邢海艷，李超，魯素雅，劉洋

［1.淮安市食品藥品檢驗所，江蘇淮安 223005； 2.凱萊英生命科學(xué)技術(shù)（天津）有限公司，天津 300457］

為了延長使用期限，化妝品中通常會添加防腐劑以抑制微生物的生長?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版，以下簡稱“規(guī)范”)中明確規(guī)定了51種可供使用的防腐劑及其最大使用量，同時還規(guī)定了限用物質(zhì)[1]?？ㄋ墒羌谆犬愢邕蜻?、甲基異噻唑啉酮與氯化鎂和硝酸鎂的混合物，其中甲基氯異噻唑啉酮與甲基異噻唑啉酮的質(zhì)量比為3∶1，規(guī)范中規(guī)定甲基異噻唑啉酮的限量(質(zhì)量分數(shù)，下同)為0.01%，卡松只能用于淋洗類產(chǎn)品，使用限量為0.015%，并且與甲基異噻唑淋酮不能同時使用。甲基氯異噻唑啉酮與甲基異噻唑啉酮均有較強的致敏性，超量使用會導(dǎo)致接觸性皮炎[2]。有研究表明，卡松與對羥基苯甲酸酯類配合使用效果更佳[3-4]，對羥基苯甲酸酯類化合物是化妝品中使用率前三位的防腐劑之一[5]，對羥基苯甲酸酯類防腐劑復(fù)合使用抑菌能力明顯高于單酯[6]，但也有文獻報道此類化合物有類似雌激素作用[7-10]。規(guī)范中規(guī)定4-羥基苯甲酸甲酯和4-羥基苯甲酸乙酯的使用限量為0.4%，4-羥基苯甲酸丙酯和4-羥基苯甲酸丁酯的使用限量為0.14%(質(zhì)量分數(shù)，均按4-羥基苯甲酸計，下同)，聯(lián)合使用總限量為0.8%。

有報道嬰幼兒化妝品的標(biāo)簽與實際檢出防腐劑不符合的情況和甲基異噻唑啉酮和卡松使用不符合規(guī)定等問題[11-13]，這兩類化合物的常見檢測方法有高效液相色譜法[1]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14]、高分辨率質(zhì)譜法[15]，同時檢測卡松及對羥基苯甲酸酯類的報道較少[16-17]，規(guī)范的液相色譜檢測的靈敏度較低，其中甲基氯異噻唑啉酮定量限與限度值接近，未能避免檢測不準(zhǔn)或假陽性的現(xiàn)象，因此筆者建立靈敏度更高的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，同時測定甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉啉酮、4-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸丁酯、4-羥基苯甲酸異丙酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、4-羥基苯甲酸戊酯、4-羥基苯甲酸苯酯、4-羥基苯甲酸芐酯等12 種防腐劑，為市場監(jiān)管提供技術(shù)與數(shù)據(jù)支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters acquity型，美國Waters公司。

質(zhì)譜儀：AB QQQ 4000+型，上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司。

超聲清洗儀：KQ-250DⅤ型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水機：美國密理博公司。

有機系針筒式微孔濾膜：0.45 μm，上海安譜公司。

電子天平：XS205D 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

乙腈、甲醇、甲酸：均為色譜純，德國默克公司；

化妝品樣品：均為市售的兒童化妝品。

12種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：基本信息見表1。

表1 12種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：飛諾美Kinetex?C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；流動相：A 相為0.1%(體積分數(shù))甲酸溶液，B 相為乙腈，按表2 程序進行梯度洗脫，流量為0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：2 μL。

表2 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜儀

電噴霧離子(ESⅠ)源；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；碰撞氣：氮氣，壓力68.95 kPa；氣簾氣：氮氣，壓力206.85 kPa；霧化氣：氮氣，壓力379.225 kPa；輔助氣：氮氣，壓力379.225 kPa；毛細管電壓：5 000 Ⅴ；霧化溫度：500 ℃；12種目標(biāo)物質(zhì)譜分析參數(shù)見表3。

表3 12種防腐劑質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3 溶液配制

分別稱取12 種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg，加入甲醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別取各標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋、定容，制成各組分質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 mL，分別置于7 只10 mL 容量瓶中，用甲醇配制成各目標(biāo)物質(zhì)量濃度均分別為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

取化妝品樣品0.20 g，置于25 mL 具塞試管中，加入甲醇20 mL，超聲提取20 min，放冷，稀釋至25 mL，混勻后，用0.22 μm 有機濾膜過濾，取續(xù)濾液待測。

1.5 樣品測定

取1.4處理的樣品溶液與1.3處理的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按照1.2儀器工作條件檢測，建立各化合物的線性方程并對樣品中的化合物進行含量計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

分別比較乙腈、甲醇、50%乙腈水溶液、50%甲醇水溶液和先用1 mL 飽和氯化鈉溶液分散后再加入甲醇等作為提取溶劑時12種目標(biāo)物的回收率，每種提取溶劑均進行6次平行試驗，結(jié)果見表4。

表4 不同提取溶劑時的回收率(n=6) %

由表4可知，甲基異噻唑啉酮不易溶于乙腈，回收率僅為16.62%，因此乙腈不宜作為提取溶劑；使用飽和氯化鈉溶液分散后再加入甲醇作為提取溶劑時，甲基氯異噻唑啉酮回收率為69.47，回收率較低；使用甲醇、50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液等3種溶劑提取時，各化合物的回收率均大于75.0%，比較理想，因此選取以上三種溶劑開展基質(zhì)效應(yīng)研究。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

選取洗護類、膏霜類兩種不同基質(zhì)的陰性樣品，按照1.4 方法分別制備空白基質(zhì)溶液。用空白基質(zhì)溶液配制基質(zhì)匹配的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按儀器工作條件測定，并繪制校準(zhǔn)曲線。將基質(zhì)匹配的校準(zhǔn)曲線的斜率(k1)與相對應(yīng)的甲醇、50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(k2)進行比較，斜率的比值見表5。斜率比值越接近1，說明基質(zhì)效應(yīng)越小。由表5 可知，不同溶劑提取洗護類樣品中的基質(zhì)均對4-羥基苯甲酸戊酯的影響有抑制作用，且抑制較強，其它組分影響較小；甲醇提取時，除了4-羥基苯甲酸戊酯外，各組分斜率比值為0.81～1.11，說明該處理方法在測定膏霜類質(zhì)地樣品中12種防腐劑時基質(zhì)效應(yīng)較小，可不予考慮，因此可直接采用不含基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行定量分析，在檢測洗護類產(chǎn)品時可使用配制相對應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表5 使用不同溶劑時校準(zhǔn)曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值

不同溶劑時混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。由圖1 可知，用50%乙腈溶解時甲基異噻唑啉啉酮色譜峰形較差，響應(yīng)較低。

圖1 不同溶劑時混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流色譜圖

綜合考慮溶劑對各組分溶解的出峰情況和基質(zhì)效應(yīng)，選取提取溶劑為甲醇。

2.3 提取時間選擇

選取含有甲基氯異噻唑啉酮、甲基異噻唑啉酮、4-羥基苯甲酸丙酯和4-羥基苯甲酸甲酯的陽性樣品，以甲醇為溶劑分別測試了超聲提取5、10、15、20、30 min 時的提取率，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，提取20 min后即提取完全，因此選擇提取時間為20 min。

圖2 不同提取時間目標(biāo)物的提取率

2.4 取樣質(zhì)量選擇

試驗比較了取樣質(zhì)量分別為0.10、0.20、0.50、1.0 g時陽性樣品的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不同取樣質(zhì)量時各目標(biāo)物的檢測差異不明顯，故取樣質(zhì)量對樣品提取效率影響較小。為避免取樣質(zhì)量過大污染色譜與質(zhì)譜系統(tǒng)，試驗選擇取樣質(zhì)量為0.20 g，如遇不同樣品可以調(diào)整取樣質(zhì)量或稀釋樣品。

圖3 不同取樣質(zhì)量時目標(biāo)物質(zhì)量分數(shù)

2.5 線性方程、檢出限與定量限

在1.2 液相色譜與質(zhì)譜條件下，對1.3 中的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，以待測防腐劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性方程、相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比(S/N)時樣品中待測防腐劑含量為檢出限，以10倍信噪比(S/N)時樣品中待測防腐劑含量為定量限。12 種防腐劑的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表6。

表6 12種防腐劑的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗

分別取洗護類、膏霜類陰性樣品各0.2 g，分別加入0.125、0.25、1.25 mL 各目標(biāo)物質(zhì)量濃度均為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 方法處理樣品，制備成12 種防腐劑質(zhì)量分數(shù)均分別為0.625、1.25、6.25 μg/g的加標(biāo)樣品溶液，每個濃度點平行制備6份，在1.2條件下進行測定，空白樣品及加標(biāo)樣品色譜圖見圖4，測定結(jié)果見表7。由表7 可知，12 種防腐劑的平均回收率為72.97%～106.53%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.13%～9.67%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足實際檢測需要。

圖4 護膚霜空白樣品及加標(biāo)樣品離子流色譜圖

表7 加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定化妝品中12種防腐劑，方法提取簡便、分離效果好、檢出限低、靈敏度高、專屬性強、準(zhǔn)確度高、分離效果好，可滿足此類防腐劑的檢測要求。