張?chǎng)?，陳淑俁，游佳鴻，倪 莉

（福州大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)研究所 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心 福州 350108）

水產(chǎn)品是蛋白質(zhì)和其它必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要來(lái)源，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。然而，水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量豐富，易引起微生物的大量滋生，導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。常用的水產(chǎn)品保鮮方式主要是低溫保鮮和化學(xué)保鮮[1]，而生物保鮮逐漸成為趨勢(shì)[2]。采用微生態(tài)保鮮劑進(jìn)行保鮮，成本低，極具發(fā)展前景[3]?？莶菅挎邨U菌對(duì)魚(yú)肉、農(nóng)產(chǎn)品具有防腐保鮮的效果。劉奎等[4]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液可提高獼猴桃采后果實(shí)品質(zhì)并延長(zhǎng)果實(shí)貨架期。經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)處理的蝦肉，能夠延長(zhǎng)2～3 d 的冷藏貨架期，減緩腐敗細(xì)菌對(duì)蝦肉蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)的分解[5]。目前，主要針對(duì)枯草芽孢桿菌抗菌肽的研究，如枯草芽孢桿菌可通過(guò)產(chǎn)生表面活性素、細(xì)菌素等多種抑菌物質(zhì)拮抗細(xì)菌或病原菌生長(zhǎng)[6]。而課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，將枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑喂養(yǎng)羅非魚(yú)，可延緩冰鮮羅非魚(yú)腐敗，其主要機(jī)理是枯草芽孢桿菌可通過(guò)與黏膜上皮細(xì)胞黏附成膜，從而在機(jī)體內(nèi)定植[8]，調(diào)節(jié)腸道微生物群組成，以防止致病微生物定植于上皮細(xì)胞而導(dǎo)致宿主感染[9]。以上說(shuō)明利用益生菌的生物膜形成特性來(lái)抑制腐敗菌定植，是研究魚(yú)體保鮮的一個(gè)新途徑[10]。本研究探討枯草芽孢桿菌的生物膜形成能力對(duì)魚(yú)片保鮮的影響，為枯草芽孢桿菌作為微生態(tài)保鮮劑提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

試驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌分離于羅非魚(yú)體或魚(yú)池，經(jīng)過(guò)16S rRNA 和生理生化鑒定[11-12]，篩選得到16 株枯草芽孢桿菌用于后續(xù)試驗(yàn)。腐敗菌為假單胞菌（Pseudomonas spp.）L1、L2、L3，為福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所前期從羅非魚(yú)體中分離并鑒定，4 ℃保藏于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基。試驗(yàn)所用鮮活羅非魚(yú)購(gòu)自福州超市。

試劑及 微生物 培養(yǎng)基：NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、Na2CO3、NaHCO3、乙醇、瓊脂粉、牛肉浸膏、十二烷基硫酸鈉（SDS），國(guó)藥試劑公司；異硫氰酸熒光素（FITC），吉至生化公司；胰蛋白胨、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基，海博生物公司；結(jié)晶紫，西隴化工公司。以上試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)儀器及設(shè)備見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌特性表征

1）枯草芽孢桿菌生物膜形成能力測(cè)定 參考張?chǎng)┑萚13]對(duì)細(xì)菌生物膜的檢測(cè)，并做適當(dāng)修改。取過(guò)夜培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物經(jīng)8 000 r/min離心沉淀10 min，將沉淀物用生理鹽水重懸3 次后制備OD600nm值為1.0±0.05 的菌懸液。在無(wú)菌操作臺(tái)將上述菌懸液與滅菌后的新鮮牛肉膏蛋白胨液態(tài)培養(yǎng)基按照體積比1∶10 混勻，然后取200 μL 至酶標(biāo)板中，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)結(jié)束后棄菌液并添加200 μL 無(wú)菌PBS沖洗，重復(fù)2 次。在室溫環(huán)境下晾干，然后加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫染色液染色15 min，棄染色液并用無(wú)菌去離子水沖洗4 次后，充分晾干，再加入95%的乙醇，將染色后的枯草芽孢桿菌充分溶解，從溶解液中取150 μL 放入新的96 孔酶標(biāo)板中，空白組為空的酶標(biāo)板，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的OD590nm。

2）枯草芽孢桿菌表面疏水性測(cè)定 參考張?chǎng)┑萚13]對(duì)細(xì)菌表面疏水性的測(cè)定?？莶菅挎邨U菌的表面疏水率計(jì)算公式：

式中，A0——與二甲苯混勻前水相吸光度；A1——與二甲苯混勻后水相吸光度。

3）枯草芽孢桿菌自凝聚率測(cè)定 參考Rahman 等[14]對(duì)細(xì)菌自凝聚率的測(cè)定?？莶菅挎邨U菌的自凝聚率計(jì)算公式：

式中，SR——靜置t 小時(shí)枯草芽孢桿菌的自凝聚率（%）；A0——枯草芽孢桿菌初始的OD600nm；At——枯草芽孢桿菌靜置t 小時(shí)的OD600nm。

4）枯草芽孢桿菌與假單胞菌的共凝聚率測(cè)定 取過(guò)夜培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物經(jīng)8 000 r/min 離心沉淀10 min，將沉淀物用生理鹽水重懸，并調(diào)OD600nm值為0.5±0.02?？莶菅挎邨U菌和假單胞菌各取150 μL 菌懸液在96 孔酶標(biāo)板的同一個(gè)孔中，30 ℃孵育4 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定混合菌液的OD600nm值。每組3 個(gè)平行，以300 μL 單種菌液為對(duì)照。

共凝聚率計(jì)算公式：

式中，X——枯草芽孢桿菌的共凝聚率（%）；SC——假單胞菌單獨(dú)孵育4 h 的OD600nm值；LC——枯草芽孢桿菌單獨(dú)孵育4 h 的OD600nm值；S+L——混合菌孵育4 h 后的OD600nm值。

1.3.2 枯草芽孢桿菌抑菌能力測(cè)定

1）枯草芽孢桿菌對(duì)假單胞菌的對(duì)峙抑菌率測(cè)定 將枯草芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)皿中央，30 ℃培養(yǎng)12 h，以枯草芽孢桿菌為中心畫(huà)十字，周邊間隔1 cm 點(diǎn)種腐敗菌繼續(xù)培養(yǎng)36 h，記錄最外層（A1）和最內(nèi)層（A2）腐敗菌的直徑均值。所用的指示腐敗菌為假單胞菌L1、L2、L3。對(duì)峙抑菌率的計(jì)算公式為：

2）枯草芽孢桿菌上清液對(duì)假單胞菌的抑菌率測(cè)定 取過(guò)夜培養(yǎng)后的培養(yǎng)液8 000 r/min 離心10 min，取上清液過(guò)0.25 μm 的濾膜制成無(wú)菌上清液。將OD600nm值為0.7±0.02 的腐敗菌10 μL 分別加于1 mL 牛肉膏蛋白胨液態(tài)培養(yǎng)基中，試驗(yàn)組加入80 μL 的枯草芽孢桿菌上清液，對(duì)照組不加上清液，并在30 ℃下培養(yǎng)16 h，酶標(biāo)儀測(cè)定OD600nm。所用的指示腐敗菌為假單胞菌L1、L2、L3。計(jì)算公式：

式中，C1——對(duì)照組的OD600nm；C2——試驗(yàn)組的OD600nm。

1.3.3 枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚(yú)片的保鮮能力

1）無(wú)菌魚(yú)片及菌懸液的制備 將新鮮羅非魚(yú)去除內(nèi)臟并用無(wú)菌水沖洗干凈，在無(wú)菌操作間用吸水紙去除魚(yú)體表面的水分，用無(wú)菌解剖刀取背部魚(yú)肉并均勻切成厚薄均勻、質(zhì)量約為（2.0±0.02）g 的魚(yú)片，在無(wú)菌操作室紫外照射消毒20 min 后得到無(wú)菌魚(yú)片，備用。

分別從營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中挑取已活化的枯草芽孢桿菌和假單胞菌，劃線接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，得到細(xì)菌種子液。將枯草芽孢桿菌和假單胞菌種子液以5%接種量接種于新鮮的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)24 h 得到發(fā)酵液，離心去除上清后，用生理鹽水調(diào)整菌液濃度調(diào)至108CFU/mL，得到細(xì)菌菌懸液。在20 mL假單胞菌菌懸液中加入10 mL 的枯草芽孢桿菌菌懸液，供試驗(yàn)組魚(yú)片用。在20 mL 假單胞菌發(fā)酵液中加入10 mL 生理鹽水，供空白組魚(yú)片用。將制備好的魚(yú)片放入上述30 mL 菌懸液中浸泡20 s，取出瀝干30 s，置于無(wú)菌均質(zhì)袋中密封，4 ℃貯藏，每24 h 取樣，均質(zhì)備用。

2）揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定 參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》（GB 5009.228-2016）[15]中的方法。稱取均質(zhì)后的魚(yú)肉樣品（10.00±0.01）g 于蒸餾管中，加入75 mL 蒸餾水，振蕩混勻，浸漬30 min。自動(dòng)凱氏定氮儀參數(shù)設(shè)置：硼酸接收液30 mL，蒸餾時(shí)間3 min。往蒸餾管中加入1 g 氧化鎂輕質(zhì)粉末，連接凱氏定氮儀，開(kāi)始蒸餾。蒸餾結(jié)束，用0.0100 mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定硼酸接收液，混合指示液的終點(diǎn)顏色為紫紅色。TVB-N 計(jì)算公式：

式中，Y——樣品的TVB-N 含量（mg/100g）；V1——實(shí)驗(yàn)組樣品消耗的鹽酸體積（mL）；V2——空白組消耗的鹽酸體積（mL）；c——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的濃度（mol/L）；m——樣品的質(zhì)量（g）。

3）揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定 參考王雪鋒等[16]的方法并適當(dāng)修改，稱?。?±0.02）g 魚(yú)肉放入15 mL 萃取瓶中，加入攪拌子和5 mL 飽和NaCl 溶液，加入200 μL 原始質(zhì)量濃度為2 mg/L 的內(nèi)標(biāo)2，4，6-三甲基吡啶，擰緊瓶蓋，置于60 ℃水浴中平衡5 min，將萃取針插入樣品瓶中進(jìn)行頂空吸附，萃取30 min。萃取結(jié)束后，將萃取針插入GC 進(jìn)樣口，解吸3 min 后拔針。在優(yōu)化的內(nèi)標(biāo)物濃度下，結(jié)合內(nèi)標(biāo)物與風(fēng)味物質(zhì)積峰面積的比例，計(jì)算化合物的濃度，計(jì)算公式如下：

式中，Ai——揮發(fā)性組分i 的峰面積；A——內(nèi)標(biāo)物的峰面積；C——內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果均以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示，采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行制圖，SPSS 32.0 軟件中的Duncan 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌生物膜形成能力分析

研究表明益生菌黏附定植于機(jī)體上皮細(xì)胞表面形成膜菌群，發(fā)揮生物屏障作用，抑制有害菌的黏附[17]，因此益生菌的生物膜形成能力越強(qiáng)，其抵御能力越強(qiáng)。各枯草芽孢桿菌菌株的生物膜形成能力如圖1 所示，根據(jù)生物膜形成能力差異，將16 株枯草芽孢桿菌分類為：低成膜性枯草芽孢桿菌B10、B2、B5、B9、C2，中成膜性枯草芽孢桿菌C4、B6、C5、B3、C1、B7、B4 和高成膜性枯草芽孢桿菌C3、B1、B8、C6，并進(jìn)一步選取高成膜性菌株C6、B8，中成膜性菌株B3、C5，低成膜性菌株B2和B10 進(jìn)行魚(yú)片的保鮮能力研究。

圖1 枯草芽孢桿菌的生物膜形成能力Fig.1 Biofilm formation ability of Bacillus subtilis

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)魚(yú)片的保鮮作用

將6 株枯草芽孢桿菌接入被假單胞菌L1 污染的羅非魚(yú)片中，評(píng)估不同成膜效果枯草芽孢桿菌在魚(yú)片低溫貯藏期間的保鮮能力。采用揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）為鮮度指標(biāo)，并使用GC-MS 分析了魚(yú)片揮發(fā)性氣味的變化。

2.2.1 枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚(yú)片中揮發(fā)性鹽基氮的影響 以魚(yú)肉的揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）為保鮮指標(biāo)，魚(yú)肉的保鮮終點(diǎn)為30 mg/100 g[18]。由表2 可知，相比假單胞菌組（L1），枯草芽孢桿菌降低了魚(yú)片中TVB-N 的含量，且高成膜性枯草芽孢桿菌C6、B8 效果最為顯著。

表2 羅非魚(yú)片中揮發(fā)性鹽基氮的含量Table 2 Content of the TVB-N in tilapia fillets

2.2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚(yú)片中揮發(fā)性氣味的影響 魚(yú)體腐敗風(fēng)味化合物是貯藏過(guò)程中腐敗細(xì)菌作用和其發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。對(duì)比不同枯草芽孢桿菌處理后的魚(yú)片揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化情況，進(jìn)一步分析魚(yú)肉的鮮度變化。根據(jù)TVB-N 指標(biāo)確定第3 天為低溫貯藏羅非魚(yú)片的鮮度終點(diǎn)，采用GC-MS 測(cè)定第3 天魚(yú)肉的揮發(fā)性成分。如表3 所示，假單胞菌L1 處理后的魚(yú)片主要產(chǎn)生醇類、雜環(huán)類、酚類和酸類等風(fēng)味化合物，加入枯草芽孢桿菌后，這些化合物產(chǎn)生的種類及數(shù)量均下降。高成膜性的枯草芽孢桿菌C6 和B8作用效果最為明顯，顯著抑制了魚(yú)肉中醇類、酸類、酯類和酚類等揮發(fā)性氣味的產(chǎn)生。進(jìn)一步采用PCA 分析，如圖2 所示，貯藏3 d 后，不同處理組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有差異，且與枯草芽孢桿菌的成膜性密切相關(guān)：高成膜性菌株C6、B8 位于第4象限，中成膜性菌株B3、C5 位于第3 象限，低成膜性菌株B2 和B10 位于第1，2 象限，且成膜性最低的B2 與假單胞菌L1 組共同位于第1 象限。位于第1 象限的B2 和L1 組特征風(fēng)味為苯酚、吲哚、異戊醇、乙醇、芐醇、乙酸、N-二乙基二硫代氨基甲酸甲酯、棕櫚酸甲酯等揮發(fā)性風(fēng)味化合物。其中，苯酚具有典型的塑料橡膠味[19]，吲哚具有濃郁的糞臭味，是腐敗魚(yú)主要腥臭味的來(lái)源[20]。乙醇、芐醇和異戊醇等具有辛辣刺激味，而乙酸帶有刺激性的酸臭味[21]。N-二乙基二硫代氨基甲酸甲酯和棕櫚酸甲酯等酯類則帶脂肪油蠟味，也是酸敗味的重要組成成分[22]。高成膜的枯草芽孢桿菌C6組主要風(fēng)味特征為葵醛、十四烷和2-十三烷酮?？┫♂尯缶哂谐茸拥南銡鈁23]，而飽和烴類，如十四烷、2-十三烷酮的氣味溫和不明顯。由此可見(jiàn)，假單胞菌主要導(dǎo)致了腐敗氣味，而隨著枯草芽孢桿菌的加入，風(fēng)味特征開(kāi)始轉(zhuǎn)變?yōu)闇睾偷臍馕?，且效果隨著生物膜形成能力的增強(qiáng)而逐步提高，C6處理組效果尤為顯著。

圖2 枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚(yú)片貯藏期間揮發(fā)性成分的作用主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis（PCA）biplot plot of the effect of Bacillus subtilis on volatile compounds in tilapia fillets during storage

表3 不同枯草芽孢桿菌對(duì)魚(yú)肉保鮮的揮發(fā)性氣味含量（mg/L）Table 3 The volatile odor content of different Bacillus subtilis for fish preservation（mg/L）

2.3 枯草芽孢桿菌生物膜形成能力和抑菌能力對(duì)保鮮能力的影響

由于許多枯草芽孢桿菌菌株都能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，因此將其抑菌能力、成膜能力與保鮮能力進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷枯草芽孢桿菌發(fā)揮保鮮作用的主要途徑。結(jié)果如表4 所示，生物膜形成能力與保鮮能力最為相關(guān)，對(duì)假單胞菌L1 的對(duì)峙抑菌率的相關(guān)性次之，而枯草芽孢桿菌上清液抑菌能力則與保鮮能力呈線性負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明生物膜形成能力是影響枯草芽孢桿菌保鮮能力的關(guān)鍵指標(biāo)。眾多研究表明，成膜能力較強(qiáng)的益生菌占據(jù)定植位點(diǎn)進(jìn)而抑制了病原菌對(duì)宿主的入侵、定植與破壞[24]。本研究說(shuō)明，枯草芽孢桿菌的成膜能力同樣也對(duì)腐敗菌發(fā)揮了類似作用，從而延長(zhǎng)了魚(yú)肉的保鮮期。生物膜形成能力同時(shí)受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響[25]，對(duì)水產(chǎn)品腐敗起到重要的調(diào)控作用[26]。例如，具有群體感應(yīng)抑制效果的香芹酚與常規(guī)抑菌劑魚(yú)精蛋白復(fù)合，其可有效延緩大菱鲆魚(yú)片品質(zhì)的劣變，可起到協(xié)同保鮮作用[27]。研究表明枯草芽孢桿菌具有群體感應(yīng)信號(hào)淬滅的作用，從而減少腐敗菌生物膜的形成[28]。同時(shí)，枯草芽孢桿菌對(duì)假單胞菌對(duì)峙生長(zhǎng)的抑制與發(fā)酵液抑菌的區(qū)別在于對(duì)峙試驗(yàn)同時(shí)反映了對(duì)生物被膜形成的抑制，而發(fā)酵液抑菌更多體現(xiàn)對(duì)菌體的殺滅和生長(zhǎng)破壞作用。因此，枯草芽孢桿菌對(duì)假單胞菌的對(duì)峙生長(zhǎng)抑制能力與保鮮作用也存在較高相關(guān)性，也進(jìn)一步推測(cè)成膜能力高的枯草芽孢桿菌通過(guò)占據(jù)黏附位點(diǎn)、產(chǎn)生更多猝滅信號(hào)等機(jī)制抑制了假單胞菌在魚(yú)片上的滋生。

表4 枯草芽孢桿菌生物膜形成能力、抑菌能力與保鮮能力的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of biofilm formation，bacteriostasis and preservation ability of Bacillus subtilis

2.4 枯草芽孢桿菌生物膜形成能力相關(guān)指標(biāo)

生物膜形成的第一步是細(xì)菌的黏附，細(xì)菌黏附的過(guò)程會(huì)受到范德華力、疏水作用、自凝聚率等菌體表面物理性質(zhì)的影響，從而影響細(xì)菌生物膜的形成。為了能快速篩選得到保鮮用菌，本研究對(duì)枯草芽孢桿菌的疏水能力、自凝聚力、生物膜形成能力和共凝聚力進(jìn)行測(cè)定，并與成膜能力進(jìn)行相關(guān)性分析，找出最顯著相關(guān)的因素。

由表5 可知，枯草芽孢桿菌的自凝聚率與生物膜形成能力最為相關(guān)，可作為篩選枯草芽孢桿菌生物膜形成能力的重要指標(biāo)。同時(shí)，表面疏水性與自凝聚率相關(guān)性極其顯著，研究表面，一般疏水性越強(qiáng)的益生菌，其自凝聚能力越好[29]，而疏水能力越強(qiáng)的細(xì)菌對(duì)宿主黏膜的定植效果也越強(qiáng)[30]，這些物理相互作用在菌株成膜定植的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)論

本研究利用枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚(yú)肉片進(jìn)行保鮮。試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌的生物膜形成能力越強(qiáng)，對(duì)羅非魚(yú)肉的保鮮效果越強(qiáng)。生物膜形成能力強(qiáng)的枯草芽孢桿菌可顯著降低魚(yú)肉中的揮發(fā)性鹽基氮含量，且能顯著抑制魚(yú)肉中醇類、雜環(huán)類、酚類和酸類等揮發(fā)性風(fēng)味成分的產(chǎn)生，保持魚(yú)片良好的水產(chǎn)鮮味。同時(shí)，自凝聚能力與生物膜的相關(guān)性較高，而抑菌能力和保鮮能力沒(méi)有顯著的相關(guān)性?？莶菅挎邨U菌的自凝聚能力和生物膜形成能力是篩選其作為生物保鮮劑的重要指標(biāo)。本研究為枯草芽孢桿菌作為生物保鮮劑提供了新思路。