林曉燕, 方麗鑫, 黃麗霞, 楊杰書

(青島大學(xué)附屬青島市中心醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科, 山東 青島 266013)

缺血性腦卒中是一種腦部缺血引起的疾病,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致患者喪失行動(dòng)和認(rèn)知能力,具有高發(fā)病率、高殘疾率及高死亡率的特點(diǎn),嚴(yán)重增加患者家庭以及社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。近年來,隨著缺血性腦卒中患者的逐漸年輕化,尋求治療缺血性腦卒中的新藥迫在眉睫。缺血性腦卒中可引起一系列的炎癥反應(yīng),腦組織中炎癥因子的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致患者神經(jīng)元損傷,進(jìn)而表現(xiàn)為認(rèn)知障礙[2]。環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶/干擾素基因刺激因子(cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes,cGAS/STING)通路的激活可誘導(dǎo)促炎因子過度表達(dá),抑制cGAS/STING信號(hào)通路可緩解炎癥反應(yīng)[3]。扁蒴藤素(Pristimerin,PT)是從衛(wèi)矛科和翅子藤科植物中提取的一種天然醌甲基三萜,已被證明具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[4],據(jù)報(bào)道,扁蒴藤素可抑制膿毒癥腦損傷小鼠的神經(jīng)元炎癥并保護(hù)認(rèn)知功能[5],扁蒴藤素能否通過cGAS/STING通路參與缺血性腦卒中大鼠的認(rèn)知功能和神經(jīng)炎癥反應(yīng)尚未見報(bào)道。本研究旨在探索扁蒴藤素對(duì)缺血性腦卒中大鼠的認(rèn)知功能和神經(jīng)炎癥的影響及其作用機(jī)制,為缺血性腦卒中患者的治療提供一定的解決思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:7～8周齡雄性SD大鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量(200～220)g,購(gòu)于廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司,許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0055。大鼠在適宜溫度、相對(duì)濕度55%、12h循環(huán)光照、可以自由地取食和喝水條件下,喂養(yǎng)7d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑:扁蒴藤素(純度:≥98%,規(guī)格:20mg/支,編號(hào):DA0040)購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司;線栓,購(gòu)于深圳市瑞沃德生命科技有限公司;DMXAA,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;IL-6(SEKR-0005)、IL-1β(SEKR-0002)酶聯(lián)免疫試劑盒及cGAS(K006370P),購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;STING(50494),購(gòu)于賽信通(上海)生物試劑有限公司;iNOS(sc7271)、Arg-1(sc271430),購(gòu)于圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.3方 法

1.3.1造模及分組處理:將大鼠隨機(jī)分為Control組(正常大鼠),MCAO組(大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠),扁蒴藤素低、中、高劑量組(PT-L組、PT-M組、PT-H組)、扁蒴藤素高劑量+DMXAA組(PT-H+DMXAA組),每組15只。除Control組外,其余大鼠采用線栓法[6]制備MCAO模型,暴露大鼠頸總動(dòng)脈,插入線栓并固定阻斷大腦中動(dòng)脈一定時(shí)間后恢復(fù),縫合傷口,Control組大鼠僅做暴露頸動(dòng)脈及縫合處理。根據(jù)大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分法評(píng)價(jià)造模是否成功(1～3分視為造模成功)。造模成功后,大鼠在適宜環(huán)境下自由進(jìn)食飲水24h后,PT-L組、PT-M組、PT-H組分別采用灌胃的方式給予10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg扁蒴藤素[5],PT-H+DMXAA組灌胃100mg/kg扁蒴藤素+25mg/kgDMXAA[7],Control組(正常大鼠),MCAO組給予等量生理鹽水,1次/d,連續(xù)給藥7d。實(shí)驗(yàn)過程所有操作均經(jīng)過本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)審核批準(zhǔn)。

1.3.2大鼠神經(jīng)功能行為評(píng)價(jià):給藥結(jié)束之后,采用Zea-Longa評(píng)分評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能。評(píng)分規(guī)則:0分:無神經(jīng)功能損傷;1分:提尾時(shí)不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢;2分:行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn);3分:行走時(shí)身體向?qū)?cè)傾倒;4分:無法行走,意識(shí)喪失。

1.3.3大鼠認(rèn)知功能評(píng)價(jià):通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)價(jià),將水池均分為4個(gè)板塊,其中一個(gè)板塊中放入隱藏平臺(tái)。定位航行實(shí)驗(yàn):在池壁任意一起點(diǎn)放入大鼠,記錄大鼠的游泳路徑及找到目標(biāo)平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期),若90s找不到平臺(tái),則潛伏期記為90s。在固定時(shí)間訓(xùn)練4次/d,每次間隔90s,計(jì)算潛伏期平均值,訓(xùn)練連續(xù)進(jìn)行4d;空間探索實(shí)驗(yàn):移走站臺(tái),在任一入水點(diǎn)放入大鼠,記錄大鼠在90s內(nèi)的游泳路徑及在原平臺(tái)位置穿越的次數(shù),評(píng)價(jià)大鼠的空間定位能力。

1.3.4腦組織病理學(xué)變化觀察:HE染色法觀察各組大鼠腦組織病理學(xué)變化,每組隨機(jī)取5只大鼠,脫頸處死大鼠,取部分腦組織經(jīng)固定(10%福爾馬林溶液)、脫水、包埋、切片、干燥、蘇木精-伊紅染色,在顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3.5大鼠腦梗死面積計(jì)算:2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法觀察并計(jì)算大鼠腦梗死面積。各組隨機(jī)選取5只大鼠脫頸處死后迅速取腦,液氮速凍后進(jìn)行冠狀切片,每只5片,放入2%TTC溶液中染色,37℃水浴處理15min,固定,拍照并使用Image軟件計(jì)算腦梗死面積。

1.3.6大鼠血清中各因子水平檢測(cè):ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IL-6、IL-1β水平。對(duì)各組剩余5只大鼠進(jìn)行腹腔靜脈采血,離心,取上清液,按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)大鼠血清中IL-6、IL-1β水平。

1.3.7大鼠腦組織中iNOS、Arg-1、cGAS、STING蛋白表達(dá)水平:1.3.6中大鼠脫頸處死,取腦組織,加入RIPA裂解液、離心提取總蛋白并進(jìn)行定量分析;經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,加入5%脫脂奶粉封閉90min,TBST清洗3次,加入一抗稀釋液,在4℃條件下孵育過夜;次日加入對(duì)應(yīng)二抗孵育,在室溫條件下繼續(xù)孵育120min,TBST清洗3次,曝光顯影,分析蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較:與Control組比較,MCAO組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分呈劑量依賴性降低(P<0.05);與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2各組大鼠認(rèn)知功能比較:與Control組比較,MCAO組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05),穿過原平臺(tái)位置的次數(shù)顯著減少;與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組大鼠逃避潛伏期縮短,穿過原平臺(tái)位置的次數(shù)顯著增多(P<0.05),且呈藥物劑量依賴性。與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng),穿過原平臺(tái)位置的次數(shù)顯著減少(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠逃避潛伏期及穿過平臺(tái)次數(shù)比較

2.3各組大鼠腦組織病理學(xué)比較:Control組大鼠腦組織海馬CA1區(qū),細(xì)胞染色均勻,細(xì)胞形態(tài)正常,排列規(guī)則緊密;MCAO組腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞較多病變壞死,細(xì)胞核萎縮染色不均勻,細(xì)胞排列紊亂;與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組細(xì)胞形態(tài)改善,神經(jīng)元增多;與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組細(xì)胞變形、神經(jīng)元壞死嚴(yán)重,見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)病理學(xué)變化(HE染色,×400)

2.4各組大鼠腦梗死面積比較:圖片中白色區(qū)域即為腦梗死部分,與Control組比較,MCAO組大鼠腦組織切片中,白色區(qū)域擴(kuò)大,即腦梗死面積顯著增加(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組切片中變色區(qū)域逐漸縮小,即大鼠腦梗死面積減少(P<0.05),且呈劑量依賴性;與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠腦梗死面積顯著增加(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腦組織TTC染色

表3 各組大鼠腦梗死面積比較

2.5各組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS和Arg-1表達(dá)比較:與Control組比較,MCAO組iNOS表達(dá)顯著升高,Arg-1表達(dá)顯著降低(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組iNOS表達(dá)顯著降低,Arg-1表達(dá)顯著升高(P<0.05);與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組iNOS表達(dá)顯著升高,Arg-1表達(dá)顯著降低(P<0.05),見圖3、表4。

圖3 各組大鼠腦組織iNOS和Arg-1表達(dá)比較

表4 各組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS和Arg-1表達(dá)比較

2.6各組大鼠血清中IL-6、IL-1β水平比較:與Control組比較,MCAO組大鼠血清中IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組大鼠血清中IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05);與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠血清中IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠血清中IL-6 IL-1β水平比較

2.7各組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達(dá):與Control組比較,MCAO組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與MCAO組比較,PT-L組、PT-M組、PT-H組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與PT-H組比較,PT-H+DMXAA組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見圖4、表6。

圖4 各組大鼠腦組織中cGAS、STING蛋白表達(dá)

表6 各組大鼠腦組織中cGAS STING蛋白表達(dá)比較

3 討 論

缺血性腦卒中又被稱為腦梗、中風(fēng),由腦部供血障礙引起部分腦組織缺血而導(dǎo)致,已成為我國(guó)發(fā)病率較高的疾病之一,由于發(fā)病速度快,就診時(shí)即已出現(xiàn)認(rèn)知損傷及神經(jīng)炎癥,因此,在損傷初期進(jìn)行一定藥物干預(yù)對(duì)患者預(yù)后具有重要意義。

中樞神經(jīng)炎癥在缺血性腦卒中導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙中發(fā)揮關(guān)鍵作用,降低缺血性腦卒中后的炎癥反應(yīng)是目前臨床上緩解缺血性腦卒中后遺癥的主要手段之一[8]。扁蒴藤素屬于醌甲基三萜類化合物,是中藥過山楓的重要活性成分,具有顯著的抗炎活性,可抑制促炎因子(如腫瘤壞死因子、IL-6等)分泌,提高抑炎因子(如IL-10)分泌,已被證明可降低腦損傷小鼠的神經(jīng)元炎癥反應(yīng),保護(hù)其認(rèn)知功能[5]。本研究結(jié)果顯示,扁蒴藤素可改善腦卒中大鼠的認(rèn)知功能障礙,縮小腦組織梗死面積,緩解炎癥損傷。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種免疫細(xì)胞,參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程,在腦卒中后的病理發(fā)展中具有重要調(diào)控作用。非活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞在不同的環(huán)境下可被刺激極化為M1型(標(biāo)記物iNOS)或M2標(biāo)記物(Arg-1)型,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可釋促炎因子,加重炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),破壞神經(jīng)元,加重神經(jīng)功能損傷;M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放抗炎因子,抑制炎癥反應(yīng),緩解神經(jīng)功能損傷。有研究證明,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化可縮小缺血性腦卒中大鼠腦梗死面積,減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,緩解炎癥反應(yīng)[9]。表明抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型活化是治療腦卒中神經(jīng)炎癥損傷的有效方法。在本研究中,PT干預(yù)后,缺血性腦卒中大鼠腦組織中iNOS表達(dá)下調(diào),Arg-1表達(dá)上調(diào),且促炎因子IL-6、IL-1β水平降低,表明扁蒴藤素可抑制缺血性腦卒中大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞M1型活化,促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的M2型活化,緩解神經(jīng)元損傷。

cGAS/STING信號(hào)通路參與炎癥、癌癥、神經(jīng)元損傷的發(fā)展,據(jù)報(bào)道,小膠質(zhì)細(xì)胞cGAS/STING通路可被線粒體DNA激活,促進(jìn)促炎微環(huán)境的形成,加重缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和腦損傷,抑制cGAS/STING通路的激活是治療缺血性腦卒中的新治療途徑[10]。此外,有研究顯示,脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化伴有cGAS/STING通路激活,cGAS拮抗劑和STING拮抗劑可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化;表明cGAS/STING信號(hào)通路的激活與小膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型激活相關(guān)。cGAS是一種核苷酸轉(zhuǎn)移酶,存在于多種組織細(xì)胞中,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)細(xì)胞損傷或應(yīng)激反應(yīng)后,cGAS和STING表達(dá)上調(diào),促進(jìn)炎癥因子的釋放,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高,加重機(jī)體組織損傷[10]。申明琪[11]等研究發(fā)現(xiàn)抑制cGAS/STING通路可降低缺血缺氧性腦病新生大鼠腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,減輕腦組織損傷。劉凱[12]等研究發(fā)現(xiàn),抑制cGAS/STING通路對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠具有一定的腦保護(hù)作用。在本研究中,扁蒴藤素干預(yù)可以抑制cGAS、STING蛋白的表達(dá),下調(diào)IL-6、IL-1β水平,進(jìn)而緩解大鼠的腦組織病理發(fā)展,與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。提示扁蒴藤素可能通過抑制cGAS/STING通路,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型激活,進(jìn)而緩解腦卒中大鼠認(rèn)知障礙及神經(jīng)炎癥損傷。

綜上所述,扁蒴藤素可通過抑制cGAS/STING通路緩解腦卒中大鼠認(rèn)知障礙及神經(jīng)炎癥損傷,其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。