龔一林, 鄭運(yùn)周, 趙艷微, 張洪雨, 黃 濤

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院檢驗(yàn)科, 河北 石家莊 050082 2.河北省石家莊市鹿泉區(qū)中醫(yī)院, 河北 石家莊 050000)

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC是許多國(guó)家癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。一般來(lái)說(shuō),HCC患者在早期是呈現(xiàn)無(wú)癥狀的,而在晚期被診斷為患有HCC的患者通常被認(rèn)為是不適合進(jìn)行手術(shù)性治療的[2]。此外,盡管一些符合手術(shù)要求的HCC患者在一定程度上可以通過(guò)手術(shù)治療從而提高生存時(shí)間,但據(jù)統(tǒng)計(jì)其5年總生存率仍無(wú)法令人滿意,只有約50%[3]。因此,迫切需要鑒定出新的生物標(biāo)志物來(lái)提高HCC患者的早期診斷率和總生存率。已有研究表明circRNAs參與各種類型癌癥的發(fā)展,包括肺癌、乳腺癌和HCC[4]。circRNA具有一種特殊的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu),從而賦予了circRNA比線性轉(zhuǎn)錄物更穩(wěn)定的特性。近年來(lái),據(jù)報(bào)道RNA可能從三個(gè)不同的水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá),分別為轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平[5]。期間,聚集于細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)狀外顯子RNA可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA降低其表達(dá),最終導(dǎo)致這些miRNA的靶基因的表達(dá)增強(qiáng)[6];而環(huán)狀內(nèi)含子RNA或外顯子-內(nèi)含子RNA通常出現(xiàn)在細(xì)胞核中,這類circRNA通?？梢哉{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程[7]。這些研究表明circRNAs可能參與不同的病理過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明,circRNAs在HCC組織中出現(xiàn)差異表達(dá),并通過(guò)靶向不同的miRNAs來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性行為,從而對(duì)HCC進(jìn)程產(chǎn)生影響。例如,circSEC62通過(guò)沉默miR-625-5p促進(jìn)SNRPA水平,最終影響HCC微血管的侵襲。由于circ_0007841在多種癌癥中異常表達(dá),可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、骨髓瘤等癌癥的進(jìn)展[8-10],但其在HCC中的作用確鮮有研究。在HCC中探究了circ_0007841是否能影響其惡性行為,以及可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng):人源正常肝上皮細(xì)胞THLE-3與肝癌細(xì)胞系SNU-387均購(gòu)自American Type Culture Collection(USA),BEL-7405購(gòu)自National Infrastructure of Cell Line Resource(China),MHCC-97H、Huh7購(gòu)自Cell Bank of the Type Culture Collection(China)、HCCLM3購(gòu)自Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences(China)。所有細(xì)胞均用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100g/mL鏈霉素(Gibco Carlsbad,CA,USA)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco Carlsbad,CA,USA)于37℃和5% CO2條件的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別接種在6孔板中(2×105細(xì)胞/孔),孵育24h后,使用LiPofectamine 2000 (11668-019,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分別將si-NC、si-0007841-1、si-0007841-2、inhibitor-NC、miR-338-3p inhibitor (Shanghai Genechem Co.,Ltd.,Shanghai,China)(siRNA 40～100nM、inhibitor 50nM)分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2qRT-PCR:取待測(cè)HCC cells,使用TRIZOL試劑盒(Invitrogen,USA)提取各樣品中的總RNA。取5μL總RNA樣品,用無(wú)RNA酶超純水稀釋20倍,讀取其在紫外分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,測(cè)定RNA的濃度和純度,OD260/OD280比值在1.7～2.1之間者,說(shuō)明純度較高,能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究需要。在Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (TaKaRa Biotechnology) 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA模版,應(yīng)用SYBR Green Ⅱ (TaKaRa Biotechnology) 進(jìn)行Real-time quantitative RT-PCR實(shí)驗(yàn),反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min,95℃變性10s,60℃ 退火20s,72℃延伸34s,40個(gè)循環(huán)。采取手動(dòng)方式將閾值選定在各對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線平行上升的最低點(diǎn),得到各反應(yīng)管的Ct值(Threshold cycle),數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。U6與GAPDH作為內(nèi)參,引物序列(生工生物工程上海股份有限公司合成)詳見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR中使用的引物序列

1.3細(xì)胞增殖檢測(cè):使用CCK-8 試劑盒 (Dojindo,Kumamoto,Japan) 檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×103個(gè)細(xì)胞/孔,接種于96孔板。在不同劑量X射線照射后0、24、48、72h,分別向相應(yīng)的孔中加入CCK-8試劑。將板37℃再孵育4h,并使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度。

1.4Transwell實(shí)驗(yàn):DMEM重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí),按1∶8的比例將50mg/L Matrigel膠稀釋后鋪于小室底部;遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)不鋪膠。24孔板下室加入600μL完全培養(yǎng)基,取各組細(xì)胞懸液200μL加入Transwell小室的上室,每組重復(fù)3個(gè)樣本。24h后取出小室,先用PBS溶液將小室清晰3次,然后用棉簽將小室微孔膜上層的Matrigel膠及細(xì)胞輕輕拭凈,接著用多聚甲醛(40g/L,15min)固定,用結(jié)晶紫(1g/L,10min)染色,并用PBS溶液清洗,最后將小室置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù),每個(gè)樣本隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并求其平均數(shù),以此評(píng)估細(xì)胞的侵襲、遷移能力。

1.5雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):使用Circular RNA Interactome、miRWalk預(yù)測(cè)分析circ_0007841與miR-338-3p、miR-338-3p和JAG1靶向關(guān)系結(jié)合位點(diǎn),通過(guò)將結(jié)合序列及突變的序列分別克隆至熒光素酶載體pGL3(Pro-mega,Madison,WI,USA)中來(lái)建立野生型(circ_0007841/JAG1-WT)和突變型 (circ_0007841/JAG1-MUT)熒光素酶質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)粒分別與miR-338-5p mimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞中。24h后,用Dual-Lucy Assay Kit (Solarbio)對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行評(píng)估。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 21.0 (SPSS,Inc,Chicago,IL,USA) 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和GraphPad Prism8.0(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖,所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析,多組之間的比較采用One-Way ANOVA 單因素方差分析,事后檢驗(yàn)采用Tukey's multiple comparisons test。P為雙側(cè)檢驗(yàn), P<0.01視為差異極具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié) 果

2.1HCC中circ_0007841呈高表達(dá)且促進(jìn)其惡性行為:為了探究circ_0007841在HCC中是否具有潛在調(diào)控機(jī)制,我們利用qRT-PCR檢測(cè)了人源HCC細(xì)胞系BEL-7405、SNU-387、MHCC-97H、HCCLM3、Huh7中circ_0007841的表達(dá),以正常人源肝上皮細(xì)胞系THLE-3為正常對(duì)照組,結(jié)果觀察到不同HCC細(xì)胞系中circ_0007841表達(dá)均高于THLE-3,其中Huh7細(xì)胞中表達(dá)最高(圖1A,均P<0.01),故而我們后續(xù)選取Huh7為研究對(duì)象,通過(guò)si-0007841-1/2敲低Huh7細(xì)胞中circ_0007841的表達(dá),qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率si-0007841-1效果更優(yōu)(圖1B,均P<0.01),后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用si-0007841-1作為si-RNA。進(jìn)一步,我們通過(guò)CCK-8、Transwell檢測(cè)了細(xì)胞的增殖活力、遷移與侵襲能力,觀察到抑制circ_0007841的表達(dá)后,HCC增殖活力、遷移與侵襲能力均下降(圖1C、D,均P<0.01)。以上結(jié)果提示circ_0007841可能促進(jìn)HCC的惡性行為。

圖1 circ_0007841促進(jìn)HCC的惡性行為

購(gòu)買人源HCC細(xì)胞系BEL-7405、SNU-387、MHCC-97H、HCCLM3、Huh7與正常人源肝上皮細(xì)胞系THLE-3,A:qRT-PCR檢測(cè)HCC細(xì)胞系與THLE-3中circ_0007841表達(dá);以Huh7為研究對(duì)象,B:qRT-PCR檢測(cè)si-0007841-1/2轉(zhuǎn)染效率;C:CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力;D:Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞遷移、侵襲能力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,圖中數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,數(shù)據(jù)均采用One-Way ANOVA方差分析,事后檢驗(yàn)采用Tukey's multiple comparisons test;**表示P<0.01

2.2circ_0007841靶向負(fù)調(diào)控miR-338-3p:為了探究circ_0007841的潛在調(diào)控機(jī)制,我們通過(guò)circRNA在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://circinteractome.nia.nih.gov/)預(yù)測(cè)到circ_0007841與miR-338-3p具有結(jié)合位點(diǎn)(圖2A),隨即我們通過(guò)雙熒光素酶測(cè)定進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明:與共轉(zhuǎn)染mimics-NC和circ_0007841-WT的Huh7細(xì)胞相比,共轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimic和circ_0007841-WT的Huh7細(xì)胞熒光素酶活性降低,而用circ_000784-MUT轉(zhuǎn)染的Huh7中熒光素酶活性沒(méi)有顯著變化(圖2B,P<0.01)。最后我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了不同的HCC細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)染了si-0007841的Huh7中miR-338-3p的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-338-3p在HCC細(xì)胞系中均顯著下調(diào),而轉(zhuǎn)染si-0007841上調(diào)了Huh7中miR-338-3p的表達(dá)(圖2C,均P<0.01)。以上提示在HCC中circ_0007841可靶向結(jié)合miR-338-3p抑制其表達(dá)。

圖2 circ_0007841靶向負(fù)調(diào)控miR-338-3p

2.3抑制miR-338-3p部分逆轉(zhuǎn)si-0007841對(duì)HCC細(xì)胞惡性行為的抑制作用:為了驗(yàn)證miR-338-3p在circ_0007841影響HCC惡性行為中的作用,我們共轉(zhuǎn)染了si-0007841與miR-338-3p inhibitor,qRT-PCR檢測(cè)到轉(zhuǎn)染miR-338-3p inhibitor下調(diào)了miR-338-3p的表達(dá)(圖3A,P<0.01)。而后通過(guò)CCK-8與Transwell實(shí)驗(yàn)我們觀察到轉(zhuǎn)染miR-338-3p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)了由于轉(zhuǎn)染si-0007841而下調(diào)的HCC細(xì)胞的增殖活力與遷移、侵襲能力(圖3B、C,均P<0.01)。以上結(jié)果提示circ_0007841靶向負(fù)調(diào)控miR-338-3p發(fā)揮促HCC惡性行為作用。

圖3 circ_0007841靶向負(fù)調(diào)控miR-338-3p促進(jìn)HCC惡性行為:在轉(zhuǎn)染了si-0007841的Huh7中轉(zhuǎn)染miR-338-3p inhibitor,以轉(zhuǎn)染inhibitor NC為對(duì)照,A:qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;B:CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力;C:Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞遷移、侵襲能力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,圖中數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,數(shù)據(jù)均采用One-Way ANOVA方差分析,事后檢驗(yàn)采用Tukey's multiple comparisons test;**表示P<0.01

2.4miR-338-3p靶向負(fù)調(diào)控JAG1:為了進(jìn)一步探究circ_0007841影響HCC的下游機(jī)制,我們通過(guò)miRWalk網(wǎng)站(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)了miR-338-3p的下游靶向結(jié)合基因JAG1(圖4A),同時(shí)采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-338-3p與JAG1的結(jié)合關(guān)系,共轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimic和JAG1-WT的Huh7細(xì)胞熒光素酶活性降低,而用JAG1-MUT轉(zhuǎn)染的Huh7中熒光素酶活性沒(méi)有顯著變化(圖4B,P<0.01)。最后,我們通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證了JAG1在不同HCC細(xì)胞以及各組Huh7中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在不同HCC中JAG1表達(dá)均上調(diào),轉(zhuǎn)染si-0007841降低了JAG1的表達(dá),而共轉(zhuǎn)染miR-338-3p inhibitor后則部分逆轉(zhuǎn)了這種變化(圖4C,均P<0.01)。綜上所述,HCC中高表達(dá)circ_0007841可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制miR-338-3p表達(dá),上調(diào)JAG1的轉(zhuǎn)錄,最終促進(jìn)HCC的惡性行為。

圖4 miR-338-3p靶向負(fù)調(diào)控JAG1

3 討 論

越來(lái)越多的研究表明circRNA在HCC有差異表達(dá),而這些差異表達(dá)的circRNA可能在癌癥診斷和預(yù)后中發(fā)揮生物標(biāo)志物的作用[11-12]。然而,HCC中circRNA的相關(guān)分子機(jī)制仍待進(jìn)一步探究。因此,我們通過(guò)不同HCC細(xì)胞系研究了呈上調(diào)趨勢(shì)的circ_0007841表達(dá)對(duì)HCC惡性行為的影響和潛在機(jī)制。

據(jù)報(bào)道,大多數(shù)circRNAs的功能是作為一種ceRNA來(lái)吸收幾個(gè)miRNA,然后抑制這些miRNA的活性,這增強(qiáng)了miRNA靶向基因的表達(dá)。例如,circTOLLIP可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-516a-5p來(lái)上調(diào)PBX3的表達(dá),從而促進(jìn)HCC上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在我們的研究中,我們通過(guò)熒光素酶活性分析進(jìn)一步證實(shí)了miR-338-3p能夠與circ_0007841結(jié)合。此外,我們通過(guò)si-RNA與miRNA inhibitor來(lái)敲降了circ_0007841與miR-338-3p以觀察HCC細(xì)胞的惡性行為變化,發(fā)現(xiàn)敲低circ_0007841可抑制HCC的惡性行為,而進(jìn)一步敲低miR-338-3p的功能挽救實(shí)驗(yàn)則說(shuō)明circ_0007841是通過(guò)miR-338-3p來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制功能的。總的來(lái)說(shuō),我們的數(shù)據(jù)初步探究了circ_0007841可以作為miR-338-3p的miRNA海綿,我們的發(fā)現(xiàn)可能為circ_0007841在HCC的進(jìn)展中的circRNA/miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的思路。

miRNAs通常通過(guò)與靶基因的3'-UTR相互作用來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此,我們通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了HCC中 miR-338 -3p的下游潛在靶基因JAG1。JAG1常常在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá),其作為Notch1的配體被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞之間的通訊元件,可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖以及穩(wěn)定血管。我們通過(guò)雙熒光素酶驗(yàn)證了miR-338-3p與JAG1的靶向關(guān)系,利用qRT-PCR檢測(cè)了不同HCC細(xì)胞系中的JAG1均呈高表達(dá),而抑制circ_0007841后,JAG1表達(dá)下調(diào);聯(lián)合抑制miR-338-3p的表達(dá)后,JAG1表達(dá)下調(diào)被逆轉(zhuǎn)。這說(shuō)明JAG1可能參與了circ_0007841對(duì)HCC的影響機(jī)制。

綜上所述,我們初步探究了circ_0007841/miR-338-3p/JAG1通路對(duì)HCC惡性行為的調(diào)控作用,雖然我們并未通過(guò)功能挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證下游JAG1的調(diào)控作用,但我們認(rèn)為JAG1作為一個(gè)經(jīng)典的Notch通路相關(guān)分子,可能的影響是顯而易見(jiàn)的。我們相信初步解析的circ_0007841在HCC中的調(diào)控機(jī)制可能為臨床上找尋HCC生物標(biāo)志物提供新的思路。在未來(lái),我們將進(jìn)一步多角度、深層次的探究HCC的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制。