◎ 徐子雯，陳舒悅，羅怡婕，周鈺雯，張慧恩

（浙江萬里學(xué)院，浙江 寧波 315100）

酒是人類生活中重要的飲品之一。中國酒文化歷史悠久，博大精深，早在幾千年前，中國人就創(chuàng)造出獨特的酒曲復(fù)式發(fā)酵法并用于大量釀造黃酒。如今，酒對于中國人來說，已不僅僅是食物，更是一種融合物質(zhì)生產(chǎn)和精神創(chuàng)作的飲食文化[1-3]。

現(xiàn)代酒類產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，酒類的產(chǎn)量銷量與市場規(guī)模不斷擴大。目前，市場上受歡迎的酒類主要有白酒、啤酒、果酒。在果酒領(lǐng)域內(nèi)，藍莓酒雖屬小眾品類，但也擁有悠久的釀造歷史，早在明代就有了藍莓酒可美容養(yǎng)顏、抵御濕寒、活血化瘀、強身健體等功效的文獻記錄。因此，自古以來，藍莓酒就被認為具有美容的神奇功效，并一直流傳至今?，F(xiàn)代科學(xué)已經(jīng)確定，經(jīng)過發(fā)酵后的藍莓酒可以刺激更多活性成分的產(chǎn)生，藍莓酒不僅味道比藍莓和藍莓汁更吸引人，而且其含有的花青素和其他營養(yǎng)物質(zhì)更易被身體吸收。相較于其他的酒類，飲用藍莓酒更有利于身體健康。在歐洲，藍莓酒被譽為“給人類壽命帶來第三次飛躍”的神奇之物。不同于在歐洲的知名度，藍莓酒在中國是個鮮為人知的小眾酒類，遠不如葡萄酒的市場知名度。由于最近幾年酒類市場迎來消費升級轉(zhuǎn)型，使得市場更偏年輕化，更易接受新奇酒類，消費者更加注重酒類風(fēng)味多樣化、低酒精度數(shù)及健康飲酒，藍莓酒因此打開了中國市場[4]。

當前，頂空固相微萃取-氣質(zhì)譜聯(lián)用（HSSPME-GC/MS）技術(shù)已應(yīng)用于各種類型酒樣（如葡萄酒、紅酒和白酒等）中揮發(fā)性香氣成分的分析[5]。此外，主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLSDA），都是利用原始數(shù)據(jù)呈現(xiàn)組間及組內(nèi)差異的可視化技術(shù)，可從不同維度反映不同樣本間的代謝組成的差異[6]。

雖然近幾年酒類風(fēng)味物質(zhì)的研究受到學(xué)者的高度關(guān)注，但是相較于其他酒類，藍莓酒的相關(guān)研究還比較少。盡管近幾年藍莓酒越來越受到消費者的青睞，但是少有聚焦于藍莓酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和藍莓酒的主要香氣特征的研究。基于此，本文利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)合代謝組學(xué)對不同酵母發(fā)酵藍莓酒風(fēng)味物質(zhì)的影響進行研究，旨在全面了解和認識不同酵母對于藍莓酒風(fēng)味物質(zhì)的基礎(chǔ)差異，從而選擇最適合釀造藍莓酒的釀酒酵母，為以后有關(guān)藍莓酒香氣物質(zhì)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀8890-5977B（安捷倫公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相萃取頭及萃取手柄（美國 Supelco公司）；電子天平B124S（賽多利斯有限公司）；磁力加熱攪拌器RT2（賽默飛公司）。

1.2 材料與試劑

藍莓：購于奉化藍莓基地，充分成熟，采摘后立即于-18 ℃保存；酵母AU、DE、RA購自煙臺帝伯仕自釀機有限公司；氯化鈉（分析純）購于國藥集團。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓酒的發(fā)酵工藝流程

基本工藝流程：藍莓果→挑選→解凍→打漿→調(diào)整成分（添加偏重亞硫酸鉀、蔗糖、碳酸鈣）→接種酵母→裝罐→主發(fā)酵→倒罐→陳釀→成品酒。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

萃取條件：取5.0 mL藍莓酒樣，加入20.0 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl，在水浴鍋中50 ℃平衡10 min，將SPME手動進樣柄（萃取頭型號：50/30 μm PD-MS/DVB/CAR）插入進樣瓶中，50 ℃萃取30 min，取出萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，解析5 min后取出[7-8]。

GC 條件：HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），不分流進樣，柱溫采用程序升溫，50 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至90 ℃保持1 min，再以1 ℃/min升至100 ℃保持3 min，再以2 ℃/min升至120 ℃保持1 min，最后以6 ℃/min升至250 ℃。進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min[9-10]。

MS 條件：電離方式 EI，電離電壓 70 eV，離子源和四極桿的溫度分別為230 ℃和150 ℃燈絲電流 0.25 mA，電子倍增器電壓為1 500 V，掃描范圍40～550 m/z[11]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

①定性分析。通過檢索與NIST17標準譜庫進行比對，選擇匹配度≥70%的物質(zhì)為有效物質(zhì)。②定量分析。采用峰面積歸一法計算。③主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA），由MetaboAnalyst網(wǎng)站進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母藍莓酒風(fēng)味物質(zhì)分析

（1）利用GC-MS對3組不同酵母發(fā)酵的藍莓酒中的風(fēng)味物質(zhì)進行采集和數(shù)據(jù)分析。經(jīng)NIST 17.0數(shù)據(jù)庫檢索后，共鑒定出76個化合物（見表1）。按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)可分為5類，包括有機酸類、酯類、醇類、萜烯類、酚類。其中，醇類26種，酯類15種，酸類15種，萜烯類13種，酚類7種。3種酒中醇類和酸類物質(zhì)占比最多，其次是酯類。醇類物質(zhì)是果酒香氣的主要成分，醇類物質(zhì)能夠促進酯類物質(zhì)香氣成分的散發(fā)，使酒體更加飽滿[12-13]。

（2）3 種酒樣含量較高的主要香氣成分為異戊醇、苯乙醇、異丁醇、芳樟醇、α-松油醇。異戊醇具有酒精味和特殊的指甲油的味道[14]；芳樟醇和苯乙醇具有玫瑰花香[15]。RA酵母釀造藍莓酒中醇類占比最高，對感官風(fēng)味影響較大；DE釀造的藍莓酒醇類物質(zhì)含量最低，這是由于釀酒所用酵母不同導(dǎo)致的。

（3）酯類是賦予果酒豐富果香、花香的物質(zhì)，與果酒整體風(fēng)味的呈現(xiàn)具有重要關(guān)系。藍莓酒中主要酯類物質(zhì)有丁二酸二乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯等，這些酯類物質(zhì)增加了酒體的果香與花香。結(jié)果顯示，AU酵母釀造藍莓酒中酯類占比最高，其次是DE。

（4）藍莓酒中含有較多的有機酸，主要來自藍莓鮮果。有機酸能夠影響藍莓酒的酸甜比，對酒的口感具有較大影響。當酸類含量過高時，會大大降低果酒的香味，口感舒適度降低；當酸類含量較低時，能夠帶來清爽的口感，增加酒體的復(fù)雜性。相比較DE釀造的藍莓酒有機酸含量最低，AU釀造的藍莓酒有機酸含量有所增加。

2.2 藍莓酒風(fēng)味物質(zhì)PCA和PLS-DA分析

（1）PCA分析是無監(jiān)督的，即PCA分析并不考慮樣品的分組信息。PCA的目標是選擇幾個相互獨立的因子代表所有代謝物，這些因子保留了關(guān)于原始代謝物變異的最大信息量。對此，本研究選擇保留最多信息的2個因子，并構(gòu)建一個散點圖，顯示一組代謝物的樣本之間的結(jié)構(gòu)差異[16]。

（2）進行PCA主成分分析利用之前提取到的化合物，了解三組藍莓酒之間的總體化合物表型差異。結(jié)果表明，3種不同酵母的藍莓酒前2個主成分PC1和PC2的累計方差貢獻率達69.7%（如圖1），這說明主成分很好地概括了樣品的原始數(shù)據(jù)信息。其中，PC1占48.5%，PC2占21.2%。PCA模型包含4個主成分，擬合參數(shù)為R2X=0.924、Q2=0.860，圖中3組樣品明顯分布在不同區(qū)域，區(qū)分顯著，說明3種藍莓酒的風(fēng)味物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)差異。

圖1 PCA主成分分析得分圖

（3）除了無監(jiān)督模式的主成分分析PCA以外，本試驗還使用Metaboanalyst對所有樣本建立偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。判別最小二乘分析是受控的，即分析時需要聚類信息，PLS-DA可用于尋找樣本組間最大可能差異的因子。判別分析將要預(yù)測的連續(xù)分類變量編碼為潛變量，在解釋變量和潛變量之間建立回歸，并使用最小二乘回歸理論求解。PLS-DA通過將預(yù)測變量和觀測變量分別投射到一個新的空間來尋找線性回歸模型，這表明PLS-DA模型的判別能力更強[17]。其中，變量重要性因子（VIP）可以量化每個變量對分類的貢獻。當 VIP 值>1 時，對應(yīng)變量可定義為判別模型的關(guān)鍵變量，VIP值越大，對模型的重要性越大[18]。

PLS-DA的得分圖（見圖2）表明3組藍莓酒有明顯的分離，PC1和PC2分別解釋了總方差的46.3%和23.0%，3組藍莓酒的點云分布在不同的區(qū)域，PLSDA 模型包含2個主成分，擬合參數(shù)為R2X=0.825、Q2=0.629。R2X越接近1表明模型越穩(wěn)定，Q2>0.5 表明預(yù)測率較高[19]。

圖2 PLS-DA分析得分圖

根據(jù) VIP 值（VIP>1）和P值（P<0.05）篩選出關(guān)鍵揮發(fā)性成分，結(jié)果顯示共篩選出15種差異揮發(fā)性物質(zhì)（見圖3）。其中，有機酸4種，酯類2種，醇類3種，萜烯類4種，酚類2種。分別為己酸、辛酸、壬酸、3-氨基丁酸、乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、薄荷醇、芳樟醇、α-松油醇、4-萜品醇、2,4-二叔丁基酚、3,5-二叔丁基苯酚。

圖3VIP圖

2.3 藍莓酒的感官評價

感官品評是評價食品感官質(zhì)量最有效、最直觀的方法，特別是在酒類食品中，感官評價是任何先進儀器無法替代的[20]。本次試驗將綜合10名受過訓(xùn)練的食品專業(yè)學(xué)生的得分求取平均值，盡量減小試驗誤差。由表2可知，藍莓酒外觀澄清透明，呈寶石紅色。其中，AU藍莓酒顏色為悅?cè)松钭蠈毷t色，果香濃郁，平衡性好；DE藍莓酒果香濃郁但顏色較淺；RA藍莓酒顏色悅?cè)说珔f(xié)調(diào)性略顯薄弱。綜合相關(guān)評語和得分可以看出，AU藍莓酒從色澤、香氣、口感和典型性方面表現(xiàn)突出、果香濃郁、協(xié)調(diào)性好、品質(zhì)最佳。感官評價得分如2.2所述，本研究根據(jù) VIP 值（VIP>1）和P值（P<0.05）篩選出關(guān)鍵揮發(fā)性成分存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，其中，α-松油醇VIP值最大，在AU藍莓酒中含量最高，可能是影響感官評價得分的關(guān)鍵物質(zhì)。

表2 不同酵母藍莓酒感官評價表

3 結(jié)論

本研究采用3種不同酵母釀造的藍莓酒，通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術(shù)共鑒定揮發(fā)性化合物76種，經(jīng)數(shù)據(jù)處理歸納總結(jié)后可以發(fā)現(xiàn)，有3種不同酵母的藍莓酒間有41種相同的化合物，說明3種藍莓酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在種類上具有一定的差異性。在此基礎(chǔ)上，本研究利用PCA和PLSD-DA對風(fēng)味物質(zhì)進行分析，均能驗證3組藍莓酒存在整體差異，能夠被完全區(qū)分開來，并找出15種差異風(fēng)味物質(zhì)，其中，α-松油醇VIP值最大。從感官評價來看，AU藍莓酒得分最高，RA藍莓酒得分最低，原因在于AU藍莓酒中α-松油醇含量最高，可能對風(fēng)味起著較為顯著的作用。綜上所述，AU酵母比其余2種酵母更適合用于釀造藍莓酒。