增加導致KatG產(chǎn)量的增加，抗氧化活性的增加使VBNC細胞再次可培養(yǎng)（圖3B）。Rpf蛋白結合VBNC細胞表面的Rpf受體，觸發(fā)復蘇（圖3C）。Rpf和Rif組成的復合物作用于細胞壁。Rpf和Rip分別分裂糖苷鍵和肽鍵，細胞壁被重塑，進而刺激VBNC細胞的復蘇（圖3D）。Rpf和Rif復合體作用于VBNC細胞的細胞壁，并將其裂解產(chǎn)生肽聚糖片段。肽聚糖片段與PknB受體（一種跨膜蛋白）結合并觸發(fā)復蘇（圖3E）。VBNC細胞在去除氧化、冷、饑餓、滲透應激和離子應激等應激后可以復蘇（圖3F）。VBNC細胞宿主可提供營養(yǎng)或刺激因子促進復蘇[38]（圖3G）。

圖3 VBNC細胞的復蘇機制[38]Fig. 3 Resuscitation model of VBNC cells[38]

為了解食源性致病菌VBNC狀態(tài)及其復蘇后對人類的威脅，已對食源性致病菌VBNC狀態(tài)的影響因素和復蘇條件開展了相關研究（表1）。典型研究包括通過物理方法誘導致病菌進入VBNC狀態(tài)，包括紫外線[39]、高溫[40]、低水分[31]、高壓二氧化碳[41]，而復蘇后致病菌可恢復其培養(yǎng)性和代謝活性，證實了毒力基因在VBNC狀態(tài)和復蘇的細胞中均為高表達，但隨著蛋白質聚集和活性氧水平的增加，細胞會逐漸失去復蘇的能力；Liu Yanming[42]、Phung[43]、Gi?o[44]等的研究表明自來水中也存在VBNC狀態(tài)的細菌，所以為消除這一潛在風險，需要將水煮沸至少15 min以上使其完全滅活；Zolfaghari等[45]發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在NaCl溶液的脅迫下進入VBNC狀態(tài)，且保留了hly和inlA基因的表達；此外，在營養(yǎng)耗盡的培養(yǎng)基中也可誘導細菌進入VBNC狀態(tài)，并且細菌存活時長可達2 個月[46-47]。由此可以得出，細菌在不利于自身生長繁殖的物理或化學條件下，均可進入VBNC狀態(tài)，而不同的食源性致病菌進入VBNC狀態(tài)的時間、條件也不相同，這可能與致病菌本身的生存環(huán)境、生存溫度、營養(yǎng)需求、耐酸堿度有關。

表1 食源性致病菌VBNC狀態(tài)的影響因素及復蘇條件Table 1 Influential factors and resuscitation conditions of foodborne pathogens in the VBNC state

3 VBNC細菌檢測方法

由于VBNC狀態(tài)細菌使用常規(guī)培養(yǎng)方法無法增殖，因此無法被檢測到，容易對食品安全和公共衛(wèi)生形成潛在威脅。因此建立針對VBNC狀態(tài)的食源性致病菌有效且快速檢測的方法較為迫切。目前針對VBNC狀態(tài)的食源性致病菌的檢測方法主要包括分子生物學檢測法、流式細胞術和光學檢測法。

3.1 分子生物學檢測法

分子生物學檢測法一般采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）檢測細胞總數(shù)，疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）能夠進入細胞壁和細胞膜已破損的細胞，但由于VBNC狀態(tài)下的細菌細胞膜是完整的，因此PMA只能對死細胞進行染色，一般將其與PCR結合測VBNC細胞數(shù)，或將qPCR與活/死細胞染色法結合得出總細胞數(shù)、活細胞和死細胞數(shù)，通過總細胞數(shù)和活細胞數(shù)差值來確定VBNC細胞數(shù)。

Zhou Wenqu等[60]應用快速、特異、操作簡便的單氮丙啶交叉引物擴增（propidium monoazide-crossing priming amplification，PMA-CPA）法檢測VBNC狀態(tài)下的大腸桿菌O157:H7。Debnath等[61]通過qPCR對VBNC狀態(tài)下的霍亂弧菌分析，證實了此狀態(tài)下細菌具有活性?？梢酝茰y，在逆境中生存時，這些分子伴侶的作用是維持重要蛋白的結構完整性。Faille等[62]用qPCR和PMA-qPCR分別對單增李斯特菌死亡、VBNC、可培養(yǎng)細胞計數(shù)，發(fā)現(xiàn)使用的采樣方法對清洗消毒操作效率的評估有顯著影響。Li Yanmei團隊[63-64]用PMA-PCR計數(shù)進行研究，發(fā)現(xiàn)了營養(yǎng)、酸、鹽對金黃色葡萄球菌（營養(yǎng)＞酸＞鹽）和大腸桿菌O157:H7（酸＞營養(yǎng)＞鹽）的影響。Lv Xinrui等[65]開發(fā)并使用PMAxx（以分子檢測法為主，對PMA染料進行改良后的一種方法）＋單細胞數(shù)字滴定PCR（single intact cell droplet digital PCR，SIC ddPCR）法對嬰兒食品中阪崎克羅諾桿菌在VBNC狀態(tài)下快速定量檢測，得出檢測限2.3×101CFU/mL，且僅需3 h就可得出結果，并且具有較高的靈敏度和準確性。分子生物學檢測法以準確、靈敏度高、特異性強并且能夠極大提高檢測速度等優(yōu)勢在VBNC狀態(tài)細菌的檢測和分析中得到了廣泛的應用。但是，分子檢測法也有一定的劣勢，比如其程序復雜，需要技術精通的研究人員操作，同時檢測儀器也十分昂貴。

3.2 流式細胞術

流式細胞術可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞并進行自動分析和分選，該技術可以用于分析和檢測那些不能用常規(guī)方法培養(yǎng)而得到的細胞特征參數(shù)。Live/Dead BacLight試劑盒是目前應用較多的判定活菌的方法，采用流式細胞術可以區(qū)分出只被SYTO9染色的細菌，從而得到活菌的含量，而檢測到細胞處于活細胞區(qū)但平板富集后不可培養(yǎng)的細胞被歸類為VBNC細胞。

Afari等[37]采用流式細胞儀，Live/Dead BacLight試劑盒對大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌VBNC狀態(tài)細胞的活性進行評估，得出初始細菌種群規(guī)模大小影響電解水處理過程中的細菌減少程度。Power等[66]研究證明，高通量成像流式細胞術（imaging flow cytometry，IFC）具有高通量數(shù)據(jù)收集和圖像捕獲能力，可對細胞進行可視化處理并提供詳細的形態(tài)分析，因此可以對VBNC細胞進行高分辨率分類，為詳細了解細菌表型變化及其生理影響提供了一個平臺，可以準確監(jiān)測和量化，從而更好地理解表型異質性在動態(tài)微生物組中的作用。具備篩選功能的流式細胞儀可以根據(jù)預先設置的參數(shù)范圍把指定的細胞亞群分選出來，但多數(shù)流式細胞計是一種細節(jié)分辨率為零的儀器，它只能測量一個細胞的諸如總核酸量、總蛋白量等指標，而不能鑒別和測量出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。

3.3 光學檢測法

熒光顯微鏡法是研究VBNC狀態(tài)菌最基本的檢測方法，也稱經(jīng)典方法。該方法是以吖啶橙染色熒光顯微鏡直接鏡檢（acridine orange direct count，AODC）法、活菌直接鏡檢（direct viable count，DVC）法和異養(yǎng)平板計數(shù)（heterotrophic plate count，HPC）法三者相結合實現(xiàn)對VBNC狀態(tài)菌的計數(shù)。

Zhu Lin等[67]通過Live/Dead BacLight細菌活力試劑盒、5-氰基-2,3-二聚四唑（5-cyano-2,3-ditolyltetrazolium chloride，CTC）對活細胞進行染色結合HPC的方法對死、活、可培養(yǎng)細胞計數(shù)，從而計算出VBNC細胞數(shù)。Du Meng等[68]用AODC、DVC結合的方法檢測溶藻弧菌，發(fā)現(xiàn)4 ℃條件下總細胞數(shù)不變，但活菌數(shù)明顯下降，說明有大量細胞進入VBNC狀態(tài)。García-Hernández等[69]采用DVC和熒光原位（fluorescentin situhybridization，F(xiàn)ISH）雜交技術（DVC-FISH）和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法，在不同溫度下對人工污染的食物基質中感染致病菌的活細胞進行檢測和量化，總檢測和鑒定時間縮短了4 h，可以很好地彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測的缺點。光學檢測法結果直觀、清晰，但是細菌種類之間沒有區(qū)分，可能導致對目標菌株的錯誤判斷。表2為常見的食源性致病菌VBNC狀態(tài)檢測方法比較。

表2 食源性致病菌VBNC狀態(tài)檢測方法比較Table 2 Molecular assays for detecting VBNC state of foodborne pathogens

為研究VBNC狀態(tài)的細菌，除了上述3 種主要的檢測方法外，還有酶分析法、種群基因檢測法、PMA-CPA檢測、免疫熒光和免疫傳感器等方法[80-81]。而大多數(shù)方法只考慮了1 種存活參數(shù)，如呼吸活性、膜完整性、代謝活性[82]，有一定的局限性。所以測定細胞的活力參數(shù)時，需要將幾種方式結合，從細胞的形態(tài)、呼吸活性和酶活性等方面進行全面分析，使結果更有說服力。并且針對不同的致病菌、實驗條件、研究內(nèi)容，必須謹慎選擇各自的方法。

4 結 語

食源性致病菌可在不利于自身生長的環(huán)境條件下進入VBNC狀態(tài)來維持自身生存，反觀大多數(shù)影響致病菌進入VBNC狀態(tài)的條件與食品生產(chǎn)加工存儲方式密切相關，如低溫冷藏、高溫消毒、紫外線殺菌以及食品添加劑等。進入VBNC狀態(tài)而未被殺死的食源性致病菌，一方面會導致常規(guī)方法對食源性致病菌VBNC狀態(tài)的漏檢，另一方面會造成食品安全問題。因此針對目前食源性致病菌VBNC狀態(tài)的研究展望如下：1）加強對VBNC細菌復蘇條件優(yōu)化的研究。從目前的研究來看，VBNC狀態(tài)細菌復蘇主要是采用簡單的升溫和培養(yǎng)基內(nèi)添加營養(yǎng)物質的方式，今后應考慮依靠食品基質來提供營養(yǎng)條件復蘇，如把VBNC狀態(tài)的致病菌接種在新鮮水果、蔬菜、肉類上以實現(xiàn)復蘇，這樣更加接近于食源性致病菌的生存環(huán)境；2）深入探討細菌進入VBNC狀態(tài)后與正常生理狀態(tài)下的轉錄組學差異。目前的研究主要集中在影響細菌進入VBNC的因素，缺乏針對食源性致病菌VBNC狀態(tài)以及復蘇狀態(tài)下全面的毒力基因、耐藥基因、運動相關基因等的表達；目前關于細菌VBNC狀態(tài)形成及復蘇機制研究較少，且不同菌的生理生化特性不同，很難建立統(tǒng)一的機制；在以后的研究中通過轉錄組學和蛋白組學的聯(lián)合分析，研究VBNC狀態(tài)形成機制和復蘇機制可能是未來食源性致病菌VBNC狀態(tài)研究的一個熱點；3）研發(fā)針對VBNC狀態(tài)細菌更加全面有效的檢測方法?，F(xiàn)有方法來看還存在一些不足，如目前對于VBNC狀態(tài)細菌的檢測還無法區(qū)分不同狀態(tài)下的細菌，需要提高靈敏度和精確度，開發(fā)更多、更簡便的檢測方法來避免漏檢情況出現(xiàn)，為食品安全檢測、疾病預防提供更為有效的方法和途徑；4）深入探討細菌進入VBNC狀態(tài)的時間。由于檢測方法的限制，大部分VBNC細菌仍會逃過檢測，并且也無法判斷分離檢測出的細菌進入VBNC狀態(tài)的時間，對人類的危害風險評估仍是一個難點；5）研發(fā)分離VBNC狀態(tài)菌的方法。分離VBNC狀態(tài)菌也是非常困難的，需要研發(fā)更準確、高效的技術來突破這一難關；6）深入研究亞致死損傷細胞、休眠細胞、VBNC細胞之間的區(qū)別。目前雖有大量研究證明VBNC狀態(tài)細胞可以復蘇成功，但研究VBNC狀態(tài)復蘇成功與否卻存在爭議，關于復蘇的是亞致死細胞還是VBNC細胞尚不清楚，且這兩者有極大的相似之處，因此需要深入探討這幾種細胞之間的生理生化特性，以判斷真正被復蘇的細胞。