陳飛飛, 陳吉祥*, 王永剛, 徐嘉茜, 陳詩源

(1.蘭州理工大學(xué) 石油化工學(xué)院,甘肅 蘭州 730050;2.蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730050)

石油開發(fā)及使用過程中造成的環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重,生物修復(fù)技術(shù)因?qū)Νh(huán)境友好而成為最具前景的污染治理技術(shù)[1]。以石油降解菌為主體的生物修復(fù)技術(shù)已成為近年研究的熱點(diǎn)[2-3]。目前,已有200多種可降解石油的微生物被發(fā)現(xiàn),其中細(xì)菌的石油降解效率較高[4-5]。蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)存在于多種復(fù)雜環(huán)境中,能有效降解石油烴等污染物[6-7]。在惡劣的自然環(huán)境中,大部分微生物能形成活的非可培養(yǎng)(Viable but non-culturable state,VBNC)狀態(tài)[8-9]。VBNC狀態(tài)是指某些細(xì)菌在不良環(huán)境中形成的一種休眠狀態(tài),常規(guī)培養(yǎng)條件無法繁殖,但可保持代謝活性[9-11]。研究表明低溫、寡營養(yǎng)、抗生素、有毒物質(zhì)及H2O2等可誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)[12-14]。VBNC狀態(tài)的細(xì)胞在適宜條件下復(fù)蘇為可培養(yǎng)形式[15-17]。氧化應(yīng)激對(duì)大腸埃希菌、芽胞桿菌和沙門氏菌等細(xì)菌的作用已被廣泛研究[14,18],如低濃度的H2O2會(huì)使沙門氏菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)[19]。目前關(guān)于微生物VBNC狀態(tài)的研究多集中于食品檢測(cè)、流行病學(xué)及公共衛(wèi)生學(xué)等領(lǐng)域的大腸埃希菌、沙門氏菌等菌株,而對(duì)污染物環(huán)境生物修復(fù)領(lǐng)域的微生物,如蒼白桿菌研究較少[20-24]。本研究通過不同濃度的H2O2處理蒼白桿菌JP1,使其進(jìn)入VBNC狀態(tài),研究蒼白桿菌JP1細(xì)胞VBNC狀態(tài)的形成過程,VBNC狀態(tài)細(xì)胞的形態(tài),復(fù)蘇后蒼白桿菌RJP1的生長特性及石油降解能力,有助于進(jìn)一步探究蒼白桿菌在惡劣條件下的存活機(jī)制,為石油污染環(huán)境生物修復(fù)的菌種篩選及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 實(shí)驗(yàn)所用的蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)JP1分離自西部荒漠地區(qū)的石油污染土樣。土樣溶解后采用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌種初步篩選、原油基礎(chǔ)培養(yǎng)基復(fù)篩,并將篩得的菌種保藏于蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①LB培養(yǎng)基:蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,瓊脂20,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0;②基礎(chǔ)培養(yǎng)基:NH4NO33,K2HPO41.5,KH2PO41.5,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.1,CaCl20.01,FeCl20.01,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 LIVE/DEADBacLight細(xì)菌活力檢測(cè)試劑盒(生工(上海)股份有限公司),其他試劑均為國產(chǎn)和進(jìn)口分析純。紫外分光光度計(jì)(UV-2102PC,尤尼柯上海儀器公司);紅外測(cè)油儀(OIL-460,北京華夏科創(chuàng)公司);激光共聚焦顯微鏡(FV-2000,奧林巴斯);掃描電子顯微鏡(JSM-5600LV,日本電子光學(xué)公司);透射電子顯微鏡(HT7800,HITACHI);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 15R,上海力申科學(xué)儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度H2O2對(duì)蒼白桿菌JP1生長的影響 挑取蒼白桿菌JP1單菌落接種于裝有50.0 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶,180 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。以1.0%(體積分?jǐn)?shù),下同)的接種量接種于裝有50.0 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶,培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD600為0.211～0.273,分別添加30.0%的H2O2,使得培養(yǎng)液H2O2的終濃度為0.0、10.0、25.0、50.0和75.0 mmol/L,180 r/min、30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng);0、6、12、24、36、48 h取樣,紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600,篩選出有效抑制蒼白桿菌JP1生長的H2O2濃度。

1.2.2 H2O2誘導(dǎo)蒼白桿菌JP1形成VBNC狀態(tài) 將培養(yǎng)液取出測(cè)定OD600為0.211～0.273,添加30.0% H2O2,以有效抑制蒼白桿菌JP1生長的H2O2初濃度為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組添加同體積無菌水,每組3個(gè)平行。分別于0、6、12、24、36、48 h取樣,紫外分光光度法測(cè)定OD600,平板涂布法對(duì)可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),LIVE/DEADBacLight細(xì)菌活力檢測(cè)試劑盒染色,激光共聚焦顯微鏡觀察,通過軟件Image J進(jìn)行總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)[16]。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察細(xì)胞形態(tài),樣品在8 500 r/min、4 ℃下離心10 min后收集細(xì)菌沉淀。0.85%無菌生理鹽水重懸后離心,重復(fù)3次,棄去上清,2.5%的戊二醛固定沉淀。根據(jù)Ding等[25]的方法進(jìn)行掃描和透射電子顯微鏡分析。

1.2.4 VBNC狀態(tài)蒼白桿菌細(xì)胞的復(fù)蘇 蒼白桿菌JP1經(jīng)H2O2誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài)后,取5.0 mL菌液10 000 r/min、4 ℃離心5 min,棄去上清,5.0 mL 0.85%生理鹽水重懸菌體沉淀。1.0%的接種量接種于裝有50.0 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶,實(shí)驗(yàn)組添加經(jīng)濾膜除菌的丙酮酸鈉溶液,使丙酮酸鈉的濃度為50.0 mmol/L,對(duì)照組添加同體積無菌水。180 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng),每組3個(gè)平行。0、6、12、24、36 h取樣,紫外分光光度法測(cè)定OD600,平板涂布法計(jì)數(shù)培養(yǎng)液可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 H2O2處理前后蒼白桿菌JP1生長特性分析 將蒼白桿菌JP1和復(fù)蘇后的蒼白桿菌RJP1以1%的接種量接入裝有50.0 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中,分別于10、20、25、30、35、40和50 ℃,180 r/min培養(yǎng)24 h,測(cè)定OD600,確定溫度對(duì)菌株JP1和菌株RJP1生長的影響;菌株以1%的接種量接入pH分別為4、5、6、7、8、9和10的LB培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定OD600確定pH對(duì)細(xì)菌生長的影響;以1%的接種量接入NaCl濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的LB培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定OD600值,觀察NaCl對(duì)菌株生長的影響。

1.2.6 石油降解率測(cè)定 將蒼白桿菌JP1和復(fù)蘇后的蒼白桿菌RJP1以2.0%的接種量接種于含有一定濃度石油的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)液取出后用50.0 mL的四氯乙烯分3次萃取,合并萃取液經(jīng)Na2SO4(105 ℃烘干48 h)吸收多余水分,轉(zhuǎn)移至容量瓶定容到50.0 mL,紅外測(cè)油儀測(cè)定培養(yǎng)液中的石油濃度,根據(jù)公式計(jì)算菌株的石油降解率[26]。

式中:ω:石油降解率(%);m1:培養(yǎng)液的初始石油濃度 (mg/L);m2:培養(yǎng)液的剩余石油濃度 (mg/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度H2O2對(duì)蒼白桿菌JP1生長的影響

培養(yǎng)液H2O2終濃度分別為0.0、10.0、25.0、50.0和75.0 mmol/L,培養(yǎng)、取樣測(cè)定OD600,繪制蒼白桿菌JP1在不同H2O2濃度下的生長曲線(圖1a)。相比對(duì)照組(0.0 mmol/L H2O2),10.0、25.0、50.0和75.0 mmol/L濃度的H2O2均對(duì)蒼白桿菌JP1的生長有抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)液的OD600為0.222,H2O2濃度為75.0 mmol/L時(shí),明顯抑制蒼白桿菌JP1的生長。

圖1 H2O2誘導(dǎo)蒼白桿菌JP1進(jìn)入VBNC狀態(tài)Fig.1 Formation of VBNC state of Ochrobactrum sp. JP1 induced by H2O2A:蒼白桿菌JP1在不同H2O2濃度下的生長曲線;b:培養(yǎng)液的OD600; c:培養(yǎng)液的可培養(yǎng)數(shù)A: Growth curves of Ochrobactrum sp. JP1 under different concentrations of H2O2; b: OD600 of culture; c: Log10cfu/mL of culture

2.2 H2O2誘導(dǎo)蒼白桿菌JP1形成VBNC狀態(tài)

添加H2O2使培養(yǎng)液終濃度為75.0 mmol/L,培養(yǎng)并取樣測(cè)定OD600、可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)。對(duì)照組(0.0 mmol/L H2O2)培養(yǎng)液的OD600呈現(xiàn)自然生長,實(shí)驗(yàn)組(75.0 mmol/L H2O2)培養(yǎng)液的OD600基本維持不變(圖1b);培養(yǎng)至6 h時(shí),相對(duì)于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)明顯下降,12 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液所涂布的LB固體培養(yǎng)基經(jīng)恒溫培養(yǎng)后表面不再有菌落生長,表明蒼白桿菌JP1在終濃度為75.0 mmol/L的H2O2下培養(yǎng)12 h會(huì)進(jìn)入VBNC狀態(tài)(圖1c)。

LIVE/DEADBacLight細(xì)菌活力檢測(cè)試劑盒染色后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察,活細(xì)胞細(xì)胞膜完整,染色后為綠色(圖2a),細(xì)胞膜受損的死細(xì)胞染色后為紅色;總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)基本保持不變,可培養(yǎng)數(shù)在培養(yǎng)12 h時(shí)降為0 cfu/mL(圖2b)。

圖2 細(xì)胞染色及總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)和可培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.2 Cell staining and total cell count, viable cell count and cultivable cell countA:實(shí)驗(yàn)組蒼白桿菌JP1活細(xì)胞染色圖;b:總細(xì)胞、活細(xì)胞和可培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)A: Staining picture of live cells of Ochrobactrum sp. JP1 in the experimental group; b: Total cell, live cell and culturable cell counts

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

掃描電子顯微鏡觀察到未經(jīng)75.0 mmol/L H2O2處理的蒼白桿菌JP1細(xì)胞表面光滑飽滿,呈桿狀(圖3a),經(jīng)75.0 mmol/L H2O2處理的細(xì)胞大部分縮小變成球體(圖3b)。透射電子顯微鏡觀察到未經(jīng)75.0 mmol/L H2O2處理的蒼白桿菌JP1細(xì)胞質(zhì)分布均勻,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整(圖3c),而經(jīng)過75.0 mmol/L H2O2處理的大部分細(xì)胞發(fā)生明顯變化,主要表現(xiàn)在周質(zhì)間隙增大、胞內(nèi)物質(zhì)聚集、外漏甚至變成“空殼”,但仍有極少數(shù)細(xì)胞質(zhì)均勻分布(圖3d)。

圖3 蒼白桿菌JP1細(xì)胞H2O2處理前后的細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Cell morphology of Ochrobactrum sp. JP1 cells before and after H2O2 treatmentA:未處理的細(xì)胞-SEM;b:75.0 mmol/L H2O2處理的細(xì)胞-SEM;c:未處理的細(xì)胞-TEM;d:75.0 mmol/L H2O2處理的細(xì)胞-TEMA:Untreated cells -SEM;b:H2O2 (75.0 mmol/L) treated cells -SEM;c:Untreated cells -TEM;d:H2O2 (75.0 mmol/L) treated cells-TEM

2.4 VBNC狀態(tài)蒼白桿菌JP1的復(fù)蘇

通過離心去除原培養(yǎng)液中的H2O2,將VBNC狀態(tài)的蒼白桿菌JP1細(xì)胞接種于LB培養(yǎng)液恒溫培養(yǎng)。取樣測(cè)定如圖4a所示,0～12 h,培養(yǎng)液的OD600基本維持不變;12 h以后,培養(yǎng)液的OD600明顯增加。培養(yǎng)液中可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)變化見圖4b,培養(yǎng)至6 h,對(duì)照組(0.0 mmol/L丙酮酸鈉)和實(shí)驗(yàn)組(50.0 mmol/L丙酮酸鈉)LB培養(yǎng)液中蒼白桿菌RJP1的可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)分別為4 790 cfu/mL和4 820 cfu/mL,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)持續(xù)增加。培養(yǎng)至12 h,實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中的可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的1.6倍,24 h時(shí),實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中的可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的3.2倍,表明在適宜的生長條件下,移除H2O2脅迫作用后,VBNC狀態(tài)的蒼白桿菌JP1能在較短時(shí)間內(nèi)復(fù)蘇,恢復(fù)可培養(yǎng)性,并且丙酮酸鈉對(duì)VBNC狀態(tài)蒼白桿菌JP1的復(fù)蘇具有促進(jìn)作用。

圖4 VBNC狀態(tài)蒼白桿菌JP1的復(fù)蘇Fig.4 The resuscitation of VBNC state Ochrobactrum sp. JP1 A:培養(yǎng)液的OD600;b:培養(yǎng)液的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)A:OD600 of the culture; b: The culture numbers

2.5 H2O2處理前后蒼白桿菌JP1的生長特性

將蒼白桿菌JP1和去除H2O2復(fù)蘇后的蒼白桿菌RJP1接種于LB培養(yǎng)基,分別于不同溫度、初始pH和鹽度,180 r/min培養(yǎng)24 h,取樣測(cè)定數(shù)據(jù)如圖5所示,2種菌株細(xì)胞的適宜生長條件基本一致,溫度25.0～40.0 ℃、pH 5～9、鹽度為0.0%～1.0%,表明VBNC狀態(tài)的蒼白桿菌JP1去除H2O2的脅迫作用恢復(fù)可培養(yǎng)性后,與自然狀態(tài)的蒼白桿菌JP1一樣,具有較好的環(huán)境適應(yīng)能力。

圖5 菌株JP1和菌株RJP1的生長特性Fig.5 Growth characteristics of strain JP1 and strain RJP1A:溫度對(duì)菌株生長的影響;b:初始pH對(duì)菌株生長的影響;c:鹽度對(duì)菌株生長的影響 a: Effect of temperature on the growth of the bacteria; b: Effect of initial pH on the growth of the bacteria; c: Effect of NaCl concentration on the growth of the bacteria

2.6 H2O2對(duì)蒼白桿菌石油降解性能的影響

將蒼白桿菌JP1、去除H2O2的脅迫復(fù)蘇后的蒼白桿菌RJP1接種于含有一定濃度石油的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,通過紅外測(cè)油儀測(cè)定培養(yǎng)液中剩余的石油濃度。結(jié)果顯示,復(fù)蘇后的蒼白桿菌RJP1細(xì)胞的石油降解率沒有受到明顯的影響。培養(yǎng)液中石油的初始濃度和剩余濃度,菌株JP1和菌株RJP1的石油降解率如表1所示。

表1 細(xì)菌石油降解率測(cè)定Table 1 Determination of petroleum degradation rates of the different bacterial cells

3 討 論

H2O2因其具有氧化性而被廣泛應(yīng)用于微生物的殺菌消毒,并且可誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。Morishige等[27]的研究結(jié)果表明向含腸炎沙門氏菌(Salmonella)細(xì)胞濃度為1.0×107cfu/mL的LB培養(yǎng)液中添加H2O2,當(dāng)培養(yǎng)液的H2O2濃度為10.0 mmol/L,培養(yǎng)45 min后培養(yǎng)液中的腸炎沙門氏菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)在初始濃度為8.1×107cfu/mL蒼白桿菌JP1的LB培養(yǎng)液中,當(dāng)H2O2終濃度為75.0 mmol/L時(shí),30 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h后蒼白桿菌JP1 細(xì)胞進(jìn)入VBNC狀態(tài)。不同種屬的細(xì)菌對(duì)H2O2的耐受性存在顯著差異,但培養(yǎng)液初始的細(xì)胞濃度是導(dǎo)致其存在顯著差異的主要原因和細(xì)菌能否進(jìn)入VBNC狀態(tài)的重要前提。此外,致使細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的方式是多種多樣的,Ye等[28]的研究結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)液中大腸埃希菌(Escherichiacoli)細(xì)胞數(shù)目為105～6cfu/mL時(shí),0.5 mg/L的余氯處理6 h后大腸埃希菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)。

環(huán)境因素誘發(fā)細(xì)菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)后,典型的特征是細(xì)胞出現(xiàn)收縮變小等形態(tài)變化,在大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞中都能觀察到細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的積累。H2O2誘導(dǎo)蒼白桿菌JP1進(jìn)入VBNC狀態(tài)后,細(xì)胞由桿狀變?yōu)榍驙睢Ｍ干潆娮语@微鏡觀察到,VBNC狀態(tài)的細(xì)胞周質(zhì)間隙顯著增大,核區(qū)被壓縮至細(xì)胞中心。在一些經(jīng)低溫和寡營養(yǎng)誘導(dǎo)而形成的VBNC狀態(tài)細(xì)菌細(xì)胞中也觀察到了同樣的現(xiàn)象。Gao等[29]研究發(fā)現(xiàn)鰻弧菌(Vibroanguillarum)細(xì)胞經(jīng)過6個(gè)月的饑餓培養(yǎng),細(xì)胞由短棒狀變?yōu)榍驙?細(xì)胞平均長度明顯縮短。聶新穎等[30]采用H2O2處理鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)使其處于VBNC狀態(tài),觀察到細(xì)胞形態(tài)以及胞內(nèi)物質(zhì)的變化情況與本研究觀測(cè)結(jié)果一致。

VBNC狀態(tài)的細(xì)菌可以通過不同的條件復(fù)蘇。Morishige等[27]通過添加30.0 mmol/L的丙酮酸鈉,對(duì)VBNC狀態(tài)的腸炎沙門氏菌進(jìn)行復(fù)蘇,結(jié)果表明,與對(duì)照組(0 mmol/L丙酮酸鈉)相比,腸炎沙門氏菌細(xì)胞的可培養(yǎng)性提高90.3倍。本研究發(fā)現(xiàn),在VBNC狀態(tài)蒼白桿菌JP1的復(fù)蘇過程中,培養(yǎng)至24 h,實(shí)驗(yàn)組(50.0 mmol/L丙酮酸鈉)復(fù)蘇培養(yǎng)液中的可培養(yǎng)數(shù)是對(duì)照組 (0 mmol/L丙酮酸鈉)的3.2倍,說明合適濃度的丙酮酸鈉能夠促進(jìn)VBNC狀態(tài)細(xì)菌細(xì)胞的復(fù)蘇。此外,Pinto等[31]采用改變培養(yǎng)溫度的方法,使低溫(4 ℃)誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài)的大腸埃希菌恢復(fù)了可培養(yǎng)性。寡營養(yǎng)的土壤培養(yǎng)基經(jīng)過12 h的培養(yǎng)后,其中耐金屬貪銅菌(Cupriavidusmetallidurans)的可培養(yǎng)數(shù)目降為0 cfu/mL,Giagnon等[32]在土壤培養(yǎng)基中添加葡萄糖酸鹽后,培養(yǎng)基中的可培養(yǎng)數(shù)恢復(fù)到了較高水平。除物理刺激、添加化學(xué)物質(zhì)等復(fù)蘇方法外,有些活性蛋白質(zhì)也有助于VBNC狀態(tài)細(xì)菌的復(fù)蘇,Panutdaporn等[13]通過添加復(fù)蘇促進(jìn)因子(Rpf)使得VBNC狀態(tài)的沙門氏菌獲得可培養(yǎng)性。Li等[33]向含VBNC狀態(tài)哈維弧菌(Vibroharveyi)的培養(yǎng)液中添加活性蛋白YeaZ,也實(shí)現(xiàn)了復(fù)蘇。