王敏, 苗玲, 趙之寒

邯鄲市中心醫(yī)院胸外科(河北邯鄲 056000)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是主要肺癌類型,占比約為80%[1]。因其發(fā)病隱匿,早期無(wú)特異性體征,就診時(shí)多數(shù)患者已發(fā)展至中晚期,錯(cuò)失最佳手術(shù)時(shí)機(jī),僅可實(shí)施姑息性放化療,但療效不佳。數(shù)據(jù)顯示,晚期NSCLC術(shù)后患者5年生存率僅約15%,且具有較高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此積極探索NSCLC發(fā)病機(jī)制及分子生物學(xué)特點(diǎn),明確有效的診斷依據(jù)及治療靶點(diǎn)成為目前臨床熱點(diǎn)研究課題。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是無(wú)蛋白質(zhì)編碼的RNA,可在基因組轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平及表觀遺傳學(xué)等層面調(diào)控基因表達(dá)[3]。已有研究證實(shí)結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌中l(wèi)ncRNA生物學(xué)功能,與腫瘤侵襲、增殖、發(fā)生有關(guān),可為臨床診斷、治療提供重要參考依據(jù)[4-6]。微小RNA(miRNA)是內(nèi)源非編碼RNA,可調(diào)控基因表達(dá),已有研究證實(shí)其可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化等過(guò)程[7]。但目前NSCLC分子生物學(xué)研究中有關(guān)lncRNA、miRNA的報(bào)道較少。本研究通過(guò)分析NSCLC癌組織LncRNA LINC00460、miR-98-5p表達(dá)與病理特征間關(guān)系及KM曲線,旨在為NSCLC發(fā)病機(jī)制及靶向治療提供依據(jù)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年12月我院NSCLC患者57例,另取距腫瘤邊緣2 cm癌旁組織設(shè)為對(duì)照。其中女22例,男35例,年齡43～78歲,平均(60.25±8.51)歲,TNM分期:9例Ⅰ期,21例Ⅱ期,27例Ⅲ期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(審批號(hào):20161205)。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病理診斷證實(shí)為NSCLC,符合《2017 ESMO臨床實(shí)踐指南:早期和局部進(jìn)展非小細(xì)胞肺癌的診斷,治療和隨訪》[8]中NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)均給予手術(shù)治療,術(shù)前無(wú)放化療史或其他輔助治療史;(3)依從性良好,精神正常,能良好配合。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴有慢阻肺、支氣管哮喘、支氣管哮喘等其他肺部疾病;(2)合并藥物過(guò)敏史、急性感染、血液性疾病、心腎肝等功能障礙;(3)合并近3個(gè)月抗生素使用史或其他部位腫瘤;(4)中途退出或臨床資料不全。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本 留取術(shù)中癌組織及距腫瘤邊緣2 cm癌旁組織,液氮罐凍存24 h,之后冷凍(-70℃)保存。

1.2.2 檢測(cè)癌組織及癌旁組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)量 解凍標(biāo)本組織,超聲處理,提取總RNA,First Strand cDNA Synthesis Kit/miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA,通過(guò)qRT-PCR儀及TaqMan?Universal Master Mix擴(kuò)增、檢測(cè)cDNA。作用條件:預(yù)變性(94℃)4 min,變性(93℃)15 s,退火(64℃)30 s,40個(gè)循環(huán)。GAP-DH、U6作為內(nèi)參,miR-98-5p引物:正向:5′-AGGATTCTGCTCATGCCAG-3′,反向:5′-TGAATATGCCACACACCAG-3′;LncRNA LINC00460引物:上游5′-ACAGCAT-GAGCCAGGA-CATC-3′,下游5′-GAAAGCTGCAACAT-GCTCCC-3′。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-98-5p、LncRNA LINC00460相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3 收集病理特征 查閱病歷記錄,收集患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理分型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、手術(shù)方式等。

1.2.4 隨訪 隨訪起點(diǎn)設(shè)為手術(shù)當(dāng)日,開展門診或電話隨訪,患者死亡或2021年12月31日為隨訪終點(diǎn),統(tǒng)計(jì)術(shù)后總生存率。至隨訪結(jié)束,共21例(36.84%)死亡。

1.3 觀察指標(biāo) (1)癌組織及癌旁組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)。(2)癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)與病理特征的相關(guān)性。(3)不同癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)患者總生存率。(4)死亡及存活患者癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)。(5)癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。(6)分析miR-98-5p、LncRNA LINC00460對(duì)患者預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 癌組織及癌旁組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá) 癌組織miR-98-5p表達(dá)低于癌旁組織,LncRNA LINC00460表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05),見(jiàn)表1、圖1～2。

表1 癌組織及癌旁組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)

圖1 miR-98-5p表達(dá)

圖2 LncRNA LINC00460表達(dá)

2.2 癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)與病理特征的相關(guān)性 癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)與年齡、性別、病理分型、腫瘤直徑、手術(shù)方式無(wú)關(guān)(P>0.05);癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)與臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)與病理特征的相關(guān)性

2.3 不同癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)患者總生存率 以癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)均值為界分高表達(dá)、低表達(dá),其中miR-98-5p高表達(dá)23例,低表達(dá)34例;LncRNA LINC00460高表達(dá)30例,低表達(dá)27例。Kaplan-Meier生存分析顯示,癌組織LncRNA LINC00460高表達(dá)者總生存率低于低表達(dá)者(2=5.338,P=0.021),癌組織miR-98-5p高表達(dá)者總生存率高于低表達(dá)者(2=6.732,P=0.010),見(jiàn)圖3、4。

圖3 不同miR-98-5p表達(dá)患者生存情況

圖4 不同LncRNA LINC00460表達(dá)患者生存情況

2.4 死亡及存活患者癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)及術(shù)后治療方式 死亡者癌組織miR-98-5p表達(dá)低于存活者,LncRNA LINC00460表達(dá)高于存活者(P<0.05);死亡者與存活者術(shù)后治療方式對(duì)比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3、4。

表3 死亡及存活患者癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)

表4 死亡及存活患者術(shù)后治療方式 例(%)

2.5 癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 以患者預(yù)后情況作為因變量(死亡=1,存活=0),以癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)(<均值賦值為1,≥均值賦值為2)、年齡(<60歲=1,≥60歲=2)、性別(男=1,女=0)、病理分型(腺癌是=1,否=0)、腫瘤直徑(<3 cm=1,≥3 cm=2)、臨床分期(Ⅰ期=1,Ⅱ期=2,Ⅲ期=3)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是=1,否=2)、分化程度(低分化=1,中分化=2,高分化=3)、手術(shù)方式(單側(cè)全肺切除是=1,否=0)作為自變量,進(jìn)行多因素logistic回歸分析,得到方程logit(p)=-0.848×miR-98-5p+1.245×LncRNA LINC00460+1.491×臨床分期+1.335×淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移+1.469×分化程度,證實(shí)控制臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度混雜變量后,miR-98-5p表達(dá)降低、LncRNA LINC00460表達(dá)升高仍是NSCLC患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 癌組織miR-98-5p、LncRNA LINC00460表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

2.6 miR-98-5p、LncRNA LINC00460評(píng)估患者預(yù)后的列線圖分析 根據(jù)2.5 logistic回歸方程篩選出的miR-98-5p、LncRNA LINC00460、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度構(gòu)建列線圖預(yù)測(cè)模型,校準(zhǔn)曲線分析結(jié)果顯示,列線圖預(yù)測(cè)模型評(píng)估NSCLC患者病死的風(fēng)險(xiǎn)與實(shí)際病死風(fēng)險(xiǎn)吻合度較高(經(jīng)Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗(yàn),2=6.902,P=0.547),見(jiàn)圖5、6。

圖5 miR-98-5p、LncRNA LINC00460評(píng)估患者預(yù)后的列線圖

圖6 校準(zhǔn)曲線

3 討論

NSCLC是一種呼吸系統(tǒng)腫瘤,病死率、患病率較高。手術(shù)是目前主要治療手段,但因其創(chuàng)傷性、高復(fù)發(fā)率,臨床預(yù)后不甚理想。故積極尋求與NSCLC發(fā)生有關(guān),且能評(píng)價(jià)預(yù)后的標(biāo)志物有積極意義。

基因組學(xué)表明,人類基因組僅2%左右可編碼蛋白質(zhì),其他部分由非編碼RNA構(gòu)成[9]。大量證據(jù)顯示,腫瘤發(fā)生過(guò)程可能有非編碼RNA參與[10]。從而可為生物學(xué)層面研究腫瘤提供新視角。lncRNA能調(diào)控免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、染色體重構(gòu)、個(gè)體發(fā)育、自噬、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡/增殖等,與肺癌、慢性阻塞性肺疾病等有關(guān)[11]。研究表明,NSCLC患者癌組織lncRNA GABPB1-IT1表達(dá)下調(diào),lncRNA GAS5呈過(guò)表達(dá),均能作為NSCLC診斷、預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[12-13]。上述結(jié)果表明,lncRNA表達(dá)與NSCLC病理變化有關(guān)。LncRNA LINC00460是lncRNA中一員,結(jié)直腸癌瘤組織中表達(dá)升高,可調(diào)控p-Akt信號(hào)通路,促進(jìn)/抑制癌細(xì)胞血管形成及細(xì)胞增殖[14]。丁夢(mèng)杰等[15]研究表明,NSCLC癌組織LncRNA LINC00460表達(dá)上調(diào),其表達(dá)水平能反映NSCLC惡性程度。本研究結(jié)果支持上述研究,癌組織LncRNA LINC00460表達(dá)高于癌旁組織,且與分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。推測(cè)LncRNA LINC00460能與相關(guān)基因靶向結(jié)合,調(diào)控有關(guān)信號(hào)通路,抑制NSCLC細(xì)胞凋亡,促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、增殖,從而參與NSCLC發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),LncRNA LINC00460高表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,且表達(dá)高者生存率低于低表達(dá)者。LINC00460是人13號(hào)染色體DNA(106376563-106377792)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,可影響間質(zhì)、上皮轉(zhuǎn)化過(guò)程,誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移;同時(shí)其能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RNA,吸附miR-302c-5p,調(diào)控FOXA1表達(dá),起到促癌效果[16-17]。因此LncRNA LINC00460表達(dá)能反映NSCLC惡性進(jìn)程及預(yù)后情況。但其在NSCLC中高表達(dá)的確切機(jī)制尚未清楚,仍需進(jìn)一步研究。

miRNA屬于非編碼RNA之一,能調(diào)節(jié)血管生成、生長(zhǎng)發(fā)育,調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、遷移、凋亡,參與炎癥、免疫反應(yīng)[18]。miR-98-5p是miRNA中一員,張曉瑩等[19]研究指出,miR-98-5p可調(diào)控HMGA2,延緩喉鱗癌進(jìn)程。KE等[20]研究顯示,miR-98-5p能與α-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶靶向結(jié)合,控制NSCLC進(jìn)展。支持本研究結(jié)果,NSCLC患者癌組織miR-98-5p低表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān),且是NSCLC患者預(yù)后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。分析原因可能與miR-98-5p能和相關(guān)基因靶向結(jié)合,調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。另外本研究Kaplan-Meier生存分析表明,癌組織miR-98-5p低表達(dá)者生存率低于高表達(dá)者。分析相關(guān)機(jī)制:肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)是主要肺部固有免疫細(xì)胞,其中M1型能分泌促炎因子,刺激炎癥進(jìn)展,而M2型能抑制炎癥,減輕肺損傷[21]。研究[22]表明,miR-98-5p高表達(dá)能介導(dǎo)AMs向M1轉(zhuǎn)化,抑制其分化成M2型。同時(shí)有研究表明,LncRNA 能通過(guò)吸附miRNA而抑制miRNA表達(dá)及活性,如LncRNA LINC00460能吸附miR-98-5p繼而抑制miR-98-5p在抗腫瘤中的生物學(xué)活性,導(dǎo)致IL-β、IL-6等促炎因子分泌增加[23-24]。因此LncRNA LINC00460低表達(dá),miR-98-5p高表達(dá)能抑制炎癥反應(yīng),減輕肺損害。進(jìn)一步繪制列線圖模型分析發(fā)現(xiàn),所構(gòu)建模型評(píng)估NSCLC患者病死的風(fēng)險(xiǎn)與實(shí)際病死風(fēng)險(xiǎn)具有較高一致性,呈現(xiàn)出較高預(yù)測(cè)價(jià)值,可指導(dǎo)臨床積極完善干預(yù)策略。

綜上,NSCLC患者癌組織miR-98-5p表達(dá)異常下降,LncRNA LINC00460表達(dá)異常升高,且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等病理特征有關(guān);同時(shí)也是影響NSCLC患者生存的重要原因,與預(yù)后不良密切相關(guān)。但本研究仍有以下不足:(1)樣本量小。(2)未納入放化療史患者,可能一定程度影響研究結(jié)果。因此后期需增加樣本量,并收集完善信息,進(jìn)一步闡明LncRNA LINC00460、miR-98-5p表達(dá)水平對(duì)NSCLC患者的作用機(jī)制及臨床意義。

利益相關(guān)聲明：不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：王敏:論文撰寫;苗玲:數(shù)據(jù)分析;趙之寒:資料整理。