陳孟權(quán) 單婷婷 林春春 孔萬(wàn)仲

男性不育癥是指夫婦雙方未采取避孕措施同居生活1 年以上，男方因素導(dǎo)致女方不孕的疾病。據(jù)報(bào)道，約50%的不育夫婦是由男性因素導(dǎo)致的，約一半的男性不育患者表現(xiàn)為少精癥和弱精癥[1]，其中弱精癥是指精子前向運(yùn)動(dòng)百分率＜32%或精子總活力＜40%。30%～40%的男性均存在一定程度的精子數(shù)量或質(zhì)量異常[1]，約40%的特發(fā)性男性不育癥表現(xiàn)出遺傳易感性[2]，精子線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）作為細(xì)胞核外的獨(dú)立遺傳物質(zhì)，在男性不育中可能發(fā)揮重要作用[3]。線粒體主要在氧化磷酸化等過(guò)程中發(fā)揮作用，是精子結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)能力、鞭毛功能和正常受精等環(huán)節(jié)的能量保障[4-7]。mtDNA 含有呼吸鏈復(fù)合體部分亞基的多肽基因[8]，但由于缺乏組蛋白保護(hù)，易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的損傷，同時(shí)其DNA 修復(fù)系統(tǒng)作用有限，導(dǎo)致其突變率較核基因高出10～100 倍[9]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)mtDNA 的高頻突變與弱精癥相關(guān)[10-11]。據(jù)報(bào)道，在弱精癥患者中存在多種類(lèi)型的mtDNA 大片段缺失，如4977bp、7345bp、7599bp、8476bp、9328bp 等[12-13]，這些缺失區(qū)域均包含ATP6、ATP8、COX3、ND3、ND4L、ND4 等片段，其中ATP6 和ATP6/8 重疊區(qū)域的T8993G、T9185C 及C8561G突變可能導(dǎo)致復(fù)合體Ⅴ的組裝不良和穩(wěn)定性受損[14-15]，COX3 對(duì)復(fù)合體Ⅳ活性具有調(diào)節(jié)作用，G9396A突變引起的氨基酸改變可能導(dǎo)致線粒體腦病或肌病[16]。本研究對(duì)精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 基因進(jìn)行測(cè)序，分析并探討這些區(qū)域的基因突變與弱精癥之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2019 年7 月至2021 年3 月在溫州市中醫(yī)院就診且行精液檢查的134 例弱精癥患者為弱精癥組，均符合第5 版《WHO 人類(lèi)精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中弱精癥的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)（精液常規(guī)檢查顯示精子前向運(yùn)動(dòng)率＜32%或精子總活力＜40%），且有1 年以上不育史，其配偶的婦產(chǎn)科相關(guān)檢查均正常。選取同期至本院其他原因就診的129 例精液常規(guī)檢查結(jié)果正常的患者為對(duì)照組。弱精癥組年齡32（29，35）歲，對(duì)照組年齡32（29，36）歲，兩組患者年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）留樣時(shí)禁欲2～7 d；（2）既往體??；（3）無(wú)重要臟器損傷及自身免疫性疾??；（4）無(wú)睪丸損傷、附睪炎、泌尿系統(tǒng)感染等病史；（5）無(wú)相關(guān)性腺器官發(fā)育異常史；（6）常規(guī)精液檢查和精子動(dòng)力形態(tài)分析等結(jié)果齊全。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：WZY2021-KT-045），所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液常規(guī)檢查 所有患者按要求留取精液，使用專(zhuān)用容器收集單次射精的全部精液，0.5 h 內(nèi)保溫送檢。全部精液樣本均置于37 ℃恒溫孵箱，待液化后使用精子質(zhì)量檢測(cè)分析系統(tǒng)（型號(hào)：CFT-9201，江蘇瑞祺生命科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行精液常規(guī)檢查，分析精子總活力、精子濃度等指標(biāo)。

1.2.2 精子基因組測(cè)序分析 采用PCR 法。使用基因組DNA 提取試劑盒（批號(hào)：03427，北京天根生化科技有限公司）提取精子基因組DNA，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后存于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。委托上海捷瑞生物工程有限公司合成COX3、ATP6、ATP8 基因引物[17]，引物信息見(jiàn)表1。配置20 μL 反應(yīng)體系：DNA 模板2 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL，Primer F/R（10 μmol/L）0.4 μL，Taq酶0.1 μL，ddH2O 11.9 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min；4 ℃保存。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）確認(rèn)PCR 產(chǎn)物后送尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，為保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，全部樣本均采用雙向重復(fù)測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，查找和分析突變位點(diǎn)。

表1 基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者精液常規(guī)檢查結(jié)果比較 弱精癥組精子總活力和精子濃度均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組患者精液常規(guī)檢查結(jié)果比較

2.2 兩組患者精子基因組測(cè)序結(jié)果比較 兩組患者精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 基因測(cè)序結(jié)果顯示，弱精癥組、對(duì)照組精子中分別發(fā)現(xiàn)86、87 個(gè)突變位點(diǎn)，突變類(lèi)型均以同義突變、錯(cuò)義突變?yōu)橹?；兩組患者突變類(lèi)型、突變區(qū)域比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

2.3 兩組患者精子mtDNA 基因突變分析 突變發(fā)生率＞5%的突變位點(diǎn)共有15 個(gè)，其中ATP6、ATP8、COX3 區(qū)域分別有8、1、6 個(gè)，錯(cuò)義突變、同義突變、移碼突變分別有8、6、1 個(gè)。本次分析發(fā)現(xiàn)3 個(gè)未被報(bào)道過(guò)的突變類(lèi)型：A8962C、AT9934A、A8812T；其中A8962C、AT9934A 在弱精癥組中的發(fā)生率均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），而A8812T 在對(duì)照組中的發(fā)生率明顯高于弱精癥組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 兩組患者精子mtDNA 基因突變分析

3 討論

弱精癥是多數(shù)男性不育癥的主要表現(xiàn)，即精子運(yùn)動(dòng)能力減弱，進(jìn)而影響精子細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致受精失敗。作為細(xì)胞能量來(lái)源的線粒體，主要通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[18]，是細(xì)胞生命活動(dòng)的保障，與精子活力息息相關(guān)。線粒體功能出現(xiàn)任何異常，都可能導(dǎo)致細(xì)胞呼吸障礙，ATP 生成不足，對(duì)精子的產(chǎn)生和發(fā)育造成影響。研究表明，睪丸組織中mtDNA 突變并大量累積可能導(dǎo)致生精細(xì)胞呼吸受損、減數(shù)分裂停滯以及精子細(xì)胞缺氧而發(fā)生凋亡等[19]，同時(shí)高水平ROS 和自由基對(duì)線粒體和mtDNA 均可造成嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)一步影響精子活力，最終導(dǎo)致男性不育[20]。

據(jù)目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，與弱精癥相關(guān)的mtDNA 大片段缺失有4977bp、7345bp、7599bp、8476bp、9328bp等[12-13]，缺失涉及的區(qū)域涵蓋ATP6、ATP8、COX3、ND3、ND4L、ND4 等，甚至累及ND5、ND6、CYTB 以及多個(gè)tRNA 基因。這些編碼基因作為線粒體呼吸鏈的重要組成部分，其缺失或突變都會(huì)影響精子細(xì)胞的正常功能。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)COX3 基因的G9267A 突變可損傷氧化磷酸化并促進(jìn)ROS 產(chǎn)生[21]，ATP6 基因的A8701G 和G9053A 突變會(huì)增加受精失敗風(fēng)險(xiǎn)[22-23]；此外，在不同腫瘤細(xì)胞中能檢測(cè)到復(fù)合體Ⅴ亞基表達(dá)下調(diào)[24]，多數(shù)神經(jīng)退行性疾病和低生育力與ATP6 基因的A8860G突變有關(guān)[17，25-26]。本研究對(duì)精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 突變與弱精癥的關(guān)系作進(jìn)一步探討，通過(guò)對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，弱精癥組與對(duì)照組在突變類(lèi)型、突變區(qū)域等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且突變類(lèi)型均以同義突變、錯(cuò)義突變?yōu)橹?。本研究進(jìn)一步作序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，突變發(fā)生率＞5%的突變位點(diǎn)有15個(gè)，其中3 個(gè)是未被報(bào)道過(guò)的突變類(lèi)型（A8962C、AT9934A、A8812T），位于ATP6、COX3 的A8962C 和AT9934A 在弱精癥組中的發(fā)生率均明顯高于對(duì)照組，而A8812T 在對(duì)照組中的發(fā)生率明顯高于弱精癥組。A8962C 是將該位點(diǎn)編碼的蘇氨酸變成脯氨酸的錯(cuò)義突變，該突變可能導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ合成的數(shù)量或空間結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，造成能量供應(yīng)不足和ROS 失調(diào)[27]。COX3 作為人類(lèi)高保守基因，在復(fù)合體Ⅳ活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，同時(shí)復(fù)合體Ⅳ參與形成的超復(fù)合物結(jié)構(gòu)又可以減少ROS 的產(chǎn)生[28-29]，而AT9934A 是該位點(diǎn)缺失一個(gè)核苷酸導(dǎo)致的移碼突變，由此引起的氨基酸順序錯(cuò)亂，可能造成復(fù)合體Ⅳ的活性或穩(wěn)定性受損。值得關(guān)注的是，ATP6 的A8812T 突變使得該位點(diǎn)編碼的蘇氨酸變?yōu)榻z氨酸，其在對(duì)照組中的發(fā)生率為44.19%，但在弱精癥組中卻未檢測(cè)到，因此我們推測(cè)該突變可能對(duì)精子活力起保護(hù)作用。

綜上所述，精子mtDNA ATP6、ATP8 和COX3 突變與弱精癥存在一定的關(guān)系，其中A8962C、AT9934A 突變與弱精癥的發(fā)生有關(guān)，而A8812T 突變可能對(duì)精子活力起保護(hù)作用。