鄭超超, 李買平, 郝 雷, 柳曉東, 姜影影, 賀曉龍, 鄧振山*

(1.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 延安 716000;2.延安市寶塔區(qū)畜牧獸醫(yī)中心,陜西 延安 716000)

我國畜禽廢物年總量高達(dá)20億t,是工業(yè)廢棄物的3.2倍。畜禽廢物除了污染土壤、水體外,還會產(chǎn)生大量的臭味氣體如氨氣、硫化氫、硫醇和甲硫醇等,產(chǎn)生了養(yǎng)殖糞污堆積等問題,給環(huán)境及人畜的正常生活帶來不利的影響。微生物發(fā)酵床技術(shù)是一種綠色養(yǎng)殖方式,通過分解消納糞污符合環(huán)保要求,且利于家禽生長。發(fā)酵床養(yǎng)殖模式是一種環(huán)境友好的動物養(yǎng)殖技術(shù),以木屑、稻殼、秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物為發(fā)酵床墊材料,添加微生物復(fù)合菌降解糞污,減少對環(huán)境的污染,改善畜禽的生存環(huán)境[1]。發(fā)酵床養(yǎng)豬模式的發(fā)展,不僅提升了養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益,促進(jìn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)能力及市場競爭力,同時解決了糞污堆積、環(huán)境污染及生豬健康養(yǎng)殖等問題[2]。微生物發(fā)酵床技術(shù)已列入國家重點環(huán)境保護(hù)應(yīng)用技術(shù)中,對于解決畜禽糞便的污染問題具有很好的推廣價值。目前,我國大部分發(fā)酵菌劑引進(jìn)于國外,這與我國的養(yǎng)殖環(huán)境不相協(xié)調(diào),菌劑微生物很難競爭過原有的土著微生物,發(fā)揮不了改良調(diào)節(jié)的作用等,有些菌劑如EM已經(jīng)被應(yīng)用于發(fā)酵床但是針對性不強,成本也相對較高。因此,發(fā)酵菌劑的研究勢在必行。但引進(jìn)發(fā)酵技術(shù)的同時,卻忽略了對發(fā)酵床菌劑的改進(jìn)研究。由于不同環(huán)境下,微生物的生長情況和代謝特性存在很大的差異,引進(jìn)的發(fā)酵菌種往往在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)各種問題,導(dǎo)致發(fā)酵床養(yǎng)殖成本升高、利潤降低,甚至死床,已經(jīng)成為該技術(shù)發(fā)展的瓶頸問題。目前國內(nèi)專門應(yīng)用于發(fā)酵床的菌劑很少,菌劑品質(zhì)也良莠不齊。因此,發(fā)酵床墊料中存在的微生物是發(fā)酵床運行的核心,其微生物的種類及數(shù)量對發(fā)酵床功能的正常發(fā)揮及養(yǎng)殖動物的健康至關(guān)重要[3]。發(fā)酵床中細(xì)菌種類豐富,研究發(fā)酵床中蘊含的微生物群落,可累積豐富的微生物資源。由于發(fā)酵床的正常運行和功能發(fā)揮與其發(fā)酵床墊料中的相關(guān)微生物種類息息相關(guān),因此,研究發(fā)酵床墊料微生物組成與結(jié)構(gòu)具有重要意義。影響發(fā)酵床中微生物多樣性因素眾多,柳曉波等[4]研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的水泥地養(yǎng)殖相比,發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)可提供穩(wěn)定而豐富的菌群和穩(wěn)定的溫濕度,有利于豬仔生存。不同深度[5]和不同發(fā)酵程度發(fā)酵床墊料[6-7]的微生物組成水平也存在差異。常見的發(fā)酵床墊料的優(yōu)勢菌屬有節(jié)桿菌屬 (Arthrobacter)、芽胞桿菌屬 (Bacillus)、梭菌屬 (Clostridium) 及腸桿菌屬(Enterobacte)[8]。目前,已有研究表明發(fā)酵床中的微生物隨著發(fā)酵床墊料使用時間而發(fā)生變化[9]。發(fā)酵床技術(shù)的應(yīng)用給養(yǎng)殖業(yè)帶來了前所未有的發(fā)展,但由于不同地區(qū)環(huán)境存在差異,目前關(guān)于時間間隔較長且環(huán)境溫差較大的陜北地區(qū)發(fā)酵床養(yǎng)殖及相關(guān)發(fā)酵床專用菌劑研制鮮有報道,且不同時段的發(fā)酵床墊料中細(xì)菌多樣性變化對陜北地區(qū)生豬養(yǎng)殖具有啟發(fā)意義。綜上所述,開發(fā)陜北地區(qū)本土化復(fù)合發(fā)酵菌劑,建立微生物發(fā)酵床實現(xiàn)對畜禽廢物的原位處理,減少排放,能在一定程度上降低生產(chǎn)成本,取得較好的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益。鑒于此,本研究針對生豬養(yǎng)殖過程中造成嚴(yán)重污染和副產(chǎn)物資源化問題,圍繞養(yǎng)殖污染微生物治理、微生物資源篩選,通過從陜北地區(qū)養(yǎng)殖場以及周邊分離篩選出適合養(yǎng)殖環(huán)境、性能優(yōu)良的菌株,使之在畜禽糞便中充分生長繁殖,形成優(yōu)勢菌群,形成發(fā)酵床復(fù)合菌劑。本研究選取延安市寶塔區(qū)通過發(fā)酵床技術(shù)養(yǎng)豬場鋪設(shè)1、2、3和4年的發(fā)酵床墊料為研究對象,新鋪設(shè)的發(fā)酵床墊料作為對照(CK),采用MiSeq高通量測序技術(shù)分析不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落組成變化及其相互關(guān)系,以開發(fā)其中蘊含的有益微生物資源,為適合陜北地區(qū)的發(fā)酵床專用菌劑的研制、發(fā)酵床墊料的維護(hù)及養(yǎng)殖糞污降解等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究區(qū)概況 樣品采自延安市寶塔區(qū)姚店鎮(zhèn)小張溝村(36°10′33″～37°2′5″N,109°14′10"～110°50′43"E)一家大型現(xiàn)代化養(yǎng)豬場,該養(yǎng)豬場于2016年從福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù),可為本研究提供充足的不同年限的發(fā)酵床墊料來源。采樣點地處暖溫帶溫和半濕潤氣候區(qū),年平均溫度9.7 ℃,一月平均氣溫-6.7 ℃,七月平均氣溫22.9 ℃,極端最高氣溫39.7 ℃,極端最低氣溫-28.4 ℃。最熱月份平均相對濕度72%;年日照2 472 h;年降水量550 mm,57%集中在7～9月。

1.1.2 樣品采集與處理 樣品采集于2020年1月4日,新鋪設(shè)的發(fā)酵床墊料作為對照(CK),試驗組發(fā)酵年限分別為一年(1年期,FBM1)、兩年(2年期,FBM2)、三年(3年期,FBM3)和四年(4年期,FBM4)的發(fā)酵床墊料。通過五點采樣法采集樣品,其中每一樣點采集3個不同深度(0～10 cm、10～20 cm、20～30 cm)發(fā)酵床墊料樣品混合,每個樣點采集重量為10 g,共30 g。最后將五個樣點采集的發(fā)酵床墊料混合為一個樣品,共計150 g。一個年份采集3個樣品,共采集15個發(fā)酵床墊料樣品。分裝于滅菌的自封袋中,低溫保存運回實驗室于-80 ℃保藏,用于土壤微生物DNA的提取及后續(xù)測試。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 OMEGA-soil DNA Kit型DNA抽提試劑盒(Omega Bio-Tek,USA);biowest agArose 2%瓊脂糖凝膠(biowest,Espana);FastPfu聚合酶(TransGen,China);Axygen Biosciences膠回收試劑盒(Axygen,USA)。DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠,China);ABI GeneAmp?9700型PCR儀(ABI,USA);Illumina Miseq MISEQ測序儀(Illumina,USA);微型離心機(ABSON MiFly-6,合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司);小型離心機(5430 R,Eppendorf,Germany);粉碎研磨儀(TL-48R,上海萬柏生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組 DNA 的提取及擴(kuò)增測序 2 mL離心管中加入0.5 g發(fā)酵床墊料,根據(jù)磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,中國)說明書進(jìn)行總DNA提取。應(yīng)用NanoDrop2000及1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓5 V/cm,20 min)進(jìn)行DNA純度、濃度檢測及DNA完整性檢測。采用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)。每個樣本3個PCR重復(fù),將3個重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合,使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。利用Axygen Biosciences膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物純化,QuantusTMFluorometer對其進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina、 San Diego、 DNA標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE2*300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理、發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落多樣性分析及功能預(yù)測 用Qiime2軟件中插件 (DADA2) 對所有樣品的全部原始序列 (input) 進(jìn)行質(zhì)量控制,修剪、去噪、拼接、去嵌合體,形成特征表格[10]。使用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類,應(yīng)用UCHIME 軟件剔除嵌合體,得到OTU代表序列;選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列,生成OTU表格。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進(jìn)行物種分類注釋,比對Silva 數(shù)據(jù)庫(SSU128),設(shè)置比對閾值為70%。根據(jù)每個OTU中序列的條數(shù)獲其OTU的豐度值[12-13]。選取物種絕對豐度前20進(jìn)行優(yōu)勢物種分類。進(jìn)行樣品組間和組內(nèi)共有及特有OTU數(shù)目分析、物種組成及物種差異性分析[14]。應(yīng)用QIIME2 core-diversity插件計算多樣性矩陣。Alpha多樣性分析應(yīng)用Observed OTUs、 Chao1、Shannon、Simpson和Faith′s phylogenetics diversity指數(shù)評估樣本本身的多樣性程度;Beta多樣性指數(shù)應(yīng)用Bray Curtis距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)評估樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異性。應(yīng)用PICRUSt軟件預(yù)測微生物群體可能的功能組成[15]。使用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,并利用Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌OTU及其多樣性分析

經(jīng)質(zhì)量控制、去噪、拼接與去嵌合體(表1),共獲得924 008條序列、686種OTU。1年期、2年期、3年期、4年期及對照組有效序列均值分別為41 030、44 136、38 654、43 179及37 394,其中最小值為CK-2(35 375),最大值為FBM2-1(48 150)。樣品有效序列表明,不同年期發(fā)酵床墊料微生物組成有差異。特征序列數(shù)量最大為2年期,分別為1年期、3年期和4年期的1.07倍、1.14倍和1.02倍。四個年期發(fā)酵床墊料含量均高于對照組,表明發(fā)酵床墊料使用年期可影響其細(xì)菌多樣性。樣品OTUs范圍在31 (CK) ～227 (FBM2) 之間,2年期OTU數(shù)目最多。稀釋曲線 (faith-pd 圖1) 顯示,所有樣品隨著序列數(shù)量的增加,所觀察到的OTU數(shù)量逐漸趨于平緩,達(dá)到飽和。說明隨著測序深度增加,獲得的新物種不會顯著增加,即測序獲得的數(shù)據(jù)量合理,能反映絕大多數(shù)的細(xì)菌信息。

表1 發(fā)酵床墊料細(xì)菌多樣性測序結(jié)果分析Table 1 The sequencing results of bacterial diversity of fermented mattress materials

圖1 基于faith-pd指數(shù)分析的各樣品稀釋曲線圖 Fig.1 The seguencing results of bacterial diversity of fermened mattress materials

通過多樣性指數(shù)分析,表1結(jié)果表明各樣品均衡度較好,其中Chao1指數(shù)范圍在124(FBM3)～227(FBM4),Observed OTU指數(shù)范圍在127(FBM3)～211(FBM4)之間,4年期Chao1和Observed OTU指數(shù)較高,發(fā)酵床墊料細(xì)菌豐度最高,其次為2年期。 Shannon指數(shù)范圍在3.599(FBM1)～4.675(FBM2),Simpson指數(shù)范圍在0.787(FBM1)～0.888(FBM2),根據(jù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反應(yīng)樣品細(xì)菌群落豐度,其中2年期指數(shù)最高,1年期指數(shù)最低,均高于對照組,其Shannon和Simpson指數(shù)分別為4.675和0.888。結(jié)果表明發(fā)酵床墊料中2年期細(xì)菌豐度最高,3年期最低。此外,四個年期各指數(shù)明顯高于對照組,使用后的發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落豐度高于原始發(fā)酵床墊料細(xì)菌豐度。

2.2 不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌種群歸類分析

共檢測到15門,30綱,55目,117科,224屬和278種細(xì)菌。OTU共有物種8種,特有物種中1年期OTU為90種,2年期141種,3年期96種,4年期164種,對照組22種。共有物種分別隸屬于變形菌門 (Proteobacteria)、厚壁菌門 (Firmicutes)和擬桿菌門 (Bacteroidetes)。變形菌門主要含4個屬:短波單胞菌屬(Brevundimonas)、無色桿菌屬(Achromobacter)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)和一未知屬;厚壁菌門3個屬:芽胞桿菌屬 (Bacillus)、賴氨酸芽胞桿菌屬 (Lysinibacillus) 及一未知屬;擬桿菌門2個屬鞘氨醇桿菌屬 (Sphingobacterium) 及一未知種。隨著發(fā)酵床墊料使用時間延長,細(xì)菌特征種類也發(fā)生了變化,從1年期的90種到使用兩年后增加到141種,三年后顯著減少到96種,第四年閑置后上升到161種(圖2)。

圖2 樣品共有及特有物種組成分析 Fig.2 Composition analysis of common and endemic species

2.3 不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌門及科水平的優(yōu)勢種群分析

門分類水平微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析如圖3所示,對照組優(yōu)勢菌門為厚壁菌門 (52.03%),其次為變形菌門 (40.28%),存在少量擬桿菌門。實驗組中主要為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門。其中1年期發(fā)酵床墊料厚壁菌門 (44.71%) 和變形菌門 (40.88%) 占主導(dǎo)地位,含少量擬桿菌門 (12.38%) 和放線菌門 (Actinobacteria,2.00%)。2年期細(xì)菌群落與1年期相比,數(shù)量增加且結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,其中變形菌門68.57%、擬桿菌門16.01%、厚壁菌門9.94%及放線菌門2.01%,并出現(xiàn)綠彎菌門 (Chloroflexi,0.37%) 和疣微菌門 (Verrucomicrobia,0.30%)。3年期中細(xì)菌群落顯著減少,其中變形菌門 (64.03%) 及厚壁菌門 (31.11%)為優(yōu)勢門。4年期發(fā)酵床墊料出現(xiàn)新分類群:疣微菌門 (1.08%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria) 與芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes),變形菌門 (70.45%) 與擬桿菌門 (17.54%)為優(yōu)勢類群,含部分厚壁菌門 (6.53%) 與放線菌門 (3.00%)。總體變化為:2年期和4年期細(xì)菌群落豐度大于1年期和3年期,其中厚壁菌門在初始發(fā)酵床墊料中的含量隨使用時間的增長顯著降低,4年期時降低到6.53%(相對含量降低45.5%)。變形菌門群落結(jié)構(gòu)與厚壁菌門呈相反趨勢,初始發(fā)酵床墊料使用至4年期時變形菌門增加30.17%,且4年期細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨于復(fù)雜。擬桿菌門在1年期、2年期和4年期中較穩(wěn)定存在,在對照組中僅有少部分存在。結(jié)果表明在不同時期發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落有差異(圖4)。在門群落水平上,有三個未明確分類的細(xì)菌差異顯著,說明發(fā)酵床墊料中含有未被發(fā)掘的微生物資源。

圖3 不同年期發(fā)酵床墊料物種組成分析(門水平)Fig.3 Analysis of species composition of fermented mattress materials in different ages (phylum level)

在科水平細(xì)菌群落組成中,對照組主要包括鏈球菌科 (Streptococcaceae) 和乳酸桿菌科 (Lactobacillaceae)。四個不同年期發(fā)酵床墊料主要含有芽胞桿菌科 (Bacillaceae)、柄桿菌科 (Caulobacteraceae)、布魯氏菌科 (Brucellaceae)、鞘脂桿菌科 (Sphingobacteriaceae)、產(chǎn)堿桿菌科 (Alcaligenaceae)、叢毛單胞菌科 (Comamonadaceae) 和紅桿菌科 (Rhodobacteraceae)。初始發(fā)酵床墊料使用一年后(1年期)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,由初始發(fā)酵床墊料中的鏈球菌科(79.26%)和豬皮桿菌科(20.03%)演替為芽胞桿菌科 (43.62%)、柄桿菌科(6.43%)、布魯氏菌科(23.20%)、鞘脂桿菌科 (8.42%)和產(chǎn)堿桿菌科 (4.94%)。2年期主要為柄桿菌科(34.44%)、布魯氏菌科(19.62%)、鞘脂桿菌科(12.27%)、芽胞桿菌科(8.73%)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae,5.73%) 和紅桿菌科 (Rhodobacteraceae,4.18%)。3年期發(fā)酵床墊料主要有芽胞桿菌科(29.9%)、柄桿菌科(26.26%)、布魯氏菌科(24.42%)、鞘脂桿菌科(1.82%)和產(chǎn)堿菌科 (8.25%)。4年期發(fā)酵床墊料優(yōu)勢科群落與3年期一致,其中柄桿菌科 (49.88%)和鞘脂桿菌科 (5.79%)含量增加,芽胞桿菌科(4.22%)、布魯氏菌科(7.70%) 和產(chǎn)堿桿菌科(2.66%)減少。2年期中芽胞桿菌科 (8.73%)含量顯著降低,于3年期中再次增加,在4年期時含量下降為4.22%。結(jié)果表明,不同使用期限的發(fā)酵床墊料細(xì)菌組成呈現(xiàn)曲線變化,主要細(xì)菌豐度有差異(圖4)。

2.4 不同年期發(fā)酵床墊料優(yōu)勢細(xì)菌屬的組成

選取豐度最高的前50個屬OTUs代表序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,并繪制進(jìn)化關(guān)系聚類樹圖(圖5)。擬桿菌門鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium) 在1年期和2年期發(fā)酵床墊料中豐度較高,且與Parapedobacter和地桿菌屬(Pedobacter)親緣關(guān)系較近。黃桿菌屬(Flavobacterium)與金黃桿菌屬(Chryseobacterium)親緣關(guān)系相近。黃桿菌屬在3年期發(fā)酵床墊料中豐度較高;Parapedobacter與金黃桿菌屬在4年期發(fā)酵床墊料含量較高;食冷菌屬(Algoriphagus)在2年期發(fā)酵床墊料中豐度較高。厚壁菌門中梭菌屬(Clostridium)與嗜堿菌屬(Alkaliphilus)主要存在于1年期發(fā)酵床墊料中,2年期中少量存在;短芽胞桿菌屬(Brevibacillus)與賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)存在于4年期發(fā)酵床墊料中;芽胞桿菌屬(Bacillus)主要分布在1年期和3年期發(fā)酵床墊料中;乳酸桿菌屬(Lactobacillus)與鏈球菌屬(Streptococcus)在對照組中顯著存在且兩者系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系較近。放線菌門中紅球菌屬(Rhodococcus)大量存在于4年期發(fā)酵床墊料中;纖維菌屬(Cellulosimicrobium)在1年期及4年期中少量存在;白色桿菌屬(Leucobacter)在1年期發(fā)酵床墊料中大量存在;微桿菌屬(Microbacterium)于2年期發(fā)酵床墊料中少量存在,在4年期中豐度較高。不同年期發(fā)酵床墊料變形菌門細(xì)菌種類豐富,28個屬OTUs代表形成兩個分支。其中一分支主要分布于2～4年期發(fā)酵床墊料中。對氯苯胺屬(Diaphorobacter)在1年期發(fā)酵床墊料顯著存在。此外Hylemonella、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacte)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)和噬氫菌屬(Hydrogenophaga)于1年期中少量存在,主要在2年期發(fā)酵床墊料中大量聚集;無色桿菌屬(Achromobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)及騰黃單胞菌屬(Luteimonas)在3年期發(fā)酵床墊料中豐度顯著高于其他年期發(fā)酵床墊料;假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)在4年期發(fā)酵床墊料中豐度較高,其次為2年期。第二分支在3年期發(fā)酵床墊料中豐度顯著低于其他年期發(fā)酵床墊料。Pseudochrobacterum、Shinella、Defluvidbacter和Kaistia在1年期發(fā)酵床墊料中豐度較高,在2年期發(fā)酵床墊料中豐度較低;副球菌屬(Paracoccus)、鞘氨醇盒菌屬(Sphingopyxis)和枝動桿菌屬(Mycoplana)于2年期發(fā)酵床墊料中顯著存在;蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)主要存在于3年期發(fā)酵床墊料中;土壤桿菌屬(Agrobacterium)、柄桿菌屬(Caulobacter)、德沃斯氏菌屬(Devosia)和Balneimonas主要存在于4年期發(fā)酵床墊料中。屬水平熱圖分析表明,不同年期樣本中細(xì)菌組成豐度及結(jié)構(gòu)不同。

圖5 系統(tǒng)進(jìn)化及組間物種豐度分析(屬水平)Fig.5 Phylogeny and species abundance analysis between groups (genus level)

2.5 不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌功能基因預(yù)測

為探究不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)差異與功能間的聯(lián)系,本研究通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)功能預(yù)測。L1水平中新陳代謝 (metabolism, Mtbl)、環(huán)境信息處理 (Eenvironmental Information Processing, EnIP)、遺傳信息處理 (Gebetic information Processiong, GnIP) 和未知分類功能 (unclassified, Uncl) 為不同年期發(fā)酵床墊料的主要功能,該水平不同年期發(fā)酵床墊料功能基因無顯著差異。

基于PCA分析各等級功能基因在不同年期發(fā)酵床墊料中的主導(dǎo)能力(圖6)。L3水平中初始發(fā)酵床墊料基因豐度主要為核糖體肽酶(Ribosome Peptidases, Rbsm)和轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors, Trnf);1年期發(fā)酵床墊料主要為氧化磷酸化作用(Oxidative phosphorylation, Othr),其次為ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ABC transporters, ABCt);2年期和4年期發(fā)酵床墊料主要為原核生物的碳固定途徑(Carbon fixation pathways in prokaryotes, Cfpip)和乙醛酸和二羧酸的代謝(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism , Gadm);3年期發(fā)酵床墊料主要為ABC轉(zhuǎn)運蛋白功能。

圖6 不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌主導(dǎo)能力PCA分析圖Fig.6 PCA analysis of bacterial dominance of bedding materials in different years

應(yīng)用ANOVA+Duncan進(jìn)行不同年期發(fā)酵床墊料L3水平各項功能基因豐度差異分析(圖7)。ABC轉(zhuǎn)運蛋白 (ABCt) 在3年期發(fā)酵床墊料中顯著高于其他三個年期,其次為1年期,初始發(fā)酵床墊料顯著最低。磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphotransferase system, PTS)在初始發(fā)酵床墊料顯著高于四個年期發(fā)酵床墊料,其次1年期和2年期顯著高于3年期和4年期。轉(zhuǎn)運蛋白基因豐度對照組中顯著高于1年期和3年期發(fā)酵床墊料,其次為2年期與4年期,兩者間差異顯著。細(xì)菌分泌系統(tǒng) (Secretion system)、細(xì)菌毒素類 (Bacterial toxins ) 和調(diào)控系統(tǒng) (regulatory system) 四個年期發(fā)酵床墊料均顯著高于對照組,且細(xì)菌分泌系統(tǒng)在2年期發(fā)酵床墊料中顯著最高,結(jié)果表明不同時期發(fā)酵床墊料中相應(yīng)的細(xì)菌群落功能基因豐度有差異。

圖7 不同年期發(fā)酵床墊料組間功能差異分析Fig.7 Functional differences between groups of fermented mattress materials of different ages

3 討 論

本研究通過擴(kuò)增不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌V3～V4區(qū)域,采用Illumina Miseq二代測序技術(shù)進(jìn)行四個不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌組成和多樣性分析,并對不同年期發(fā)酵床墊料進(jìn)行功能預(yù)測,研究細(xì)菌群落與功能之間的聯(lián)系。共獲得924 008條序列,其中1年期至4年期有效序列均值分別為41 030、44 136、38 654和43 179,對照組最小為37 394;最小值為初始發(fā)酵床墊料對照組35 375,最大值為2年期發(fā)酵床墊料48 150。檢測到共有物種OTU 8種,特有物種中豐度最高為4年期發(fā)酵床墊料。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵年限不同會影響發(fā)酵床墊料細(xì)菌組成與結(jié)構(gòu),多樣性分析表明4年期發(fā)酵床墊料的細(xì)菌豐度最高,其次為2年期。2年期細(xì)菌種類最多,3年期最少。此外,四個年期各指數(shù)分別顯著高于對照組,并且樣品組間差異較大。

物種多樣性分析表明不同年期發(fā)酵床墊料中厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門及變形菌門為優(yōu)勢門群落,此結(jié)果與相關(guān)研究[16-17]結(jié)論一致。在微生物發(fā)酵床墊料與豬仔糞污形成一個發(fā)酵系統(tǒng)時,細(xì)菌含量會逐漸變化。隨著發(fā)酵墊料的使用,發(fā)酵床墊料中細(xì)菌群落趨于復(fù)雜,2年期發(fā)酵床墊料與1年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌組成相比,2年期細(xì)菌豐度增加且結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜,出現(xiàn)綠彎菌門和疣微菌門。隨著時間延長,3年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落減少,其中擬桿菌門與放線菌門含量僅為3.55%和1.29%。4年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)新的分類群:疣微菌門、藍(lán)細(xì)菌門和芽單胞菌門。疣微菌門在2年期發(fā)酵床墊料中出現(xiàn),使用一年后其含量降低至消失,發(fā)酵床墊料閑置后該分類群再次出現(xiàn)。

不同發(fā)酵年期發(fā)酵床墊料中起主要降解作用的細(xì)菌不同,1年期發(fā)酵床墊料中主要細(xì)菌為鞘氨醇桿菌屬 (Sphingobacterium)、梭菌屬(Clostridium)、嗜堿菌屬 (Alkaliphilus)、白色桿菌屬 (Leucobacter)、芽胞桿菌屬 (Bacillus)、短芽胞桿菌屬 (Brevibacillus)、賴氨酸芽胞桿菌屬 (Lysinibacillus)、Pseudochrobacterum、Shinella、Defluvidbacter和Kaistia,該時期病原菌豐度較低。鞘氨醇桿菌屬隸屬擬桿菌門鞘氨醇桿菌科,分布廣泛,在堆肥[18]、污泥[19]、植物[20]及動物[21]中均存在,多具有降解特性。梭菌屬、嗜堿菌屬及芽胞桿菌屬是堆肥中的常見菌,其中芽胞桿菌能夠降解發(fā)酵床墊料有機質(zhì),參與豬糞降解與發(fā)酵床病原生防過程,在發(fā)酵中起重要作用[22-23]。而大量存在的Pseudochrobacterum、Defluvidbacter及Kaistia,可能具有特定功能,進(jìn)行相關(guān)功能研究可獲得更廣泛的生物資源。2年期發(fā)酵墊料中食冷菌屬 (Algoriphagus)、微桿菌屬 (Microbacterium)、Hylemonella、寡養(yǎng)單胞菌屬 (Stenotrophomonas)、埃希氏菌屬 (Escherichia)、腸桿菌屬 (Enterobacte)和假單胞菌屬 (Pseudomonas) 含量較高。值得注意的是隨著發(fā)酵床墊料的使用,該時期病原菌埃希氏菌屬及腸桿菌屬等致病菌大量聚集。研究表明食冷菌屬這一新物種對多種抗生素具有抗性[24];生物防治潛能及機理研究發(fā)現(xiàn)微桿菌屬菌株對青霉菌具有較強的抵抗作用,并與甲硫氨酸以及異戊二烯等誘導(dǎo)抗性相關(guān)物質(zhì)合成單萜類基因[25];寡養(yǎng)單胞菌屬部分菌株抵抗多重耐藥病原體的作用在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域,表現(xiàn)出良好的應(yīng)用研發(fā)前景[26]。假單胞菌屬隸屬于假單胞菌科,假單胞菌科分布廣泛,其中許多細(xì)菌具有很強的降解油脂、烷烴、酚類和有機氮[27-28]的能力。該時期還有大量叢毛單胞菌屬 (Comamonas)、噬氫菌屬 (Hydrogenophaga)、副球菌屬 (Paracoccus)、鞘氨醇盒菌屬 (Sphingopyxis) 及枝動桿菌屬 (Mycoplana)等具有降解特性[29-30]的有益細(xì)菌,供發(fā)酵床正常運行。隨著發(fā)酵床墊料的使用,降解類細(xì)菌豐度發(fā)生變化。3年期發(fā)酵床墊料中,芽胞桿菌屬、黃桿菌屬 (Flavobacterium)、無色桿菌屬 (Achromobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬、騰黃單胞菌屬及蒼白桿菌屬為主要降解菌。同2年期相比,3年期發(fā)酵床墊料中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為簡單,原因可能為隨著使用年份的增加,部分菌株不再適應(yīng)發(fā)酵床系統(tǒng)環(huán)境而被淘汰。2年期發(fā)酵床墊料中大量存在的致病菌豐度降低,可見發(fā)酵床的使用可以減少病原菌的滋生,該結(jié)果與陳倩倩等[31]對福建一養(yǎng)殖場發(fā)酵床細(xì)菌多樣性研究結(jié)果一致,表明發(fā)酵床可以抑制致病菌生存,保證家禽健康。有研究表明產(chǎn)堿桿菌屬的糞產(chǎn)堿菌 (Alcaligenesfaecalis) 可抑制大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus) 等病原菌[32],這對揭示發(fā)酵床技術(shù)對病原菌控制具有防治作用和啟發(fā)意義。該時期芽胞桿菌屬豐度在3年期中依然極高,表明該屬菌屬適用于發(fā)酵床系統(tǒng)。4年期發(fā)酵床墊料中紅球菌屬、金黃桿菌屬、短芽胞桿菌屬 (Brevibacillus)、賴氨酸芽胞桿菌屬 (Lysinibacillus)、假單胞菌屬、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬 (Agrobacterium)和柄桿菌屬 (Caulobacter) 顯著存在。由于該年期發(fā)酵床墊料已露天閑置,其微生物群落趨于復(fù)雜可能與環(huán)境有關(guān)。因3年期發(fā)酵床墊料處于一個致病菌降解的關(guān)鍵時段,到第四年發(fā)酵床致病菌豐度降低,細(xì)菌群落處于一個較好的環(huán)境。因此,可以通過挖掘高年期發(fā)酵床墊料中土著微生物應(yīng)用于發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)中,以提高地區(qū)發(fā)酵床養(yǎng)殖效益。

為探究不同年期發(fā)酵床墊料中細(xì)菌功能差異,本研究初步進(jìn)行功能預(yù)測。隨著使用時間的增長,發(fā)酵床墊料內(nèi)部物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[33],可能導(dǎo)致不同年期發(fā)酵床墊料行使功能有差異。研究結(jié)果表明,KEGG通路L1水平中各項功能基因豐度無顯著差異。通過L3水平中基因豐度較高的環(huán)境信息加工功能差異分析表明,對照組初始發(fā)酵床墊料中轉(zhuǎn)運蛋白及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)功能基因豐度顯著高于已發(fā)酵的四個年期發(fā)酵床墊料。初始發(fā)酵床墊料中細(xì)菌種類較少,且與其他四個年期發(fā)酵床墊料相比較無特殊發(fā)酵環(huán)節(jié),不與豬仔構(gòu)成系統(tǒng)環(huán)境,此時對于系統(tǒng)調(diào)節(jié)及細(xì)菌分泌系統(tǒng)等功能的行使不顯著,則相關(guān)基因豐度較低。對照組中細(xì)菌主要進(jìn)行有機物質(zhì)轉(zhuǎn)換用于維系自身生命進(jìn)程,根據(jù)物種變化,推測乳酸桿菌屬與鏈球菌屬在初始發(fā)酵床墊料中顯著存在可能主導(dǎo)轉(zhuǎn)運蛋白及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)相關(guān)功能的進(jìn)行;1年期和2年期發(fā)酵床墊料中豬仔腸道糞污的排放及病原菌產(chǎn)生導(dǎo)致磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng),調(diào)節(jié)糞污中碳氮物質(zhì)代謝來調(diào)控發(fā)酵床的運行。ABC轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、細(xì)菌毒素類及調(diào)控系統(tǒng)在四個年期發(fā)酵床墊料中均顯著高于對照組。ABC轉(zhuǎn)運蛋白可轉(zhuǎn)運的底物包括有機離子、單糖、聚糖、膽固醇、磷脂、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、毒素、藥物、抗生素和異源物質(zhì)等[34]。使用發(fā)酵床可降低病原菌的產(chǎn)生[3,35]的結(jié)果與該研究一致。發(fā)酵床墊料中埃希氏菌屬及腸桿菌屬豐度逐漸降低,推測發(fā)酵床可以降低病原菌生存,可能與發(fā)酵床中微生物拮抗作用有關(guān),其中產(chǎn)堿桿菌屬可能對病原菌抑制具有重要作用。并且隨著糞污排泄、有機質(zhì)降解以及細(xì)菌毒素的產(chǎn)生,導(dǎo)致發(fā)酵床微生物細(xì)菌分泌系統(tǒng)功能激活,控制向外分泌蛋白質(zhì),進(jìn)行各級分泌系統(tǒng)調(diào)控,使發(fā)酵床正常發(fā)揮作用。

綜上,本研究利用高通量測序技術(shù),分析不同年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌多樣性。四個年期發(fā)酵床墊料中微生物數(shù)量及種類差異顯著,起主要降解作用的細(xì)菌不同。1年期和3年期發(fā)酵床墊料細(xì)菌豐度及種類低于2年期和4年期發(fā)酵床墊料。其次發(fā)酵床墊料中微生物主要以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門及擬桿菌門為主。1年期中起主要降解作用的是鞘氨醇桿菌屬、梭菌屬、嗜堿菌屬、白色桿菌屬、芽胞桿菌屬、短芽胞桿菌屬及賴氨酸芽胞桿菌屬;2年期發(fā)酵床墊料中食冷菌屬、微桿菌屬、Hylemonella、寡養(yǎng)單胞菌屬 (Stenotrophomonas)、叢毛單胞菌屬、噬氫菌屬 (Hydrogenophaga)、副球菌屬、鞘氨醇盒菌屬和假單胞菌屬為主要降解菌;3年期發(fā)酵床墊料中芽胞桿菌屬、黃桿菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬,騰黃色單胞菌屬及蒼白桿菌屬為主要降解菌;4年期發(fā)酵床墊料中紅球菌屬、金黃桿菌屬、短芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、土壤桿菌屬和柄桿菌屬顯著存在。功能預(yù)測與物種分析表明初始發(fā)酵床墊料顯著存在的乳酸桿菌屬與鏈球菌屬主要進(jìn)行轉(zhuǎn)運蛋白及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)功能。四個年期發(fā)酵床墊料中ABC轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、細(xì)菌毒素類及調(diào)控系統(tǒng)為主要功能。研究表明,不同發(fā)酵年期有關(guān)降解類有益細(xì)菌豐度、組成及功能存在差異,而且隨著發(fā)酵床墊料的使用,病原菌數(shù)量逐漸降低,因此發(fā)酵床養(yǎng)殖對豬仔生長具有積極作用。同時細(xì)菌群落組成與功能相適應(yīng),不同發(fā)酵時期發(fā)酵床墊料中細(xì)菌組成差異可能導(dǎo)致功能變化,這對發(fā)酵床正常運行和豬仔健康生長具有指導(dǎo)意義。