徐成棟, 董曉俊, 李 冬

(湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科, 湖北 武漢 430014)

股骨頭骨壞死(ONFH)是一種以慢性疼痛和髖關(guān)節(jié)活動受限為特征的疾病。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭骨壞死(GIONFH)由大量使用糖皮質(zhì)激素引起,其患病率是ONFH的第一位。大量使用糖皮質(zhì)激素會在體內(nèi)引起代謝紊亂、血糖升高、凝血功能障礙等多種病理生理變化,使血液處于高凝狀態(tài),股骨頭局部形成血栓,導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死[1]。激素的過度使用導(dǎo)致成骨分化減少,脂肪分化增加,從而阻斷股骨頭的血液供應(yīng),導(dǎo)致局部骨組織塌陷,這是導(dǎo)致其壞死的主要因素,因此,加強(qiáng)血管生成和成骨是預(yù)防GIONFH或提供GIONFH早期治療的關(guān)鍵。梔子苷(GEN)是一種環(huán)烯醚萜苷,具有多種藥理作用,包括抗炎、抗氧化和骨骼保護(hù)。研究報(bào)道稱,GEN可改善地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡[2]。研究報(bào)道稱,缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路對類固醇誘導(dǎo)的兔股骨頭壞死血管生成和骨修復(fù)具有影響[3]。激活HIF-1α/VEGF信號通路可以調(diào)節(jié)骨吸收和骨再生,進(jìn)而預(yù)防大鼠GIONFH。Zhang等人[4]還發(fā)現(xiàn),GEN可以通過調(diào)控HIF-1α/VEGF信號通路調(diào)節(jié)肝癌小鼠的血管生成。GEN是否可以通過激活HIF-1α/VEGF信號通路改善GIONFH大鼠血管生成進(jìn)而對GIONFH大鼠起到保護(hù)作用,我們進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1動物:6周齡SPF級雄性SD大鼠(200～220)g購自廣西河池德恒生物科技有限公司;許可證號:SCXK桂2020-0004,12h光/暗交替循環(huán),自由采食和飲水。將室溫調(diào)整至(25±2)℃,相對濕度為(40-65)%。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本院動物倫理委員會的審核通過。

1.2主要試劑:GEN購自上海源葉生物科技有限公司;地塞米松磷酸鈉購自四川省維克奇生物科技有限公司;骨堿性磷酸酶(BALP)ELISA試劑盒購自上海名勁生物科技有限公司;骨鈣素(BGP)試劑盒購自上海佰利萊生物科技有限公司、I型膠原交聯(lián)C末端肽(CTX-I)試劑盒購自上?；钌锟萍加邢薰?CD31、vWF、VEGF、HIF-1α抗體均來自Abcam。

1.3模型制備及藥物處理:隨機(jī)選擇18只大鼠作為空白對照組(NC組),其余大鼠造模,將大鼠通過肌肉注射10mg/kg地塞米松磷酸鈉,每三天一次,持續(xù)8周。NC組注射生理鹽水。將造模成功大鼠隨機(jī)分為GIONFH組、GEN組、IDF-11774組、GEN+IDF-11774組,GEN組大鼠灌胃給予50mg/kg GEN[5]。IDF-11774組灌胃30mg/kg HIF-1α/VEGF信號通路抑制劑IDF-11774[6],GEN+IDF-11774組在灌胃50mg/kg GEN的基礎(chǔ)上灌胃30mg/kg IDF-11774,每天一次,持續(xù)四個(gè)月。每組均18只大鼠。GIONFH組、NC組僅灌胃等量生理鹽水。

1.4樣本采集:在藥物治療結(jié)束24h后,麻醉大鼠用采血針從腹主動脈采血3mL分離血清后用于ELISA實(shí)驗(yàn),取6只大鼠股骨用于顯微CT掃描分析,6只大鼠股骨組織用于HE染色和免疫熒光染色。其余大鼠股骨組織做Western blot。

1.5血管造影和顯微CT掃描:在藥物治療24h后,使用血管造影術(shù)和顯微CT掃描來評估股骨頭的微觀結(jié)構(gòu)。簡言之,在大鼠全身麻醉后,將4%的多聚甲醛和Microfil灌注到開放腹腔的腹主動脈中。然后在4℃下過夜后,分離雙側(cè)股骨頭。脫鈣后,使用9微米體素的顯微CT掃描來檢查樣本,并使用CTVol軟件量化總血管體積,測量骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)。

1.6ELISA法檢測骨代謝指標(biāo):根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清BALP、BGP、CTX-I含量。

1.7HE染色檢測股骨組織病理變化:使用4%多聚甲醛在4℃下固定股骨頭樣品24h,然后用10%乙二胺四乙酸(EDTA,pH7.4)脫鈣21d。脫鈣后,將樣品在不同濃度的乙醇中脫水,包埋在石蠟中,切成5μm,并用HE染色。光學(xué)顯微鏡對所有標(biāo)本進(jìn)行觀察。

1.8免疫組化染色檢測CD31、vWF表達(dá):首先將股骨固定在4%多聚甲醛24h,10% EDTA(pH7.4)脫鈣21d,然后石蠟包埋。采用厚度為5μm的縱向骨切片進(jìn)行染色。將石蠟包埋的切片安裝在載玻片上,脫蠟,脫水?？乖迯?fù)、血清封閉后,將載玻片與CD31、vWF一抗在4℃下孵育過夜。用PBS洗滌后,將載玻片與二抗在37℃下孵育1h,加入DAB孵育5min,蘇木素染色5min,透明二甲苯封片,用PBS沖洗,光鏡分析結(jié)果。

1.9Western blot檢測:HIF-1α/VEGF信號通路蛋白表達(dá):股骨組織通過RIPA裂解緩沖液提取蛋白質(zhì),并應(yīng)用BCA測定試劑盒測量總蛋白質(zhì)濃度。此后,在95℃下加熱5min,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。使用SDS-PAGE分離30μg蛋白質(zhì)樣品,然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉封閉膜,然后用一抗VEGF(1∶1000)、HIF-1α(1∶2000)和GAPDH抗體(1∶1000)在4℃下孵育過夜,二抗孵育2h。用ECL可視化條帶。使用Image J軟件對蛋白進(jìn)行量化。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血管造影和顯微CT掃描分析:血管造影結(jié)果顯示,GIONFH組股骨頭血管明顯破壞,GIONFH組的血管體積相對于NC組顯著降低(P<0.05),GEN給藥對股骨頭的血管產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用,GEN組血管體積較GIONFH組顯著升高(P<0.05),而IDF-11774組趨勢相反;GEN+IDF-11774組股骨頭血管與GIONFH組相似,GEN+IDF-11774組血管體積相較于GEN組顯著降低(P<0.05),見圖1。根據(jù)顯微CT掃描結(jié)果,發(fā)現(xiàn)GIONFH組大鼠股骨頭骨表面結(jié)構(gòu)破壞,骨頭上有大量的空洞,BV/TV顯著降低(P<0.05);與GIONFH組相比,GEN組股骨頭表面光滑、結(jié)構(gòu)完整,股骨頭內(nèi)部結(jié)構(gòu)無明顯異常,BV/TV顯著升高(P<0.05),而IDF-11774組趨勢相反;GEN+IDF-11774組與GIONFH組結(jié)構(gòu)相似,GEN+IDF-11774組BV/TV相較于GEN組顯著降低(P<0.05),見圖2-3。

圖1 各組大鼠股骨頭血管代表性圖像

圖2 各組大鼠股骨頭顯微CT掃描圖像

圖3 各組大鼠血管體積的比較

2.2各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較:GIONFH組較NC組BALP、BGP均顯著下降(P<0.05),CTX-I含量顯著升高(P<0.05);與GIONFH組相比較,GEN組BALP、BGP含量均顯著升高(P<0.05),CTX-I含量顯著下降(P<0.05),而IDF-11774組BALP、BGP含量顯著下降(P<0.05),CTX-I含量顯著增加高(P<0.05);GEN+IDF-11774組較GEN組BALP、BGP含量均顯著下降(P<0.05),CTX-I含量顯著上升(P<0.05)見圖4。

圖4 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較

2.3各組大鼠股骨組織病理變化的比較:NC組股骨組織結(jié)構(gòu)正常;GIONFH組股骨頭軟骨層變薄,骨排列稀疏無序,空腔增加;與GIONFH組相比較,GEN組股骨組織結(jié)構(gòu)改善,骨排列較為整齊,空腔減少,而IDF-11774組加重股骨組織損傷;GEN+IDF-11774組與GIONFH組股骨組織結(jié)構(gòu)相似,見圖5。

圖5 HE染色檢測股骨組織病理變化(×100)

2.4各組大鼠CD31、vWF水平的比較:GIONFH組較NC組CD31、vWF陽性面積百分比顯著下降(P<0.05);與GIONFH組相比較,GEN組CD31、vWF陽性面積百分比顯著升高(P<0.05),而IDF-11774組趨勢相反(P<0.05);GEN+IDF-11774組較GEN組CD31、vWF陽性面積百分比顯著降低(P<0.05),見圖6-7。

圖6 免疫組化染色檢測CD31、vWF表達(dá)(×200)

圖7 GEN對大鼠CD31、vWF水平的影響

2.5各組大鼠HIF-1α/VEGF通路蛋白表達(dá):GIONFH組較NC組HIF-1α、VEGF蛋白水平均顯著降低(P<0.05);與GIONFH組相比較,GEN組HIF-1α、VEGF蛋白水平均顯著升高(P<0.05),而IDF-11774組結(jié)果相反(P<0.05);GEN+IDF-11774組較GEN組HIF-1α、VEGF蛋白水平均顯著下降(P<0.05),見圖8、9。

圖8 Western blot檢測股骨組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)

圖9 GEN對大鼠HIF-1α、VEGF蛋白的影響

3 討 論

GIONFH是骨科常見的難治性疾病,在中國影響數(shù)百萬人[7]。因此,有必要建立新的治療策略來防治GIONFH。GEN是一種來自杜仲的純化環(huán)烯醚萜苷。GEN已被證明可以增加成骨細(xì)胞增殖和分化[8]。GEN可以改善地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞膽固醇積累[9]。GEN通過減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和成骨細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)出對地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)活性[5]。以上研究暗示GEN可能對GIONFH大鼠起到治療效果。本研究發(fā)現(xiàn),GIONFH組股骨頭血管明顯破壞,大鼠股骨頭骨表面結(jié)構(gòu)破壞,骨頭上有大量的空洞,股骨頭軟骨層變薄,骨排列稀疏無序,空腔增加,GIONFH組較NC組的血管體積、BV/TV顯著降低,表明GIONFH大鼠模型構(gòu)建成功。而GEN處理后對股骨頭的血管產(chǎn)生了顯著的保護(hù)作用,股骨頭表面光滑、結(jié)構(gòu)完整,股骨頭內(nèi)部結(jié)構(gòu)無明顯異常,血管體積、BV/TV顯著升高,表明GEN可能對GIONFH大鼠起到積極的治療作用。

BALP、BGP是骨形成常見指標(biāo),在促進(jìn)骨形成方面起關(guān)鍵作用,CTX-I是常見的骨吸收指標(biāo),可以通過減少骨吸收和促進(jìn)骨形成來改善骨密度,進(jìn)而治療GIONFH[10]。血管生成為骨形成提供氧氣和營養(yǎng),這與骨穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。CD31和vWF常用于評估血管生成[11]。本研究發(fā)現(xiàn),GIONFH組較NC組BALP、BGP含量、CD31、vWF陽性面積百分比均顯著降低,CTX-I含量顯著升高,而GEN處理后BALP、BGP含量、CD31、vWF陽性面積百分比均顯著增加,CTX-I含量顯著減少,表明GEN可能通過促進(jìn)血管形成,改善骨密度,進(jìn)而對GIONFH大鼠起到治療效果。

HIF-1α/VEGF信號通路是血管生成的關(guān)鍵通路,通過激活HIF-1α/VEGF信號軸可以調(diào)節(jié)骨生成和血管生成,以促進(jìn)骨折愈合,預(yù)防病理性骨質(zhì)流失、骨壞死、骨關(guān)節(jié)炎和骨轉(zhuǎn)移[12]。本研究發(fā)現(xiàn),GIONFH大鼠HIF-1α、VEGF蛋白低表達(dá),而GEN治療后,HIF-1α、VEGF蛋白水平均顯著升高,暗示GEN可以通過上調(diào)HIF-1α/VEGF信號軸,促進(jìn)血管生成,進(jìn)而對GIONFH大鼠起到保護(hù)作用。為了進(jìn)一步證實(shí)我們的猜測,我們用HIF-1α/VEGF信號通路抑制劑IDF-11774處理GIONFH大鼠以及GEN處理的GIONFH大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),IDF-11774組大鼠HIF-1α、VEGF蛋白顯著降低,且IDF-11774逆轉(zhuǎn)了GEN對GIONFH大鼠血管生成的改善作用。

綜上所述,GEN可能通過上調(diào)HIF-1α/VEGF信號通路改善GIONFH大鼠骨形成和血管生成。然而,GEN治療GIONFH大鼠的最佳劑量以及是否可以通過調(diào)節(jié)其它通路產(chǎn)生同等治療效果,需要下一步深入探索。