◎ 李堂駿，王 斌,3，時(shí)雨晴，劉振興，姜啟興,3，楊 遠(yuǎn)

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3. 江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122；4. 中農(nóng)一號(hào)新沂食品有限公司，江蘇 徐州 221400）

板栗（Castanea mollissima）果實(shí)富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及礦物質(zhì)[1-2]。當(dāng)前，諸多研究對(duì)多菌種發(fā)酵的板栗醋、板栗酸乳發(fā)酵工藝及品質(zhì)進(jìn)行了分析和優(yōu)化[3-4]。例如，胡美怡等對(duì)板栗黃酒發(fā)酵工藝進(jìn)行研究[5]，發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒較小且較為均勻，有利于糖化的進(jìn)行[6-9]。糯米酒是通過在底料中添加酒曲，將糯米中的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖并發(fā)酵為酒精，同時(shí)，將其中的多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低聚糖、小分子有機(jī)酸、氨基酸及肽類物質(zhì)等對(duì)人體有益物質(zhì)的發(fā)酵酒[10-11]?；诖?，本文以板栗糯米為主要原料，研究了米曲霉（Aspergillus oryzae）對(duì)板栗糯米糖化的影響，以還原糖含量、總酸含量、可溶性固形物含量為依據(jù)，對(duì)糖化發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定板栗糯米酒的最佳糖化發(fā)酵工藝條件，旨在為板栗糯米酒開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

（1）材料：新鮮板栗（遷西縣金地食品甘栗有限公司）；長(zhǎng)糯米（燕之坊五谷雜糧）；生麥芽（上元堂大藥房）；米曲霉（山東和眾康源生物科技有限公司）。

（2）試劑：氫氧化鈉、硫酸銅、亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙醇等化學(xué)試劑均為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

GHP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；FEP實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多公司）；LE204E電子天平（梅特勒-托利多公司）；DK-8AXX電熱恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；VD-650桌上式潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；WAY-2W阿貝折射儀（儀電物光儀器有限公司）；MY-CD5026P電壓力鍋（廣東美的生活電器制造有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.3.2 糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)

以米曲霉添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、糖化溫度（28、30、32、34 ℃和36 ℃）、糖化時(shí)間（12 、24、36、48、60、72 h和84 h）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，以米曲霉添加量、糖化溫度、糖化時(shí)間的最佳條件相鄰兩水平為試驗(yàn)水平，進(jìn)行糖化發(fā)酵的三因素三水平正交試驗(yàn)。

1.4 分析方法

還原糖含量測(cè)定參照GB 5009.7—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測(cè)定》中的第一法直接滴定法?？扇苄怨绦挝锖繀⒄誈B/T 12143—2008 《飲料通用分析方法》中的折光計(jì)法進(jìn)行測(cè)定。酸度測(cè)定參照GB 5009.239—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》中的第二法pH計(jì)法，以乳酸計(jì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0 的單因素方差分析和LSD 后特設(shè)測(cè)試（最小顯著差異）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Excel、Origin進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉糖化發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 米曲霉添加量對(duì)板栗糯米糖化發(fā)酵的影響

分析表明，米曲霉添加量對(duì)糖化酶的產(chǎn)量以及糖化效果，都有一定的影響[12]。其中，發(fā)酵液中還原糖和可溶性固形物含量隨米曲霉添加量的增加而增加。當(dāng)米曲霉添加量低于0.4%時(shí)，還原糖含量增加較為緩慢；當(dāng)米曲霉添加量達(dá)到0.5%時(shí)，還原糖含量最高達(dá)到8.3 g/100 g，可溶性固形物含量最高（如圖2A和2B）；總酸含量隨米曲霉添加量的增加而增加。當(dāng)米曲霉添加量在0.1%～0.4%時(shí)，總酸含量變化較為平緩；米曲霉添加量達(dá)到0.5%時(shí)，發(fā)酵液中總酸達(dá)到2.4 g/100 g（如圖2C），然而，發(fā)酵液總酸過高，可溶性固形物含量也會(huì)較高，導(dǎo)致發(fā)酵體系失衡[13-14]。結(jié)合發(fā)酵液的總酸及可溶性固形物含量，取米曲霉的最適添加量為0.4%。

圖2 米曲霉添加量對(duì)糖化發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖、可溶性固形物和總酸含量的影響圖

2.1.2 米曲霉發(fā)酵溫度對(duì)板栗糯米糖化發(fā)酵的影響

分析表明，發(fā)酵的溫度會(huì)影響米曲霉的生長(zhǎng)繁殖及糖化酶的活性。溫度過低，米曲霉繁殖緩慢，產(chǎn)生的糖化酶量較少，延長(zhǎng)糖化發(fā)酵時(shí)間；溫度過高容易導(dǎo)致米曲霉死亡，糖化酶鈍化、失活[15]。發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，發(fā)酵液的還原糖含量最高；當(dāng)溫度高于34 ℃時(shí)其含量下降較顯著（如圖3A）。隨著發(fā)酵溫度的提高，可溶性固形物含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，含量達(dá)到最高值12%；發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)，含量最低為10%（如圖3B）。米曲霉的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，繁殖量最多，無(wú)氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸含量較多。32 ℃條件下，糖化酶較多，原料中的淀粉轉(zhuǎn)換為還原糖。隨著溫度的升高，環(huán)境條件不適宜米曲霉的生長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)生的酸含量隨之降低（如圖3C）。綜合還原糖、可溶性固形物及總酸含量考慮，選取最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖3 米曲霉發(fā)酵溫度對(duì)糖化發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖、可溶性固形物和總酸含量的影響圖

2.1.3 米曲霉發(fā)酵時(shí)間對(duì)板栗糯米糖化的影響

發(fā)酵初期，米曲霉繁殖，產(chǎn)生液化酶、糖化酶等酶系，使原料中的淀粉分解為還原糖，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生的還原糖會(huì)因米曲霉的無(wú)氧呼吸作用生成酒精、有機(jī)酸等，還原糖含量增加緩慢甚至下降。當(dāng)米曲霉含量為0.4%時(shí)，48 h內(nèi)還原糖含量顯著增加，48 h后變化平緩（如圖4A）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中總酸含量逐漸增加；48 h后，發(fā)酵液中總酸含量增加速度較快，60 h后增加速率變緩，達(dá)到1.4 g/100 g（如圖4B）。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液中可溶性固形物含量逐漸增加。48 h時(shí)，含量達(dá)到16%，發(fā)酵60 h后含量增加速率變緩（如圖4C）。由此可見，糖化時(shí)間過短，產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶的量較少，不足以使板栗和糯米中的淀粉分解生成還原糖，產(chǎn)生的有機(jī)酸等含量較少，口感欠佳[16]；糖化時(shí)間過長(zhǎng)，則原材料中的淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡，同時(shí)，霉菌在發(fā)酵過程中可能產(chǎn)生較多有機(jī)酸，影響產(chǎn)品風(fēng)味，且容易造成雜菌的污染，不利于后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酒[17]。綜合還原糖、總酸和可溶性固形物含量，以及米曲霉成本和發(fā)酵時(shí)間成本考慮，選取60 h為最佳糖化發(fā)酵時(shí)間。

圖4 米曲霉發(fā)酵時(shí)間對(duì)糖化發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖、可溶性固形物和總酸含量的影響圖

2.2 米曲霉糖化發(fā)酵條件正交優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化米曲霉發(fā)酵糖化工藝條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)的研究結(jié)果，以發(fā)酵時(shí)間（48 、60 h和72 h）、米曲霉添加量（0.35%、0.4%、0.45%）和發(fā)酵溫度（30、32 ℃和34 ℃）為試驗(yàn)水平，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)（表1）。

表1 板栗糯米糖化正交試驗(yàn)因素水平表

還原糖含量為標(biāo)準(zhǔn)，由表2可知，RA＞RC＞RB，極差分析的結(jié)果顯示為發(fā)酵時(shí)間的影響因素最大，其次是發(fā)酵溫度，米曲霉添加量對(duì)板栗糯米原料中的淀粉糖化得到的還原糖含量影響最小。根據(jù)各因素的K值大小，可以看出板栗糯米糖化工藝的最佳條件為A3B3C2。即發(fā)酵時(shí)間72 h、米曲霉添加量0.45%、反應(yīng)溫度32 ℃。

表2 糖化工藝還原糖含量正交試驗(yàn)結(jié)果表

以可溶性固形物含量為標(biāo)準(zhǔn)，由表3可知，RA＞RB＞RC，極差分析的結(jié)果顯示為發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中可溶性固形物含量的影響因素最大，其次是米曲霉添加量，發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵過程中可溶性固形物含量的影響最小。

表3 糖化工藝可溶性固形物含量正交試驗(yàn)結(jié)果表

以總酸含量為標(biāo)準(zhǔn)，由表4可知，RC＞RB＞RA，極差分析的結(jié)果顯示為發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液酸度的影響因素最大，其次是米曲霉添加量，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵過程中酸的產(chǎn)生影響最小。

表4 糖化工藝總酸含量正交試驗(yàn)結(jié)果表

以還原糖含量為標(biāo)準(zhǔn)的最佳條件A3B3C2下，發(fā)酵液中總酸含量卻遠(yuǎn)超過最優(yōu)的1.2～1.7 g/100 g[18]。因此，在發(fā)酵液總酸含量處于1.2～1.7 g/100 g條件下，選擇還原糖含量最高的條件A2B2C2、米曲霉添加量0.4%、發(fā)酵溫度32 ℃，所得發(fā)酵液還原糖含量為8.22 g/100 g，總酸含量為1.58 g/100 g，可溶性固形物含量為17.69%。

3 結(jié)論

本研究以板栗、糯米為主要原料，經(jīng)過米曲霉糖化發(fā)酵，以發(fā)酵液的還原糖、可溶性固形物、總酸為指標(biāo)，確定最佳糖化工藝為米曲霉添加量為0.4%，發(fā)酵溫度為32 ℃，發(fā)酵時(shí)間為60 h。因此，本研究結(jié)果不僅可以為板栗的深加工提供新思路，而且可以為板栗糯米酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。