陳蔚雯, 駱愛姝, 劉麗娜, 朱紅紅, 任向東

鹽城市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(江蘇鹽城 224500)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病,其特征是產(chǎn)生多種自身抗體、免疫復(fù)合物沉積和多器官損傷[1]。早期診斷和適當(dāng)治療可預(yù)防SLE患者的嚴(yán)重臨床表現(xiàn)。盡管近年來SLE治療方案的效果取得了顯著進(jìn)展,但由于發(fā)病機(jī)制不明確,大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[2]。因此,迫切需要努力研究SLE的遺傳和分子異常,并且對于識(shí)別SLE診斷的新生物標(biāo)志物至關(guān)重要。miRNA是小的非編碼RNA(21～24個(gè)堿基雙鏈體),通常是不完全堿基配對的,并通過與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物的關(guān)聯(lián)在靶轉(zhuǎn)錄本的3′非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)形成部分雙鏈體,miRNA雙鏈的一條鏈與3′ UTR中的靶mRNA序列結(jié)合,最終導(dǎo)致靶mRNA的翻譯抑制或降解,是重要的基因調(diào)節(jié)因子[3]。miRNA是一種典型的表觀遺傳修飾類型,參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制[4]。既往證據(jù)表明miRNA在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)育和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面有潛在作用[5]。已知miRNA通過與先天免疫和適應(yīng)性免疫相互作用,在SLE的分子機(jī)制中具有重要作用[6]。此外,由于其高穩(wěn)定性,miRNA代表了診斷和監(jiān)測各種病理的有效生物標(biāo)志物[7]。然而miRNA在SLE診斷和分層中的功能仍未確定。因此,了解miRNA與SLE的關(guān)聯(lián)將為疾病發(fā)病機(jī)制提供新的見解,并有助于開發(fā)新的診斷生物標(biāo)志物。本研究的主要目的是分析外周血miRNAs差異性表達(dá)與SLE病情及預(yù)后的關(guān)系,為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2020年10月至2022年10月入住本院風(fēng)濕免疫科SLE患者。有其他風(fēng)濕性疾病、傳染病或癌癥的受試者被排除在外。經(jīng)過常規(guī)健康檢查的年齡和性別匹配的健康對照者由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的風(fēng)濕病學(xué)家嚴(yán)格評估并行存檔。排除:(1)具有風(fēng)濕性疾病、傳染病或癌癥病史者;(2)風(fēng)濕性疾病家族史者;(3)有風(fēng)濕性表現(xiàn)(包括腎炎、關(guān)節(jié)炎、皮疹和漿膜炎)者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2020KA001),所有參與者都簽署了書面知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集 將每個(gè)受試者的外周靜脈血收集在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的真空管中,抗凝劑和外周血單核細(xì)胞(PBMC)在2 h內(nèi)分離出來。

1.3 研究流程 該研究包括兩個(gè)主要階段,即探索和驗(yàn)證階段。在探索階段,在二代測序(NGS)中檢測了來自4例SLE病例和4例健康對照者的PBMC標(biāo)本,以檢測miRNA表達(dá)譜。在驗(yàn)證階段,通過定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)評估來自32例SLE患者和32例健康對照者的PBMC標(biāo)本,以檢測用于NGS數(shù)據(jù)驗(yàn)證的候選miRNA的表達(dá)水平。此外,根據(jù)SLE患者有無腎炎和關(guān)節(jié)炎分為腎炎SLE和無腎炎SLE,關(guān)節(jié)炎SLE和無關(guān)節(jié)炎SLE。

1.4 PBMC分離和RNA純化 通過Ficoll-Paque密度梯度離心法從SLE患者和健康對照者中進(jìn)行PBMC分離,將稀釋的血液樣品小心地分層在Ficoll-Paque上,并在18℃下以400g離心30 min,將單核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,并用平衡鹽溶液洗滌分離的細(xì)胞,總RNA通過制造商提供的方案用Trizol純化,在 NanoDrop 2000(美國賽默飛世爾)1% 瓊脂糖凝膠電泳和安捷倫 2100 生物分析儀(美國安捷倫科技公司)上評估RNA質(zhì)量和數(shù)量。

1.5 文庫生成和差異表達(dá)分析 miRNA測序文庫是根據(jù)制造商提供的說明,使用Illumina小RNA樣品制備試劑盒從提取的miRNA樣品中制備的,從總RNA中分離小RNA(18～30 nt)以使用5′和3′接頭進(jìn)行連接,以連接產(chǎn)物為模板完成RT-PCR,將PCR產(chǎn)物聚集在一起,并使用Illumina HiSeqTM2500平臺(tái)(美國Illumina)進(jìn)行測序。對于miRNA測序,序列讀數(shù)在文庫構(gòu)建后被清除,比較原始讀取計(jì)數(shù)歸一化后各組的miRNA,數(shù)據(jù)根據(jù)倍數(shù)變化(FC)公式[FC=log2(處理/對照)]進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定義為P<0.05,log2(FC)>0.5。

1.6 cDNA和qPCR的制備 互補(bǔ)DNA(cDNA)由PrimeScriptTMRT試劑盒(中國Takara Biotech)與miRNA干環(huán)引物合成,qPCR反應(yīng)使用TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(Takara Biotech)在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng))上進(jìn)行,PCR擴(kuò)增程序如下:在95℃下變性30 s,在95℃下變性40次,持續(xù)5 s,在60℃下34 s,候選miRNA和mRNA數(shù)量由2-ΔΔCt中電方法,U6和GAPDH分別用于歸一化。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因測定 為了開發(fā)含有人Foxo1 3′UTR的質(zhì)粒,從上?；蚧瘜W(xué)公司購買了質(zhì)粒GV272,并用XbaⅠ消化,在該質(zhì)粒中,螢火蟲熒光素酶的表達(dá)由SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng),多克隆位點(diǎn)位于螢火蟲熒光素酶的下游,化學(xué)合成了含有野生型人Foxo1 3′UTR(NM_002015)或在miR-183-5p結(jié)合位點(diǎn)(GTGCCAT)上發(fā)生突變的對應(yīng)物,后連接成GV272,產(chǎn)生質(zhì)粒GV-Foxo1-3′UTR-WT或GV-Foxo1-3′UTR-Mut,為了開發(fā)質(zhì)粒GV-hmiR-183-5p,將化學(xué)合成的DNA序列插入質(zhì)粒GV251中,其中miR-183-5p將在人U6的啟動(dòng)子下翻譯,所有構(gòu)建體均通過測序驗(yàn)證,表達(dá)雷尼拉熒光素酶的質(zhì)粒從上海基因化學(xué)公司訂購。

2 結(jié)果

2.1 SLE的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù) SLE病例和健康對照者在驗(yàn)證階段的特征見表1。SLE臨床癥狀為狼瘡性腎炎、關(guān)節(jié)炎(至少兩個(gè)關(guān)節(jié)受累)、皮疹(包括盤狀或蝶狀皮疹、口腔潰瘍、光敏)、漿膜炎(包括胸膜炎、心包炎),實(shí)驗(yàn)室特征包括紅細(xì)胞沉降率(ESR)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、補(bǔ)體3 (C3)和抗dsDNA抗體,對每位患者進(jìn)行評估,評估SLE患者的SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI),見表1。

表1 SLE患者的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)

2.2 SLE的miRNA相關(guān)熱圖分析 為了研究SLE患者和健康對照組樣本之間miRNA表達(dá)譜的不同簇,進(jìn)行了皮爾遜相關(guān),相關(guān)熱圖顯示,SLE患者和對照組根據(jù)miRNA表達(dá)譜具有不同的簇,除了SLE_F1,數(shù)據(jù)表明,miRNA表達(dá)譜能夠區(qū)分SLE患者和健康對照者,見圖1。

圖1 SLE的miRNA相關(guān)熱圖分析

2.3 SLE的miRNA火山圖和熱圖分析 為了鑒定SLE和對照組之間的差異表達(dá)miRNA,進(jìn)行了分層聚類分析,火山圖顯示,與對照組相比,SLE病例中有157個(gè)上調(diào)和110個(gè)下調(diào)的miRNA(log2(FC)>0.5和P<0.05]。熱圖分析顯示,這些差異表達(dá)的miRNA可以清楚地將SLE患者與健康對照者區(qū)分開來,見圖2。

2.4 SLE的miRNA的GO和KEGG富集分析 為了評估上述差異表達(dá)miRNA的生物學(xué)功能和途徑,進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析顯示差異表達(dá)的miRNA參與分子功能、蛋白質(zhì)結(jié)合和核苷酸結(jié)合活性等多種生物學(xué)過程,KEGG富集分析表明,差異表達(dá)的miRNA參與不同的通路,如癌癥、MAPK信號傳導(dǎo)和Rap1信號傳導(dǎo),兩項(xiàng)富集分析都表明,差異表達(dá)的miRNA與炎癥和免疫活動(dòng)有關(guān),見圖3、4。

圖3 SLE患者miRNA的GO富集分析

圖4 SLE患者miRNA的KEGG富集分析

2.5 SLE的miRNA表達(dá) 為了進(jìn)一步評估SLE中的miRNA失調(diào),在32例SLE和32例健康對照者中,通過qPCR評估了兩種上調(diào)的miRNA(has-miR-1-3p和has-miR-183-5p)和兩種下調(diào)的miRNA(has-miR-374b-3p和has-miR-19b-3p)。在4種候選miRNA中,miR-183-5p上調(diào)(P=0.005)和miR-374b-3p下調(diào)(P=0.016)在SLE病例中與對照組相比,而 miR-1-3p(P=0.318)和 miR-19b-3p(P=0.115)水平在兩組之間沒有顯示出顯著差異性,見表2。

表2 SLE患者的miRNA表達(dá)

2.6 SLE患者的miRNA的診斷價(jià)值 為了評估m(xù)iR-183-5p和miR-374b-3p在SLE中的潛在診斷價(jià)值,進(jìn)行ROC曲線分析。miR-183-5p和miR-374b-3p的ROC 曲線下面積(AUC)分別為0.703(95%CI:0.574～0.833)和0.681(95%CI: 0.542～0.826)。同時(shí),miR-183-5p與miR-374b-3p組合產(chǎn)生的AUC為0.832(95%CI:0.727～0.937),結(jié)果表明,miR-183-5p和miR-374b-3p對SLE檢測具有良好的診斷價(jià)值,其組合優(yōu)于單獨(dú)使用的miRNA,見圖5。

圖5 SLE患者的miRNA的ROC曲線分析

2.7 miR-183-5p 與SLE的相關(guān)性 為了確定miR-183-5p和miR-374b-3p在SLE中的潛在功能,研究了miR-183-5p和miR-374b-3p與SLE患者特征的關(guān)聯(lián)。與無腎炎的SLE病例相比,SLE伴腎炎病例的miR-183-5p升高(5.25±0.96vs. 1.99±0.78,t=8.89,P=0.018);與無關(guān)節(jié)炎的SLE病例相比,患有關(guān)節(jié)炎的SLE病例的miR-183-5p量增加(5.11±0.92vs. 2.09±0.84,t=8.79,P=0.022)。在相關(guān)性分析中,miR-183-5p表達(dá)與SLEDAI評分呈顯著正相關(guān)(P=0.040)和抗dsDNA抗體水平(P=0.033)。同時(shí),SLE病例的miR-374b-3p含量無論臨床特征如何都相似(P>0.05),并且沒有觀察到miR-374b-3p表達(dá)水平與各種臨床特征的相關(guān)性(P>0.05),見圖6。

圖6 miR-183-5p 與SLE的相關(guān)性

3 討論

SLE是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病,其特征是慢性免疫激活和多種免疫表型,SLE的發(fā)病機(jī)制知之甚少,目前的治療方法基于非特異性免疫抑制[8]。miRNA是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子,其生物學(xué)功能和與疾病的相關(guān)性正在得到深入研究,旨在闡明它們在各種途徑中的含義,這些途徑可能對檢測此類自身免疫性疾病或預(yù)測其并發(fā)癥有價(jià)值[9]。本研究進(jìn)行NGS以分析SLE患者和健康對照者的PBMC的miRNA譜。與健康對照者相比,SLE病例中分別有157和110個(gè)miRNA上調(diào)和下調(diào)。

先前發(fā)現(xiàn)miR-374b通過抑制AKT1和Wnt-16抑制T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這與自身免疫性疾病的免疫活性相關(guān)[10]。此外,miR-374b通過與JAM-2相互作用,通過p38/ERK信號傳導(dǎo)抑制細(xì)胞增殖并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡,這表明miR-374b有助于炎癥相關(guān)途徑[11]。因此,miR-374b可能參與SLE相關(guān)的炎癥反應(yīng)。miR-183-5p代表miR-183簇的主要成員,激活后可以在免疫細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)[12]。先前的報(bào)告表明,miR-183簇通過調(diào)節(jié)幾種促炎途徑在免疫細(xì)胞功能中具有關(guān)鍵功能[13]。從Graves眼眶病(GO)病例的外周血獲得的CD4+T細(xì)胞中miR-183和miR-96的量升高,過表達(dá)抗原特異性T細(xì)胞的miR-183和miR-96的過繼轉(zhuǎn)移加速了自身免疫性糖尿病的發(fā)作,而在CD4+T細(xì)胞中轉(zhuǎn)移特異性拮抗劑會(huì)延長疾病發(fā)作[14]。

SLE的復(fù)雜表現(xiàn)使其診斷變得困難。因此,進(jìn)一步評估m(xù)iRNA可能有助于發(fā)現(xiàn)SLE的新診斷生物標(biāo)志物。本研究在32例SLE病例和32例對照中選擇并驗(yàn)證了兩種上調(diào)和兩種下調(diào)的miRNA。與對照組相比,SLE病例中的miR-183-5p和miR-374b-3p含量分別升高和降低。同時(shí),miR-183-5p與miR-374b-3p組合的AUC為0.832(95%CI:0.727～0.937)。結(jié)果證明了miR-183-5p和miR-374b-3p組合在SLE中的診斷價(jià)值。此外,患有腎炎和關(guān)節(jié)炎的SLE病例的miR-183-5p含量升高,表明miR-183-5p可能與腎臟和關(guān)節(jié)的破壞有關(guān)。在SLE患者中,miR-183-5p量與SLE DAI和抗dsDNA抗體呈正相關(guān),表明miR-183-5p可能是評估SLE活性的良好指標(biāo)。但由于本研究為單中心、小樣本研究,其結(jié)論需要在多中心、大樣本研究中得到證實(shí)。

綜上所述,本研究顯示與健康對照組相比,SLE病例PBMC中的miRfNA表達(dá)譜顯著改變,miR-183-5p是SLE的潛在診斷生物標(biāo)志物。miR-183-5p量與SLE DAI和抗dsDNA抗體呈正相關(guān),這意味著miR-183-5p與SLE疾病活動(dòng)度有關(guān)。需要進(jìn)一步的研究來揭示這些miRNA在SLE中的功能,這將最終改善SLE的診斷和治療。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：陳蔚雯、駱愛姝、劉麗娜、朱紅紅負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)論文撰寫和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì);任向東負(fù)責(zé)論文修改。