王昊乾，張靜雯，楊雄洲，劉青軒，姚國(guó)強(qiáng)，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

雙歧桿菌已廣泛應(yīng)用于乳制品、發(fā)酵和制藥等行業(yè)，其作為輔助培養(yǎng)物需在保質(zhì)期內(nèi)保持較高的生物活性[1]。干燥脫水能夠確保產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性，其中真空冷凍干燥是保存雙歧桿菌最為常用的方法[2]。然而，由于雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，對(duì)氧極為敏感，在加工過(guò)程中，氧氣可以通過(guò)多種方式進(jìn)入產(chǎn)品并發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，是導(dǎo)致雙歧桿菌活力喪失的主要因素[3-4]。

目前，有關(guān)乳酸菌在真空冷凍干燥過(guò)程中的研究以優(yōu)化凍干參數(shù)以及開(kāi)發(fā)新型的凍干保護(hù)劑為主要研究方向[5-7]，而氧化應(yīng)激對(duì)乳酸菌在冷凍干燥過(guò)程中的影響鮮有報(bào)道。目前，有研究發(fā)現(xiàn)低溫冷凍伴隨著蛋白變性和脂質(zhì)氧化的產(chǎn)生，并且氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生不受樣品處于玻璃態(tài)時(shí)具有較低的分子遷移率的限制[8]。雙歧桿菌在真空冷凍干燥的預(yù)凍過(guò)程中，極易受到氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化[9-10]，生成丙二醛等氧化產(chǎn)物，并降低細(xì)胞膜流動(dòng)性，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終致雙歧桿菌死亡[11-12]。本試驗(yàn)以乳雙歧桿菌Probio-M8 為研究對(duì)象，以乳清蛋白水解物分離純化的前期試驗(yàn)中獲得的水解多肽3-2（HP3-2）為天然抗氧化型保護(hù)劑，研究其在真空冷凍干燥過(guò)程中對(duì)菌體的保護(hù)作用，為乳酸菌冷凍干燥保藏技術(shù)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳雙歧桿菌Probio-M8，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)微生物種質(zhì)資源庫(kù)提供；Syto9、碘化丙啶（PI）、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、正己烷（色譜純），賽默飛世爾公司；2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFHDA）熒光染料、2'，7'-二-（2-羧乙基）-5（6）-羧基熒光素乙酰甲酯（BCECF-AM）、6-十二?；?N，N-二甲基-2-萘胺（Laurdan），大連美倫生物技術(shù)有限公司；丙二醛試劑盒，南京建成有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M2 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)美谷分子公司；DRC-1000 真空冷凍干燥機(jī)，日本東京理化公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；pH 計(jì)（FE28），梅特勒-托利多儀器上海有限公司；7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），美國(guó)安捷倫公司；平行生物反應(yīng)器，上海顧信生物科技有限公司；M900 生化分析儀，深圳希爾曼科技有限公司；HWS28 型水浴鍋，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng) 將保存于凍存管（-80℃保藏）中的乳雙歧桿菌Probio-M8 于MRS（加入0.05%的L-半胱氨酸鹽酸鹽）培養(yǎng)基中活化，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，然后重復(fù)上述步驟再活化2 代后獲得種子液，以5%的接種量接種于3 L 平行生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)溫度通過(guò)自動(dòng)控制系統(tǒng)保持在（37±0.2）℃，氮?dú)獗海?.02 Pa），轉(zhuǎn)速200 r/min，通過(guò)自動(dòng)流加25%的氨水使pH 值維持在5.9。

1.3.2 菌種的凍干前處理及抗氧化肽的制備 本試驗(yàn)中使用的抗氧化肽HP3-2 為之前試驗(yàn)所獲得的產(chǎn)物，其氨基酸序列為AGPPGPTGPAGP PGFPGAV、GETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAG、GKDGLNGLPGPIGPPGPRG、GPSGPQGPSGPPGPK、TGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGA，分子質(zhì)量在1 500～2 000 u，具體分離純化方法如下：使用堿性蛋白酶于pH 10.0，50 ℃水解乳清蛋白（酶底比為5%），水解2 h 后，滅酶，于4 000×g，離心15 min，將所獲得的乳清蛋白水解物上清液進(jìn)行超濾分離，獲得小于3 ku 的樣品，經(jīng)陽(yáng)離子交換層析以及高效液相色譜分離純化后，將獲得的水解多肽3-2 作為凍干保護(hù)劑，以乳清蛋白作為對(duì)照組。

將發(fā)酵后的乳雙歧桿菌Probio-M8 發(fā)酵液于4 000×g，4 ℃，離心10 min，收集菌體，重懸于滅菌后的PBS（pH 7.4）中，清洗2 次后，將菌體和保護(hù)劑按照1∶1.5 的質(zhì)量比相混合，以保護(hù)劑中只加入10%海藻糖作為空白對(duì)照組，含有不同濃度的HP3-2 作為試驗(yàn)組，含有5.0 mg/mL 乳清蛋白作為對(duì)照組（表1）。真空凍干過(guò)程：于-80 ℃預(yù)凍6 h后，進(jìn)行真空冷凍干燥，真空冷凍干燥條件：真空度15 Pa，樣品溫度由-40 ℃升溫至30 ℃，冷阱溫度保持在-45 ℃，工作時(shí)間為36 h。

表1 不同組分的保護(hù)劑組成及含量Table 1 The composition of the different components of lyoprotectant

1.3.3 活菌數(shù)測(cè)定 真空冷凍干燥后樣品的細(xì)胞存活率測(cè)定按照王淑敏等[13]描述的方法并適當(dāng)修改。取1 g 凍干樣品，與9 mL 的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）混勻，于搖床振蕩20 min 后進(jìn)行梯度稀釋，傾注于MRS 固體培養(yǎng)基中（加入0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽），于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。

1.3.4 細(xì)胞膜脂肪酸的提取與測(cè)定 根據(jù)Wei等[14]描述的方法并稍作修改；將凍干后的菌體復(fù)溶于PBS 緩沖液中，于4 000×g，15 min 離心，洗滌2 次后，稱取0.5 g 菌體，加入1.9 mL 氯仿-甲醇（1∶2，V/V）混合溶液，振蕩15 min，再加入0.625 mL的氯仿以及0.625 mL 去離子水，旋渦振蕩15 min，于4 000 r/min，15 min 離心，吸取下層有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈?；加? mL 甲醇鈉-甲醇溶液，放于冰中1 min，振蕩5 min，再加入600 μL 正己烷萃取脂肪酸，振蕩5 min，于4 000×g，5 min 離心，取上層相，置于GC-MS 上樣瓶中，通過(guò)GC-MS分析。

脂肪酸含量測(cè)定采用GC/MS 法。色譜柱：HP-5 毛細(xì)管填充柱（30 m×0.22 mm 柱內(nèi)徑，0.25 μm膜厚，Restek）；載氣（He）流速29.6 mL/min；總流量1 mL/min；柱壓63.4 kPa；進(jìn)樣口溫度260 ℃；檢測(cè)器溫度280 ℃；色譜柱溫升溫程序：起始溫度100℃，保持1 min，隨后以4 ℃/min 速率增至250 ℃，并在250 ℃保持5 min，進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度200 ℃；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍35～500 m/z。計(jì)算脂肪酸各峰的峰面積、保留時(shí)間，結(jié)果與37 種脂肪酸標(biāo)樣進(jìn)行對(duì)比。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧測(cè)定 使用DCFH-DA 分析檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和積累[15]。將菌體用PBS緩沖液清洗2 次，4 000×g，離心5 min，然后重新懸浮在PBS 緩沖液中，加入DCFH-DA 至終濃度為10 μmol/L，37 ℃避光孵 育50 min，以未用DCFH-DA 處理的細(xì)胞作為對(duì)照，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)）。

1.3.6 胞內(nèi)外pH 測(cè)定 將菌體復(fù)溶于無(wú)菌蒸餾水中，使用pH 計(jì)測(cè)定細(xì)胞外pH 值。

使用BECEF-DA 分析檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH 變化情況[16]。將菌體用PBS 緩沖液清洗2 次，4 000×g，離心5 min，然后重新懸浮在PBS 緩沖液中，加入BECEF-DA 至終濃度為1 μmol/L，37 ℃避光孵育30 min，以未用BECEF-DA 處理的細(xì)胞作為對(duì)照，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)）。

將菌體 懸浮在pH 值 為6.2，6.5，6.8，7.2 的PBS 緩沖液中，加入終濃度為1 μmol/L 的尼日利亞菌素和BECEF-DA，37 ℃避光孵育30 min，構(gòu)建胞內(nèi)pH 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)定 使用Li 等[17]描述的方法對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性進(jìn)行測(cè)定。將凍干菌粉復(fù)溶后，用PBS 緩沖液清洗菌體2 次，4 000×g 離心5 min，重懸在PBS 緩沖液中，加入Laurdan 至終濃度為10 μmol/L，30 ℃避光孵育30 min，以未用熒光染料處理的細(xì)胞作為對(duì)照，測(cè)定熒光強(qiáng)度，廣義熒光偏振（GP）測(cè)定樣品的細(xì)胞膜流動(dòng)性。

式中，I440nm——在440 nm 波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度；I490nm——在490 nm 波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度。

1.3.8 細(xì)胞外Na+濃度測(cè)定 將凍干后的乳雙歧桿菌Probio-M8 復(fù)溶于PBS 緩沖液中，并與16 g/L 的氯化鈉溶液按等體積比混合，在4 000×g，4 ℃離心5 min，取上清液于1.5 mL 的EP 管中，使用生化分析儀進(jìn)行測(cè)定，樣品溶液上機(jī)測(cè)試得到的結(jié)果×2 即為樣品中實(shí)際的Na+離子濃度。

1.3.9 細(xì)胞膜電位測(cè)定 使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)真空冷凍干燥后的乳雙歧桿菌Probio-M8 的細(xì)胞膜電位進(jìn)行測(cè)定，將真空冷凍干燥后的菌粉復(fù)溶于PBS 緩沖液中，旋渦振蕩混勻后，4 000×g，4 ℃離心5 min，使用PBS 清洗2 次后，重懸，再用PBS連續(xù)稀釋，使樣品的活菌數(shù)在1×106CFU/mL 左右，加入DiBAC4（3）熒光染料，樣品中的最終濃度為1 μmol/L，于37 ℃避光孵育30 min 后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度[18]。

膜電位標(biāo)準(zhǔn)曲線：將凍干后的樣品復(fù)溶于不同濃度的鉀離子溶液（140，70，35，14，7，3.5 mmol/L）中，并加入終濃度為1 μmol/L 的纈氨霉素和尼日利亞菌素，并加入2 μmol/L 的DiBAC4（3）熒光染料，于37 ℃避光孵育30 min，上機(jī)測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；另外，2%預(yù)冷甲醛于4 ℃固定菌體60 min 后，作為去極化樣品，剩余的熒光染色步驟與樣品相同。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)每組3 個(gè)平行，使用GraphPad Prism 9.0 和Origin 2021 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P〈0.05 為顯著，同時(shí)完成相關(guān)圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干后活菌數(shù)

雙歧桿菌作為革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，由于自身缺乏過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等氧化還原酶，在有氧條件下極容易受到ROS 的攻擊，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子造成不可逆的損傷，對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)代謝造成影響[19-20]。經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥后乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌種存活率如圖1 所示，隨著HP3-2 質(zhì)量濃度的升高，乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌種存活率呈顯著上升趨勢(shì)（P〈0.05），含有5 mg/mL 的HP3-2 試驗(yàn)組菌種存活率為（80.40±3.34）%，顯著高于WP 組（64.69±2.47）%和T 組（72.65±1.98）%（P〈0.05）。結(jié)果說(shuō)明，高溫滅菌后的WP 會(huì)降低乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌種存活率，含有抗氧化活性的HP3-2 試驗(yàn)組（5 mg/mL）能夠在真空冷凍干燥過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞起到更好的保護(hù)作用，并提高菌體的凍干存活率。已有研究表明，乳清蛋白水解物中含有較多疏水性氨基酸的多肽，能夠與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)相結(jié)合，通過(guò)清除氧自由基，抑制細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化，達(dá)到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用[21-23]。

圖1 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干存活率變化Fig.1 Change in the survival rate of Probio-M8 after freeze-drying

2.2 細(xì)胞內(nèi)外pH 變化

pH 變化是評(píng)估應(yīng)激反應(yīng)的重要參數(shù)[24]。乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后細(xì)胞外pH 如圖2a 所示，含有5.0 mg/mL 的HP3-2 試驗(yàn)組 的pH 值（4.99±0.00）最低，顯著低于WP 組（5.14±0.00）和T 組（5.24±0.00），P〈0.05；使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)乳雙歧桿菌Probio-M8 的胞內(nèi)pH 值進(jìn)行測(cè)定（圖2b），含有2.5 mg/mL 和5.0 mg/mL 的HP3-2 試驗(yàn)組胞內(nèi)pH 值（5.82±0.06 和5.89±0.03）顯著高于WP 組（5.74±0.01）和T 組（5.50±0.01），P〈0.05；含有不同質(zhì)量濃度HP3-2 的細(xì)胞內(nèi)、外pH 差值顯著高于WP 組和T 組（表2）。為了維持胞內(nèi)蛋白酶的活力，細(xì)胞內(nèi)pH 一般呈中性，而細(xì)胞在真空冷凍干燥過(guò)程中不斷脫水，并伴隨胞內(nèi)溶質(zhì)的濃縮，使胞內(nèi)pH 值下降，同時(shí)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞受損；當(dāng)細(xì)胞復(fù)水后，不含有抗氧化活性的WP 組和T 組中，由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)流出，從而使細(xì)胞膜質(zhì)子梯度遭到破壞，使細(xì)胞內(nèi)pH 與環(huán)境pH 更為接近，而含有抗氧化肽HP3-2 的試驗(yàn)組能夠通過(guò)降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞膜的損傷，防止細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏并維持細(xì)胞膜質(zhì)子梯度，達(dá)到對(duì)乳雙歧桿菌Probio-M8 的保護(hù)作用。已有研究表明，具有完整的細(xì)胞膜能結(jié)構(gòu)是維持細(xì)胞質(zhì)子梯度的關(guān)鍵因素[25]，另外，氧化應(yīng)激的產(chǎn)生與pH 的變化密切相關(guān)[26]。

圖2 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后細(xì)胞外pH（a）和細(xì)胞內(nèi)pH（b）變化Fig.2 Extracellular（a）and intracellular（b）pH changes of Probio-M8 after freeze-drying

表2 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后細(xì)胞內(nèi)、外pH 差值Table 2 Change in pH difference between inside and outside cells after freeze-drying of Probio-M8

2.3 脂肪酸含量及細(xì)胞膜流動(dòng)性變化

細(xì)菌的脂肪酸一般由含有12～22 個(gè)碳的飽和脂肪酸（SFA）及不飽和脂肪酸（UFA）組成，其中以含有16～18 個(gè)碳的脂肪酸占總脂肪酸的60%以上[27]。真空冷凍干燥后，乳雙歧桿菌Probio-M8 的細(xì)胞膜脂肪酸主要由肉豆蔻酸（C14∶0）、十五烷酸（C15∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚烯酸（C16∶1）、十七烷酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1n9c）、亞麻酸（C18 ∶2n6t）、花生酸（C20 ∶0）和γ-亞麻酸（C18∶3n6）10 個(gè)脂肪酸組成（表3），其中油酸、棕櫚烯酸和亞麻酸為不飽和脂肪酸（UFA）。含有5.0 mg/mL HP3-2 試驗(yàn)組的相對(duì)UFA 含量（51.49±1.26）顯著高于WP 組（39.96±1.57）和T 組（33.33±0.62），P〈0.05。結(jié)果表明，抗氧化肽HP3-2 能夠降低氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞膜損傷，使細(xì)胞膜維持較高的不飽和脂肪酸含量，并且HP3-2 對(duì)細(xì)胞膜具有更好的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，Niranjan 等[28]發(fā)現(xiàn)肽的N 端為疏水性氨基酸時(shí)，能夠與生物膜中脂肪酸相互作用，通過(guò)捕捉自由基減少鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生；另外，乳酸菌細(xì)胞膜中含有較高不飽和脂肪酸比例，能夠在冷凍干燥過(guò)程中維持較高細(xì)胞膜完整性，減少細(xì)胞損傷[29]；Zhang 等[30]研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽能夠在真空冷凍干燥過(guò)程中保護(hù)舊金山乳桿菌中不飽和脂肪酸，并提高菌體的凍干存活率。

表3 真空冷凍干燥后乳雙歧桿菌Probio-M8 細(xì)胞膜脂肪酸組成（%）Table 3 Fatty acid composition of the cell membrane for Probio-M8 after freeze-drying（%）

流動(dòng)性是細(xì)胞膜的重要特性之一，主要取決于溫度和細(xì)胞膜脂肪酸組成[31]；細(xì)胞膜流動(dòng)性有助于細(xì)胞感知外界環(huán)境的變化（溫度、pH 和滲透壓等），使細(xì)胞通過(guò)基因的表達(dá)，適應(yīng)外界環(huán)境的改變[32]。真空冷凍干燥后，乳雙歧桿菌Probio-M8的細(xì)胞膜流動(dòng)性如圖3 所示，圖中縱坐標(biāo)廣義熒光偏振所測(cè)得的結(jié)果（GP 值）與細(xì)胞膜流動(dòng)性成反比。隨著HP3-2 濃度的升高，含有HP3-2 樣品的GP 值呈下降趨勢(shì)，并且含有5.0 mg/mL HP3-2試驗(yàn)組的GP 值（0.086±0.002）顯著低于WP 組（0.092±0.002）和T 組（0.092±0.001），P〈0.05。結(jié)果表明，抗氧化肽HP3-2 能夠在真空冷凍干燥過(guò)程中降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的損傷，使細(xì)胞膜中具有較高的不飽和脂肪酸含量，并維持較高的細(xì)胞膜流動(dòng)性，從而達(dá)到對(duì)乳雙歧桿菌Probio-M8的保護(hù)作用。Marielle 等[33]發(fā)現(xiàn)增加細(xì)胞膜脂肪酸中UFA/SFA 的比例，能夠提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性；另外，在干燥和貯藏過(guò)程中，氧化反應(yīng)會(huì)損傷細(xì)胞膜的物理結(jié)構(gòu)并改變脂質(zhì)組成，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性降低并影響細(xì)胞功能[34]。Li 等[17]發(fā)現(xiàn)提高細(xì)胞膜流動(dòng)性和細(xì)胞膜完整性，能夠提高乳酸菌在真空冷凍干燥過(guò)程中的菌種存活率。

圖3 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后細(xì)胞膜流動(dòng)性Fig.3 Cell membrane fluidity of Probio-M8 after freeze-drying

2.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧及丙二醛含量

活性氧在細(xì)胞代謝以及應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中具有重要意義[35]。氧敏感的乳酸菌在干燥及貯藏過(guò)程中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)、DNA 和脂質(zhì)發(fā)生不可逆的損傷，是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因[36]。氧化應(yīng)激與褐變反應(yīng)在冷凍干燥與貯藏期間使細(xì)胞發(fā)生蛋白羰基化和脂質(zhì)氧化[37]，其中，脂質(zhì)過(guò)氧化物和氫過(guò)氧化物加速分解生成醇、醛等多種氧化產(chǎn)物，其中，丙二醛是最為常見(jiàn)的氧化產(chǎn)物[38]。使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量進(jìn)測(cè)定（圖4），試驗(yàn)組和對(duì)照組中胞內(nèi)活性氧的熒光強(qiáng)度分別為T 組/WP 組〉2.5 mg/mL 的HP3-2 組〉5 mg/mL 的HP3-2 組，并且HP3-2 試驗(yàn)組中胞內(nèi)活性氧的熒光強(qiáng)度隨著HP3-2 濃度的升高而降低；使用丙二醛檢測(cè)試劑盒對(duì)真空冷凍干燥過(guò)程中乳雙歧桿菌Probio-M8 受到氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物丙二醛含量進(jìn)行測(cè)定（圖5）2.5 mg/mL 和5 mg/mL 的HP3-2 試驗(yàn)組丙二醛含量分別為（2.23±0.06）nmol/mL 和（2.14±0.06）nmol/mL，丙二醛濃度隨著HP3-2 濃度的升高而降低，另外，5 mg/mL 的HP3-2 試驗(yàn)組的丙二醛含量顯著低于WP 組（2.30±0.05）nmol/mL 和T 組（2.33±0.05）nmol/mL，P〈0.05。結(jié)果表明，抗氧化肽HP3-2 在真空冷凍干燥過(guò)程中，能夠降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量，防止氧自由基對(duì)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的氧化，降低氧化產(chǎn)物丙二醛的含量。已有研究表明，脂質(zhì)氧化是細(xì)胞脫水過(guò)程中氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要因素[39]；抗氧化肽能夠提供還原氫或給自由基一個(gè)配對(duì)的電子，使活性氧失去氧化活性[40]，因此，由于抗氧化肽HP3-2 含有甘氨酸和脯氨酸等疏水性氨基酸，能夠通過(guò)捕獲活性氧分子降低細(xì)胞膜脂肪酸氧化，并減少丙二醛含量，提高乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌種存活率。

圖4 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后胞內(nèi)活性氧含量變化Fig.4 Changes in intracellular reactive oxygen species content of Probio-M8 after freeze-drying

圖5 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后丙二醛含量變化Fig.5 Changes in malondialdehyde content of Probio-M8 after freeze-drying

2.5 細(xì)胞膜電位及Na+濃度變化

細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞膜具有100 mV 的跨膜電位，并且細(xì)胞膜內(nèi)、外Na+離子濃度處于“外高內(nèi)低”的狀態(tài)[41]；當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境刺激后，通過(guò)控制離子通道改變細(xì)胞膜內(nèi)、外的Na+濃度梯度，使細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞正常的生理代謝過(guò)程[42]。乳雙歧桿菌Probio-M8 經(jīng)真空冷凍干燥復(fù)水后，細(xì)胞胞外Na+濃度變化如圖6a 所示，添加2.5 mg/mL 和5 mg/mL 的HP3-2 試驗(yàn)組中，胞外Na+濃度為（5.67±0.64）mmol/L 和（62.45±0.49）mmol/L，顯著高于WP 組（52.01±0.54）mmol/L 和T 組（51.70±0.43）mmol/L，P〈0.05；使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳雙歧桿菌Probio-M8 的細(xì)胞膜電位變化（圖6b），含有2.5 mg/mL 和5 mg/mL的HP3-2 試驗(yàn)組中細(xì)胞膜電位為（-10.95±0.75）mV 和（-13.10±0.86）mV，顯著低于WP 組（-9.93±0.50）mV 和T 組（-9.35±1.23）mV，P〈0.05。結(jié)果說(shuō)明，真空冷凍干燥過(guò)程會(huì)造成乳雙歧桿菌Probio-M8 細(xì)胞損傷，使細(xì)胞外Na+濃度和細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，抗氧化肽HP3-2 能夠保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，降低氧化應(yīng)激對(duì)Na+濃度和細(xì)胞膜電位的影響，維持細(xì)胞正常的生理代謝。

圖6 Na+濃度（a）和細(xì)胞膜電位（b）變化Fig.6 Changes in Na+ ion concentration（a）and cell embrane potential（b）

3 結(jié)論

真空冷凍干燥過(guò)程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)雙歧桿菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及生物活性產(chǎn)生影響，抗氧化肽HP3-2 中主要含有較多的疏水性氨基酸，能夠與細(xì)胞膜中的脂質(zhì)相結(jié)合，通過(guò)清除氧自由基，降低氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，使細(xì)胞膜具有較高的不飽和脂肪酸含量和細(xì)胞膜流動(dòng)性，維持細(xì)胞膜完整，并使細(xì)胞膜內(nèi)、外的質(zhì)子梯度、細(xì)胞膜電位和Na+濃度保持平衡，在真空冷凍干燥過(guò)程中起到對(duì)乳雙歧桿菌Probio-M8 的保護(hù)作用；通過(guò)本研究結(jié)果，能夠?yàn)樘烊豢寡趸捅Ｗo(hù)劑的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為雙歧桿菌發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。