畢 瑩, 郭雅琳, 尚孟慧, 徐曉婷, 臧曉南

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003)

鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospiraplatensis)是一種多細(xì)胞絲狀的藍(lán)綠色微藻,屬于藍(lán)藻門(mén)(Cyanophyta)、藍(lán)藻綱(Cyanophyceae)、顫藻目(Oscillatoriales)、顫藻科(Oscillaoriales)、節(jié)旋藻屬(Arthrospira),生長(zhǎng)在水中,易被獲得與加工,并且具有很高的常量與微量營(yíng)養(yǎng)成分。它在作為補(bǔ)充膳食成分、蛋白質(zhì)維生素補(bǔ)充劑和健康食品方面具有很大的發(fā)展?jié)摿ΑＦ涓缓脑逅{(lán)蛋白與別藻藍(lán)蛋白具有很高的生物學(xué)研究?jī)r(jià)值與應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值[1-2]。

別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin)作為藻膽體核心復(fù)合物中重要的藻膽蛋白,能直接吸收光能,進(jìn)而作為捕光色素參與藻類(lèi)的光合作用,而且在抗氧化、抗癌、免疫印跡和食品工業(yè)方面都有應(yīng)用[3-5]。另外,別藻藍(lán)蛋白還因具有光學(xué)活性,可作為光敏材料和生物醫(yī)學(xué)中的熒光標(biāo)簽[6-7]。分離純化出來(lái)的天然別藻藍(lán)蛋白含有α、β兩種亞基,通常是以三聚體(αβ)3的形式存在[8]。

天然別藻藍(lán)蛋白的熒光發(fā)射特征峰約在660 nm左右[9],吸收峰在650 nm。別藻藍(lán)蛋白之所以具有明亮的顏色和光吸收特性,是由于藻膽素(PCBs,線(xiàn)性四吡咯膽素)的存在,PCBs通過(guò)硫醚鍵連接到藻膽蛋白高度保守的半胱氨酸殘基上[10]。藻藍(lán)膽素的合成需要鐵氧還蛋白還原酶(PcyA)還原膽綠素,膽綠素則是由血紅素氧化酶(HO1)氧化血紅素而得。血紅素不僅存在于藍(lán)藻中,也存在于大腸桿菌中[11]。因此,HO1和PcyA在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化表達(dá)使帶有光學(xué)活性藻膽蛋白的異源表達(dá)成為可能。色基裂合酶可以進(jìn)一步催化藻膽素結(jié)合到脫輔基藻膽蛋白不同位點(diǎn)的半胱氨酸,為藻膽素的附著提供了正確的區(qū)域和異構(gòu)性[12-13]。因此,異源表達(dá)有光學(xué)活性的別藻藍(lán)蛋白,除了要表達(dá)脫輔基別藻藍(lán)蛋白,還要表達(dá)藻藍(lán)膽素合成相關(guān)酶(HO1、PcyA)以及催化別藻藍(lán)蛋白同色基結(jié)合的色基裂合酶(CpcE、CpcF、CpcU、CpcS、CpcT)。

關(guān)于利用基因工程技術(shù)合成具有光學(xué)活性別藻藍(lán)蛋白的研究有很多報(bào)道,主要集中在聚球藻(Synechococcussp.7002)和集胞藻(Synechocystissp. PCC6803)模式藍(lán)藻上[14-17]。節(jié)旋藻作為一種可食用的經(jīng)濟(jì)藍(lán)藻,其別藻藍(lán)蛋白被證明有顯著的醫(yī)藥價(jià)值,對(duì)其別藻藍(lán)蛋白進(jìn)行重組表達(dá)的研究有重要的應(yīng)用價(jià)值[18]。文獻(xiàn)[19]的研究中,對(duì)螺旋藻(Spirulinasp.)的別藻藍(lán)蛋白α亞基基因(ApcA)進(jìn)行克隆并自催化在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。Ge等利用來(lái)自Synechocystissp. PCC6803的ho1和pcyA、來(lái)自魚(yú)腥藻(Anabaenasp. PCC7120)的cpeS以及來(lái)自螺旋藻Spirulinasp.的apcB基因構(gòu)建表達(dá)載體,成功表達(dá)重組別藻藍(lán)蛋白β亞基[20]。

本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆了A.platensisFACHB314中的脫輔基別藻藍(lán)蛋白基因apcAB并分析預(yù)測(cè)了其單亞基基因apcA和apcB,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期在同物種中得到的藻藍(lán)膽素合成相關(guān)基因(ho1和pcyA)以及色基裂合酶基因(cpcE、cpcF、cpcU、cpcS和cpcT),分別構(gòu)建了2個(gè)分別表達(dá)apcA和apcB單亞基的重組表達(dá)菌株E.coliHPEFUSTA和E.coliHPEFUSTB,分析重組菌株的蛋白表達(dá)和熒光活性,為研究藍(lán)藻中藻膽體的組裝和光學(xué)活性提供有效的元件,為別藻藍(lán)蛋白在醫(yī)藥、熒光檢測(cè)方面應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藻種和質(zhì)粒

鈍頂節(jié)旋藻(A.platensisFACHB314)由中國(guó)海洋大學(xué)藻類(lèi)遺傳育種和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存,培養(yǎng)溫度為25 ℃,光照周期為12L∶12D。E.coliBL21(DE3)Chemically Competent Cell購(gòu)自TSINGKE,表達(dá)載體 pACYCDuet-1 和 pET-24a(+) 購(gòu)自 Novagen (Germany)。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存含有A.platensisFACHB314中克隆的亞鐵血紅素氧化酶基因(ho)、鐵氧還蛋白還原酶基因(pcyA)以及色基裂合酶基因(cpcU、cpcS、cpcT、cpcE和cpcF)的pET-24a(+)-ho-pcyA-cpcUST、pACYCDuet-cpcEF質(zhì)粒。

1.2 節(jié)旋藻基因組DNA的提取

使用TAKARA植物基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit)提取節(jié)旋藻基因組DNA,獲得的DNA置于-20 ℃環(huán)境中保存。

1.3 脫輔基別藻藍(lán)蛋白基因簇apcAB以及apcA、apcB的克隆及序列分析

參照在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中已報(bào)道的A.platensisYZ genome(GenBank:CP013008.1 )的脫輔基別藻藍(lán)蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物,如表1(酶切位點(diǎn)處以下劃線(xiàn)表示)所示,以提取出的A.platensisFACHB314基因組DNA為模板,擴(kuò)增得到脫輔基別藻藍(lán)蛋白apcAB基因簇序列,連接T載體pEASY?T1-apcAB,對(duì)獲得的序列進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)分析預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1),克隆脫輔基別藻藍(lán)蛋白α亞基和β亞基分別對(duì)應(yīng)的基因apcA和apcB,并均連接T載體,以獲得pEASY?T1-apcA和pEASY?T1-apcB。

表1 引物設(shè)計(jì)列表

對(duì)獲得的單亞基基因序列進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證和分析。通過(guò)DNAman軟件(開(kāi)發(fā)商:Lynnon Corporation,Quebec,Canada)確定基因的氨基酸序列,通過(guò)BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)基因的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,確定其編碼框[21]。利用Expert蛋白分析系統(tǒng)(http://www.expasy.org)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行理論等電點(diǎn)和分子量預(yù)測(cè)[22]。通過(guò)Genome(http://www.genome.jp/tool-bin/clustalw)進(jìn)行多序列比對(duì),利用MEGA7.0程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[23]。多序列比對(duì)及構(gòu)建進(jìn)化對(duì)所用序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlmnih.govl)。

1.4 表達(dá)載體pACYCDuet-apcA-cpcEF和pACYCDuet-apcB-cpcEF的構(gòu)建

使用快速內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ對(duì)得到的克隆質(zhì)粒pEASY?T1-apcA和pEASY?T1-apcB分別進(jìn)行雙酶切,分別得到apcA和apcB兩個(gè)片段;同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的載體pACYCDuet-cpcEF同樣用BamHⅠ和SacⅠ兩個(gè)快速內(nèi)切酶雙酶切,然后將兩個(gè)片段分別連入載體中,從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-apcA-cpcEF和pACYCDuet-apcB-cpcEF。

將重組表達(dá)載體pACYCDuet-apcA-cpcEF和pACYCDuet-apcB-cpcEF分別同實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含有合成藻藍(lán)膽素相關(guān)基因的表達(dá)載體pET-24a(+)-ho-pcyA-cpcUST共同轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coliBL21 (DE3)中,分別得到重組表達(dá)菌株E.coliHPEFUSTA和E.coliHPEFUSTB。

1.5 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將表達(dá)菌株E.coliHPEFUSTA、E.coliHPEFUSTB和空白對(duì)照E.coliBL21菌種分別接種到200 mL 溶菌肉湯(LB)液體培養(yǎng)基中于37 ℃ 200 r/min條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。其中,表達(dá)菌株E.coliHPEFUSTA、E.coliHPEFUSTB的培養(yǎng)基中加入抗生素硫酸卡那霉素和氯霉素(1∶1 000),空白對(duì)照E.coliBL21的培養(yǎng)基不加抗生素。當(dāng)吸光度(OD)達(dá)到0.6時(shí),向重組菌液中分別加入濃度為1 mol/L的IPTG至終濃度為0.1 mmol/L。在30 ℃ 200 r/min 條件下誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá) 4 h。然后再次測(cè)定表達(dá)后的 OD600以保證得到菌量相同。將相同菌量的菌液離心后,先用5 mL 0.9% NaCl進(jìn)行溶液洗滌,再在4 ℃ 10 000 r/min下離心20 min后,用4 mL PBS母液重懸后,然后使用超聲將其破碎6 min,最后在4 ℃ 10 000 r/min下離心20 min后取上清。同時(shí)收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè),收集上清進(jìn)行熒光發(fā)射光檢測(cè)。

1.6 重組菌株的SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)

重組蛋白通過(guò)15%分離膠(供應(yīng)商:MDBio, Taiwan, China) 的SDS-PAGE檢測(cè),用 Coomassie Blue R-250 (供應(yīng)商:Sangon Biotech, Qingdao, China)染色觀(guān)察。

Western Blot使用別藻藍(lán)蛋白特異性抗體(供應(yīng)商:Boster Biological Technology Co. Ltd.)為一抗(比例為1∶1 000),HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG (Sangon Biotech, China)為二抗(比例為1∶2 000)。

1.7 重組菌株的熒光發(fā)射光譜檢測(cè)

利用熒光分光光度計(jì)HITACHI F-4600進(jìn)行熒光發(fā)射光譜分析。狹縫寬度為10.0 nm,掃描速度為1 200 nm/min[24]。根據(jù)最高熒光發(fā)射峰反向掃描得到的最高熒光激發(fā)峰檢查菌株的熒光發(fā)射光譜。在600 nm激發(fā)光下檢測(cè)別藻藍(lán)蛋白APC的熒光發(fā)射光譜,計(jì)算單位質(zhì)量APC的熒光強(qiáng)度:

單位質(zhì)量APC的熒光強(qiáng)度=熒光發(fā)射峰值/APC濃度。

2 結(jié)果分析

2.1 基因簇apcAB同apcA和apcB的克隆及序列比對(duì)分析

2.1.1 脫輔基別藻藍(lán)蛋白apcAB基因簇的克隆 脫輔基別藻藍(lán)蛋白apcAB基因全長(zhǎng)共1 056 bp,經(jīng)Blast程序序列比對(duì)及DNAMAN軟件氨基酸預(yù)測(cè)可以發(fā)現(xiàn),apcAB基因由apcA和apcB兩個(gè)基因串聯(lián)組成,中間間隔了84 bp,故又稱(chēng)為apcAB基因簇,其基因序列及氨基酸序列如圖1所示,圖1中下劃線(xiàn)處為間隔序列。為了便于基因表達(dá)和功能分析,本研究進(jìn)一步克隆了脫輔基別藻藍(lán)蛋白單亞基基因apcA和apcB。

圖1 apcAB基因簇的核苷酸及氨基酸序列

2.1.2 脫輔基別藻藍(lán)蛋白apcA基因的克隆及序列分析 以A.platensisFACHB314基因組DNA為模板,以apcA314-F和apcA314-R為引物擴(kuò)增得到apcA基因,經(jīng)克隆得到的apcA基因序列及氨基酸序列如圖2所示。經(jīng)本文1.3節(jié)所提及的軟件分析通知:apcA基因全長(zhǎng)486 bp,GC含量為50.2%;apcA基因無(wú)內(nèi)含子,共編碼161個(gè)氨基酸;預(yù)測(cè)編碼蛋白ApcA等電點(diǎn)為4.89,預(yù)測(cè)分子量約為17.39 kDa;ApcA正電荷殘基(Asp + Glu) 23個(gè),負(fù)電荷殘基(Arg + Lys)18個(gè),不穩(wěn)定系數(shù)經(jīng)計(jì)算為32.24(< 40),表明蛋白是穩(wěn)定的。

圖2 apcA基因的核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列

同保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果如圖3所示,ApcA屬于Globin_like超級(jí)家族,這種珠蛋白結(jié)構(gòu)域超級(jí)家族包含各種各樣的全螺旋蛋白,它們結(jié)合卟啉、藻膽素和其他非血紅素輔因子。57～126位氨基酸是可能的色基結(jié)合區(qū)域。

圖3 A.platensis FACHB314 ApcA保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)比結(jié)果

如圖4所示,它的氨基酸序列在藍(lán)藻中較為保守,相似度為91.84%,同紅藻之間的序列相似度為90.68%,包含的保守結(jié)構(gòu)域有TKSIVNADAEARYLSPGELDRIK、LFQKRPD、GNAYG、 EMTATCLRD、DYYLRL、TPIEEIG和SLGTP。第81位氨基酸在一個(gè)保守的半胱氨酸,推測(cè)可能是色基結(jié)合位點(diǎn)。

(圖中黑色方框代表保守結(jié)構(gòu)域,所選取的物種為Arthrospira erdosensis eb (AEV40861.1)、 Lyngbya sp. PCC 8106(WP_009787434.1)、Planktothrix sp. UBA8402(HAN74958.1)、Synechococcus sp. PCC73109(WP_062434871.1)、Oscillatoriales MTP1(WP_058881332.1)、Calothrix desertica(WP_127083433.1)、Pyropia yezoensis(pdb|1KN1|A)、Gracilariopsis lemaneiformis(MN105086)。The black box in the figure represents the conservative domain, and the selected species are Arthrospira erdosensis eb(AEV40861.1), Lyngbya sp. PCC 8106(WP_009787434.1),Planktothrix sp. UBA8402(HAN74958.1), Synechococcus sp. PCC73109(WP_062434871.1), Oscillatoriales MTP1(WP_058881332.1), Calothrix desertica(WP_127083433.1), Pyropia yezoensis(pdb|1KN1|A), Gracilariopsis lemaneiformis(MN105086).)

圖5為鈍頂節(jié)旋藻(A.platensisFACHB314)ApcA氨基酸序列同其他物種最相近氨基酸序列所作的進(jìn)化樹(shù)(自展1 000次)。結(jié)果顯示,其ApcA序列與A.erdosensiseb (AEV40861.1)以99%的置信度聚為一支,表明其在鈍頂節(jié)旋藻中較為保守。同大型紅藻條斑紫菜(Pyropiayezoensis)(pdb|1KN1|A)和龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)(MN105086)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)且位于不同分支,表明其序列的相似性同物種的親緣關(guān)系一致。

(節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字代表可信度。組之間的進(jìn)化距離為0.02。所選取的物種為Arthrospira erdosensis eb (AEV40861.1)、 Lyngbya sp. PCC 8106(WP_009787434.1)、Planktothrix sp. UBA8402(HAN74958.1)、Synechococcus sp. PCC73109(WP_062434871.1)、Oscillatoriales MTP1(WP_058881332.1)、Calothrix desertica(WP_127083433.1)、Pyropia yezoensis(pdb|1KN1|A)、 Gracilariopsis lemaneiformis(MN105086)。Numbers represented the credibility. The evolutionary distance between groups was 0.02. The the selected species are Arthrospira erdosensis (EB: AEV40861.1), Lyngbya sp. PCC 8106(WP_009787434.1),Planktothrix sp. UBA8402(HAN74958.1),Synechococcus sp. PCC73109(WP_062434871.1),Oscillatoriales MTP1(WP_058881332.1),Calothrix desertica(WP_127083433.1), Pyropia yezoensis(pdb|1KN1|A), Gracilariopsis lemaneiformis(MN105086).)

2.1.3 脫輔基別藻藍(lán)蛋白apcB基因的克隆及序列結(jié)構(gòu)分析 以A.platensisFACHB314基因組DNA為模板,以apcB314-F和apcB314-R為引物擴(kuò)增得到apcB基因。經(jīng)克隆得到的apcB基因序列及ApcB氨基酸序列如圖6所示。apcB基因全長(zhǎng)486 bp,GC含量為48.1%,理論等電點(diǎn)為6.25,預(yù)測(cè)分子量約為17.33 kDa,無(wú)內(nèi)含子,共編碼161個(gè)氨基酸,正電荷殘基(Asp+Glu) 16個(gè),負(fù)電荷殘基(Arg + Lys)16個(gè),不穩(wěn)定系數(shù)經(jīng)計(jì)算為25.81(<40),表明蛋白是穩(wěn)定的。

圖6 apcB基因的核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列

同保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果如圖7所示,ApcB也屬于Globin_like超級(jí)家族。如圖8所示,ApcB氨基酸序列較為保守,同藍(lán)藻ApcB氨基酸序列相似度為94.75%,同紅藻ApcB氨基酸序列相似度為84.47%,第60～126位氨基酸是可能的色基結(jié)合區(qū)域。

圖7 A.platensis FACHB314 ApcB保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果

包含的保守結(jié)構(gòu)域:QDAIT、DVQGKYLD、TGELRVRA、ANAA、LLYSD、 TRPGGNMYTTRRYAACIRDLDYYLRY、MLAGD、SILDERVLNGLKETYNSLGVP、QAIQA、KEVT、DAGKEMG和SGLS。第81位是一個(gè)保守的半胱氨酸,推測(cè)可能是色基結(jié)合位點(diǎn)。

圖9為鈍頂節(jié)旋藻(A.platensisFACHB314)ApcB氨基酸序列同其他物種最相近的氨基酸序列所作的進(jìn)化樹(shù)(自展1 000次)。其中所選取的物種及其序列號(hào)為Arthrospiraplatensisqy3(AGU69492.1),Limnoraphisrobusta(WP_046276870.1),Planktothrixtepida(WP_072720267.1),Microcystisaeruginosa(WP_149106796.1),Nostoc(WP_094349822.1),Trichormusazollae(WP_013191378.1),Oscillatoriasp. PCC10802(WP_017720775.1),Gracilariopsislemaneiformis(MN105087). 結(jié)果顯示,其ApcB序列同Arthrospiraplatensisqy3(AGU69492.1)以97%的置信度聚為一支,表明ApcB序列在鈍頂節(jié)旋藻中較為保守;其ApcB序列同G.lemaneiformis(MN105086)ApcB序列位于不同分支,表明其同藍(lán)藻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

(節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字代表置信度。組之間的進(jìn)化距離為0.02。Numbers represented the credibility. The evolutionary distance between groups was 0.01. )

2.2 別藻藍(lán)蛋白的重組表達(dá)

為研究從A.platensisFACHB314中獲得的脫輔基別藻藍(lán)蛋白的單亞基是否能在體外同藻藍(lán)膽素結(jié)合并組裝成具有熒光活性的別藻藍(lán)蛋白,在IPTG濃度為0.1 mmol/L下對(duì)轉(zhuǎn)化菌株E.coliHPEFUSTA、E.coliHPEFUSTB以及空白對(duì)照E.coliBL21進(jìn)行4 h的誘導(dǎo)表達(dá)(30 ℃,200 r/min)。將誘導(dǎo)表達(dá)好的菌株制成蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)。

SDS-PAGE結(jié)果如圖10所示,除空白對(duì)照外,重組菌株E.coliHPEFUSTA和E.coliHPEFUSTB在大于14 kDa的位置均出現(xiàn)了條帶,這同天然脫輔基別藻藍(lán)蛋白單亞基約17 kDa大小相近。Western Blot結(jié)果如圖11所示,使用別藻藍(lán)蛋白特異性抗體雜交時(shí),除空白對(duì)照外,重組表達(dá)菌株E.coliHPEFUSTA和E.coliHPEFUSTB也均在約17 kDa大小出現(xiàn)了特異性的雜交帶。SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果均證明重組菌株E.coliHPEFUSTA和E.coliHPEFUSTB中有別藻藍(lán)蛋白單亞基的表達(dá)。

(M: 標(biāo)記; B:空白對(duì)照E. coli BL21;泳道1、2分別為E. coli HPEFUSTA 和E. coli HPEFUSTB。箭頭所指為重組菌株E. coli HPEFUSTA、E. coli HPEFUSTB出現(xiàn)的條帶。M: Marker; B: Blank control E. coli BL21;Lane 1, 2 were E.coli HPEFUSTA and E. coli HPEFUSTB, respectively. The arrows indicate the bands of E. coli HPEFUSTA and E. coli HPEFUSTB.)

(M: 標(biāo)記; B: 空白對(duì)照E.coli BL21;泳道1、2分別為E. coli HPEFUSTA和 E. coli HPEFUSTB。 箭頭所指為重組菌株E. coli HPEFUSTA、E. coli HPEFUSTB出現(xiàn)的雜交帶。 M: Marker; B: Blank control E. coli BL21;Lane 1, 2 were E. coli HPEFUSTA and E. coli HPEFUSTB, respectively. The arrows indicate hybridization bands of E. coli HPEFUSTA and E. coli HPEFUSTB. )

2.3 重組表達(dá)菌株的熒光發(fā)射光譜分析

在600 nm波長(zhǎng)光激發(fā)下,重組表達(dá)菌株的熒光發(fā)射光譜如圖12所示。結(jié)果顯示,除了空白對(duì)照外,重組表達(dá)菌株E.coliHPEFUSTA和E.coliHPEFUSTB均在約640 nm處有熒光峰,表明重組菌株均合成了具有熒光活性的別藻藍(lán)蛋白。其中E.coliHPEFUSTB的單位質(zhì)量熒光強(qiáng)度為538.27±1.26,E.coliHPE FUSTA 的熒光強(qiáng)度(514.01±2.88)相比于E.coliHPEFUSTB的單位質(zhì)量熒光強(qiáng)度略低(見(jiàn)表2)。

圖12 重組菌株的熒光發(fā)射光譜圖

3 討論

自從Bryant等[14]于1985年在大腸桿菌中成功表達(dá)出別藻藍(lán)蛋白基因以來(lái),基因工程技術(shù)已被用于別藻藍(lán)蛋白的異源表達(dá)。隨后,具有光學(xué)活性的重組別藻藍(lán)蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá),藻膽素的合成途徑也逐漸被解析出來(lái)[25]。

脫輔基別藻藍(lán)蛋白是生物合成具有光學(xué)活性別藻藍(lán)蛋白的基本元件,本實(shí)驗(yàn)從A.platensisFACHB314中克隆得到了編碼脫輔基別藻藍(lán)蛋白apcAB,經(jīng)序列比對(duì)和DNAMAN軟件的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),apcAB包含apcA和apcB兩段編碼框,分別編碼別藻藍(lán)蛋白α亞基和β亞基。天然別藻藍(lán)蛋白由α和β兩個(gè)亞基組成,兩個(gè)亞基組合在一起形成單體,再進(jìn)一步組合,最終以三聚體(αβ)3的形式存在[8]。apcA與apcB在基因結(jié)構(gòu)上串聯(lián)在一起的,這可能更有利于兩個(gè)基因協(xié)同表達(dá),這同鈍頂節(jié)旋藻藻藍(lán)蛋白α亞基和β亞基基因也是串聯(lián)在一起的情況是一致的。apcA與apcB之間存在84 bp的基因間隔區(qū),在A(yíng).platensisFACHB314藻藍(lán)蛋白α亞基和β亞基基因之間也存在一段112 bp的間隔區(qū)[26],基因間隔區(qū)可能具有啟動(dòng)子或增強(qiáng)子功能,在調(diào)節(jié)兩個(gè)基因表達(dá)中發(fā)揮作用。

apcA和apcB基因全長(zhǎng)均為486 bp,共編碼161個(gè)氨基酸,無(wú)內(nèi)含子,GC含量分別為50.2%和48.1%,預(yù)測(cè)分子量分別約為17.39和17.33 kDa;保守結(jié)構(gòu)域分析顯示ApcA和ApcB都屬于Globin_like超級(jí)家族,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明它們的氨基酸序列在藍(lán)藻和鈍頂節(jié)旋藻中較為保守,序列相似度高于其二者在紅藻中的相似度。

有熒光活性的別藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)生需要?jiǎng)e藻藍(lán)蛋白的α亞基和β亞基半胱氨酸殘基分別結(jié)合藻藍(lán)膽素[6-7]。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析顯示ApcA的57～126位氨基酸,ApcB的60-126位氨基酸是可能的色基結(jié)合區(qū)域。其中α亞基和β亞基第81位各有一個(gè)半胱氨酸,藻藍(lán)膽素是通過(guò)半胱氨酸結(jié)合到藻膽蛋白亞基上的,因此α亞基和β亞基第81位的半胱氨酸可能為藻藍(lán)膽素的結(jié)合位點(diǎn)。為了研究脫輔基別藻藍(lán)蛋白的單亞基是否能在體外同藻藍(lán)膽素結(jié)合并組裝成具有熒光活性的別藻藍(lán)蛋白,本研究進(jìn)一步構(gòu)建了含有脫輔基別藻藍(lán)蛋白單亞基基因的質(zhì)粒pACYCDuet-apcA-cpcEF和pACYCDuet-apcB-cpcEF,同實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含有合成藻藍(lán)膽素相關(guān)基因的表達(dá)載體pET-24a(+)-ho-pcyA-cpcUST共同轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coliBL21 (DE3)中,構(gòu)建出能夠合成熒光活性別藻藍(lán)蛋白單獨(dú)亞基的重組表達(dá)菌株E.coliHPEFUSTA、E.coliHPEFUSTB。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE結(jié)果顯示重組菌株在17 kDa左右均有明顯的條帶,Western Blot結(jié)果顯示特異性抗體雜交下重組菌株在特定位置也有明顯的雜交條帶,說(shuō)明重組菌株中都有別藻藍(lán)蛋白亞基的合成。熒光發(fā)射光譜顯示,重組表達(dá)菌株E.coliHPEFUSTA和E.coliHPEFUSTB均在約640 nm處有熒光峰,其中E.coliHPEFUSTA的單位質(zhì)量熒光強(qiáng)度為514.01±2.88,E.coliHPEFUSTB的單位質(zhì)量熒光強(qiáng)度為538.27±1.26,這表明重組菌株均合成了具有熒光活性的別藻藍(lán)蛋白。但相比于天然別藻藍(lán)蛋白特征熒光峰660 nm,出現(xiàn)了20 nm的藍(lán)移。這一結(jié)果同文獻(xiàn)[15,27]中的結(jié)果類(lèi)似,重組別藻藍(lán)蛋白holo-ApcAS、holo-ApcAT和holo-ApcBT的熒光發(fā)射峰分別出現(xiàn)于639、638和642 nm。這可能與本研究中表達(dá)的是單一亞基有關(guān),而且可能同體外重組表達(dá)造成重組蛋白的構(gòu)象不同于天然組裝蛋白的構(gòu)象相關(guān)。此外,有研究表明藻藍(lán)膽素與脫輔基別藻藍(lán)蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性也會(huì)影響光學(xué)性質(zhì)[28]。

本研究重組表達(dá)了有光學(xué)活性的A.platensisFACHB314別藻藍(lán)蛋白單亞基,為研究藍(lán)藻中藻膽體的組裝和功能提供有效的元件、別藻藍(lán)蛋白在醫(yī)藥及熒光檢測(cè)方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。