陳志偉, 孫慧邦, 金超凡, 趙 瑄, 劉金相,2,3, 張全啟,2,3??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003;2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237;3. 中國海洋大學(xué)三亞海洋研究院, 海南省熱帶水產(chǎn)種質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海南 三亞 572000)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)鲀形目(Tetraodontiformes)鲀科(Tetraodontidae)東方鲀屬(Takifugu)[1],其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富,是中國、韓國和日本等地最重要的鲀科經(jīng)濟(jì)物種[2]。近年來,受船舶航行、海洋污染因素的影響,紅鰭東方鲀的野生種群數(shù)量縮減,捕獲量逐年減少[3]。與之相反,20世紀(jì)90年代以來,紅鰭東方鲀的人工養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)增長,有報(bào)道顯示其人工養(yǎng)殖產(chǎn)量在日本的已達(dá)到4 179 t,是野生捕獲量的17倍[3];在中國達(dá)到了14 000 t[4]。紅鰭東方鲀養(yǎng)殖規(guī)模的快速擴(kuò)大主要?dú)w因于建立了成熟的親魚養(yǎng)殖管理、人工誘導(dǎo)排卵授精和良種選育體系[3],但親魚養(yǎng)殖管理仍需進(jìn)一步優(yōu)化。首先,紅鰭東方鲀的生殖周期較長,雌魚的最小成熟年齡為3齡,雄魚為2齡,3～4齡為優(yōu)勢年齡組;其次,紅鰭東方鲀的親本大小為2～5 kg,是其銷售個(gè)體體質(zhì)量的(0.6～1 kg)的2～8倍。因此,親魚的養(yǎng)殖和管理需要大量的時(shí)間和空間[5],亟需新技術(shù)減少親魚的生長、生產(chǎn)時(shí)間,以加速紅鰭東方鲀的良種選育進(jìn)程,降低親魚的養(yǎng)殖管理成本[6]。

生殖細(xì)胞移植技術(shù)可以加速良種選育進(jìn)程。該技術(shù)首先在鳥類中建立,Wentworth等將顯性遺傳普通鵪鶉(Coturnixcoturnix)的原始生殖細(xì)胞移植到隱性的白羽鵪鶉胚胎內(nèi),從而獲得了嵌合體[7]。之后,Brinster等在小鼠(Musmusculus)中建立了生殖細(xì)胞移植體系[8]。魚類生殖細(xì)胞移植技術(shù)首先在斑馬魚(Daniorerio)中建立[9],之后在其他魚類中得到進(jìn)一步應(yīng)用。在尼羅河羅非魚(Oreochromisniloticus)中,Lacerda等將分離到的精原細(xì)胞通過泄殖孔注射到已去除內(nèi)源生殖細(xì)胞的成魚精巢中,待其成熟后獲得了供體精子,從而建立了成魚生殖細(xì)胞移植體系[10]。在哈奇氏牙漢魚(Odontestheshatcheri)中還實(shí)施了雌性成魚生殖細(xì)胞移植,且成功地得到了供體卵子[11]。在鲆鰈類魚中,Li等成功進(jìn)行了生殖細(xì)胞的異種移植[12];任玉芹等在確保移植成魚受體具有較高成活率的前提下,使用白消安實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性生殖細(xì)胞較徹底的凋亡效果,同時(shí)將卵原細(xì)胞移植到雄魚體內(nèi),成功獲得了精子及供體后代[13]。成體細(xì)胞移植技術(shù)以成魚作為受體,在較短的時(shí)間即可獲得供體配子,可大幅度減少親魚養(yǎng)殖時(shí)間[14]。

生殖細(xì)胞移植的理想對象是不育受體,如果受體可育,就會(huì)影響移植效果。首先,可育受體會(huì)產(chǎn)生自身配子,這對供體后代的檢測會(huì)產(chǎn)生干擾;其次,可育受體中大量的內(nèi)源生殖細(xì)胞會(huì)與供體生殖細(xì)胞競爭發(fā)育所需的生態(tài)位和微環(huán)境,且通常因內(nèi)源生殖細(xì)胞處于絕對優(yōu)勢使供體細(xì)胞缺乏生態(tài)位而定植困難,最終被受體免疫系統(tǒng)清除。目前,獲得不育個(gè)體的手段主要包括高溫-化學(xué)藥物處理組合、三倍體誘導(dǎo)和生殖基因敲降或敲除等方法[10,15-16]。成魚中應(yīng)用最多的方法是使用化學(xué)藥物(白消安)和高溫混合作用來清除受體內(nèi)源性生殖細(xì)胞,研究表明,該方法可以使亞成魚或成魚性腺退化,實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性生殖細(xì)胞的清除[15]。

白消安(1,4-丁二醇二甲磺酸酯)是一種雙甲基磺酸酯類雙功能烷化劑,為細(xì)胞周期非特異性藥物。白消安不僅可以作為內(nèi)源細(xì)胞的清除劑,還可以作為一種抗白血病的藥物,因此對哺乳動(dòng)物的作用原理和機(jī)制都相對清楚。注射白消安會(huì)導(dǎo)致表皮功能退化、肺損傷、肝毒性、骨髓造血抑制、晶狀體混濁或白內(nèi)障、病胃腸道疾病移、植物抗宿主等疾病,嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致死亡[17-20]。白消安能作用于哺乳動(dòng)物的睪丸和卵巢,特別是睪丸[21]。硬骨魚和哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞發(fā)育過程存在較大差異,很難預(yù)估白消安對硬骨魚性腺的處理效果,白消安在東方鲀屬中僅在星點(diǎn)東方鲀(Takifuguniphobles)中予以運(yùn)用,并在雌雄個(gè)體中都取得了較好的效果[22],而在紅鰭東方鲀中未有運(yùn)用的報(bào)告,同時(shí)白消安清除魚類生殖細(xì)胞的作用機(jī)制仍尚不清楚,未有學(xué)者研究。

本研究為獲得不育紅鰭東方鲀受體,使用白消安對二齡半紅鰭東方鲀進(jìn)行處理,通過組織學(xué)觀察和轉(zhuǎn)錄組分析,對白消安在雌雄魚性腺中的作用效果和機(jī)制進(jìn)行探究,從分子水平提供白消安誘導(dǎo)性腺退化作用機(jī)制的新認(rèn)知,為促進(jìn)紅鰭東方鲀良種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究的實(shí)驗(yàn)用魚購自遼寧省大連市天正實(shí)業(yè)有限公司大黑石養(yǎng)殖場。選擇體表無損傷、體型正常、健康活潑的兩齡半紅鰭東方鲀(體長為(30.40±1.96) cm;體質(zhì)量為(1 029.5±106.4) g;,性腺質(zhì)量為(5.75±2.39) g)作為實(shí)驗(yàn)對象。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白消安注射 使用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)作為溶劑配置30 mg/mL濃度的白消安溶液,放置在冰中備用。實(shí)驗(yàn)用魚隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,每組各30尾。將實(shí)驗(yàn)魚用麻醉劑MS-222(20 mg/L)麻醉2 min后,實(shí)驗(yàn)組按照40 mg/kg的劑量進(jìn)行白消安腹腔注射,對照組注射相同體積的DMSO。注射共進(jìn)行兩次,兩次注射間隔兩周[10,22]。

1.2.2 性腺組織取樣 第二次注射結(jié)束兩周后,對照組和實(shí)驗(yàn)組分別取6尾魚(雌雄各3尾),使用MS-222對其進(jìn)行麻醉,然后進(jìn)行斷椎處理,從泄殖孔剖開腹腔,取出其性腺。每個(gè)個(gè)體取一部分性腺組織,用4%多聚甲醛在室溫下固定24 h,用于組織學(xué)形態(tài)觀察,另一部分性腺用剪刀剪成3 mm3大小的組織塊放入RNA-wait中,4 ℃過夜后在-80 ℃長期保存,用于RNA提取。

1.2.3 性腺組織切片觀察 將保存在4%多聚甲醛中的性腺組織梯度乙醇脫水后,經(jīng)石蠟包埋制備組織切片,厚度為4～5 μm[23]。經(jīng)HE染色(Hematoxylin-eosin staining)后,在尼康A(chǔ)Z100熒光顯微成像系統(tǒng)下進(jìn)行組織形態(tài)觀察與拍照。

1.2.4 性腺組織總RNA提取 按說明書用Trizol(TaKaRa)法提取對照組和處理組性腺組織RNA,使用Bioanalyzer 2100系統(tǒng)對RNA進(jìn)行RIN值檢測,確保RNA無污染、無降解、符合RNA-seq建庫標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組分析

1.2.5.1 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq) 以通過RIN值檢測的RNA為模板,使用Illumina的NEBNext? UltraTM RNA Library Prep Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,處理組及對照組的雌雄魚各設(shè)3個(gè)平行以滿足生物學(xué)重復(fù),共建立12個(gè)cDNA文庫。文庫構(gòu)建完成后,使用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量,使用Bioanalyzer 2100系統(tǒng)進(jìn)行文庫插入片段長度檢測;使用qPCR對文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。RNA-seq測序由北京諾禾致源公司完成,測序平臺為Illumina Novaseq 6000,測序讀長為150 bp。

1.2.5.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控和處理 使用Fastp (https://github. com/OpenGene/fastp. git) 軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測序質(zhì)量評估,評估內(nèi)容主要為Q20、Q30、GC含量和測序重復(fù)率等;然后使用Trimmomatic v0.36軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控[24],質(zhì)控內(nèi)容主要包括去除原始數(shù)據(jù)中的接頭、含N(無法確定堿基信息)的reads和低質(zhì)量的reads,質(zhì)控完成后的數(shù)據(jù)為clean data;再使用Hisat2(v2.1.0)軟件構(gòu)建參考基因組的索引文件用作數(shù)據(jù)比對模板[25],使用的參考基因組文件和基因注釋文件為紅鰭東方鲀基因組(NCBI, TakRub1. 2_genomic. gff:GCF_901000725. 2)。將clean reads與索引文件進(jìn)行比對;比對上的reads用Stringtie軟件進(jìn)行拼接[26],并用FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)值對轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.5.3 差異表達(dá)基因分析與功能富集 通過主成分分析(Principal component analysis,PCA)對所有個(gè)體表達(dá)譜的整體相似性和差異進(jìn)行可視化。用DEseq2軟件進(jìn)行處理組和對照組之間的差異表達(dá)分析[27]。對差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs)進(jìn)行篩選,標(biāo)準(zhǔn)為p<0.05同時(shí)|log2FoldChange|≥1。差異表達(dá)分析結(jié)果用熱圖和火山圖顯示。使用AnnotationHub軟件包對白消安處理產(chǎn)生的紅鰭東方鲀生殖腺的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)化[28],然后使用ClusterProfiler軟件包進(jìn)行GO(Gene Ontology)條目和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路的富集分析[29],GO條目的富集標(biāo)準(zhǔn)是富集結(jié)果p-adjust和q-value均小于0.4;KEGG通路的富集標(biāo)準(zhǔn)是p-adjust和q-value均小于0.1。結(jié)果用柱狀圖、氣泡圖顯示。使用ClusterProfiler軟件包進(jìn)行基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)探究KEGG中相關(guān)信號通路的調(diào)控趨勢[29],p值的閾值設(shè)定為0.05,結(jié)果使用pathview軟件包進(jìn)行可視化[30]。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用All-in-One 5×RT MasterMix(abm),37 ℃ 15 min,60 ℃ 10 min對建庫使用的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對6個(gè)重要的顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行定量驗(yàn)證,使用dld作為內(nèi)參基因,用Primer5設(shè)計(jì)定量PCR引物,引物序列見表1。使用2×SYBR Green PCR Master Mix試劑(TaKaRa)和Lightcycler 480 PCR儀(Roche)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)擴(kuò)增。結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析,顯著性使用 SPSS 20 軟件進(jìn)行分析,分析方法為獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),當(dāng)p<0.05時(shí)認(rèn)定為具有顯著性差異。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 白消安處理對性腺組織結(jié)構(gòu)的影響

組織學(xué)觀察顯示,白消安處理對紅鰭東方鲀雌雄性腺的影響效果存在顯著差異,白消安處理引起的紅鰭東方鲀的精巢退化明顯,而卵巢退化不明顯。在雄魚中,白消安處理組精巢發(fā)生明顯退化,曲細(xì)精管橫截面中的大部分精小囊顯示為空洞結(jié)構(gòu),其中的大部分生殖細(xì)胞被清除,空腔周邊僅存在少量精原細(xì)胞和支持細(xì)胞;雖仍有部分精小囊中充滿各種分化時(shí)期的生殖細(xì)胞,但這些不同的生殖細(xì)胞均聚集于精小囊中央(見圖1A)。與此相比,對照組精巢為正常的Ⅲ期發(fā)育狀態(tài),精小囊中以初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞為主,精小囊周邊含有少量精原細(xì)胞,而小囊內(nèi)側(cè)有少量分化的精細(xì)胞,但少有聚集于小囊空腔中央的精子(見圖1C)。在雌魚中,白消安處理組卵巢未出現(xiàn)明顯退化,卵巢內(nèi)充滿各期生殖細(xì)胞,以卵母細(xì)胞和前卵母細(xì)胞為主(見圖1B),對照組卵巢表現(xiàn)出正常的Ⅱ期發(fā)育形態(tài),第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞占大部分,且含有少量的第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞,大部分卵母細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則多邊形,細(xì)胞大小不一,具有皮質(zhì)液泡和卵黃顆粒(見圖1D)。實(shí)驗(yàn)組和對照組的卵巢在組織形態(tài)上無顯著差異,但對照組卵母細(xì)胞的染色為嗜堿性的藍(lán)色,而白消安處理組則為嗜酸性的粉紅色。

(A: 白消安處理組精巢 Testis from the busulfan treated group; B: 白消安處理組卵巢 Ovary from the busulfan treated group; C: 對照組精巢 Testis from the control group; D: 對照組卵巢 Ovary from the control group。Ca: 白消安處理后產(chǎn)生的空腔 Cavities formed after busulfan treatment; PS: 初級精母細(xì)胞 Primary spermatocyte; SV: 精小囊 Seminal vesicle; Sg: 精原細(xì)胞 Spermatogonium; SS: 次級精母細(xì)胞 Secondary spermatocyte; ST: 精細(xì)胞 Spermatid; SC: 支持細(xì)胞 Sertoli cell; PO: 初級卵母細(xì)胞 Primary oocytes; SL: 精小葉 Seminal lobule; Og: 卵原細(xì)胞 Oogonium。 N=3。)

2.2 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控

經(jīng)過高通量測序,在精巢組中平均獲得原始數(shù)據(jù)為4 470萬條,在卵巢組中平均獲得原始數(shù)據(jù)為4 840萬條;使用Fastp和Trimmomatic v0.36軟件對得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行評估和質(zhì)控,在精巢組和卵巢組分別得到平均為4 390萬和4 710萬個(gè)clean reads(見表2)。所有樣本數(shù)據(jù)的Q20均在97.8%以上、Q30均在94.2%以上、Mapping rate均在96.6%以上(見表2)。數(shù)據(jù)質(zhì)量符合要求,可用于后續(xù)分析。

表2 12個(gè)樣本的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)和序列比對結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3 樣本關(guān)系分析

通過PCA對數(shù)據(jù)降維進(jìn)行樣本相關(guān)性分析,結(jié)果顯示雌雄樣本的主成分1(Dim1 47.5%)分開并各自聚為一類,說明性別引起的差異大于白消安處理產(chǎn)生的差異(見圖2)。在主成分2(Dim2 14.8%)中,卵巢樣本全部聚類在一起,說明卵巢的處理組和對照組樣本之間差異較小;精巢處理組樣本全都聚類在一起,說明處理組樣本之間差異較小,白消安處理精巢獲得了較為一致的處理效果,而精巢對照組樣本聚類分離,說明對照組精巢樣本之間存在差異,可能是雄性個(gè)體間發(fā)育過程不夠一致(見圖2)。為了判斷精巢對照組樣本的個(gè)體差異是否會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾,分別選擇精巢和卵巢間、精巢對照組和處理組間及卵巢對照組和處理組間的差異基因進(jìn)行樣本間聚類分析,選擇標(biāo)準(zhǔn)為p值最小的前50個(gè)基因(見圖3—5)。結(jié)果顯示,白消安處理組和對照組雄性個(gè)體各自聚為一枝,且在總樣本分析中分枝最遠(yuǎn)(見圖3和4);卵巢處理組和對照組間出現(xiàn)了聚類混亂(見圖3),雌性個(gè)體OE1對聚類結(jié)果和差異基因的影響比較大(見圖3和5),而雄性樣本中不存在差異較大的個(gè)體。差異基因聚類分析說明PCA分析主成分2(Dim2 14.8%)中顯示的精巢對照組樣本差異主要由不響應(yīng)白消安處理的基因引起,其差異對白消安處理結(jié)果影響不大,對后續(xù)分析干擾較小。

(圓圈代表置信圈 Circle represents confidence circle。 OC: 卵巢對照組 Ovarian control group; OE: 卵巢處理組 Ovarian treatment group; TC: 精巢對照組 Testis control group; TE: 精巢處理組 Testis treatment group。)

(OC: 卵巢對照組 Ovarian control group; OE: 卵巢處理組 Ovarian treatment group; TC: 精巢對照組 Testis control group; TE: 精巢處理組 Testis treatment group。每一列代表一個(gè)個(gè)體,每一行代表一個(gè)基因。紅色代表該個(gè)體中基因上調(diào),藍(lán)色代表該個(gè)體中基因下調(diào),顏色越深代表上下調(diào)程度越強(qiáng)。Each column represents an individual, and each row represents a gene. Red represents the upregulation of genes in the individual, blue indicates the downregulation of genes in the individual. The deeper the color, the stronger the degree of upregulation or downregulation.)

(TC: 精巢對照組 Testis control group; TE: 精巢處理組 Testis treatment group。每一列代表一個(gè)個(gè)體,每一行代表一個(gè)基因。紅色代表該個(gè)體中基因上調(diào),藍(lán)色代表該個(gè)體中基因下調(diào),顏色越深代表上下調(diào)程度越強(qiáng)。 Each column represents an individual, and each row represents a gene. Red represents the upregulation of genes in the individual, blue indicates the downregulation of genes in the individual. The deeper the color, the stronger the degree of upregulation or downregulation.)

(OC: 卵巢對照組 Ovarian control group; OE: 卵巢處理組 Ovarian treatment group。每一列代表一個(gè)個(gè)體,每一行代表一個(gè)基因。紅色代表該個(gè)體中基因上調(diào),藍(lán)色代表該個(gè)體中基因下調(diào),顏色越深代表上下調(diào)程度越強(qiáng)。Each column represents an individual, and each row represents a gene. Red represents the upregulation of genes in the individual, blue indicates the downregulation of genes in the individual. The deeper the color, the stronger the degree of upregulation or downregulation.)

2.4 表達(dá)量差異分析

使用DEseq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析,在雄性白消安處理組和對照組中共篩選出25 876個(gè)unigenes,其中DEGs共576個(gè),包括223個(gè)下調(diào)表達(dá)基因和353個(gè)上調(diào)表達(dá)基因(見圖6A)。在雌性白消安處理組和對照組中共篩選出22 757個(gè)unigenes,其中DEGs共74個(gè),包括23個(gè)下調(diào)表達(dá)基因,51個(gè)上調(diào)表達(dá)基因(見圖6B)。雌雄樣本的顯著差異表達(dá)基因的數(shù)目差異說明白消安處理對精巢基因的轉(zhuǎn)錄水平影響大于卵巢。

(log2 FoldChange代表白消安處理組與對照組間各基因表達(dá)量的比值,對其取以2為底的對數(shù)。藍(lán)色代表顯著下調(diào)的基因,灰色代表未達(dá)到差異基因篩選的顯著性標(biāo)準(zhǔn)的基因,紅色代表顯著上調(diào)的基因。log2 FoldChange represents the ratio of gene expression levels between the busulfan treatment group and the control group, which calculated by taking the logarithm of the ratio using a base of 2. Blue indicates genes that were significantly down-regulated, gray represents genes that did not meet the significance criteria for differential gene selection, and red indicates genes that were significantly up-regulated.)

2.5 精巢差異表達(dá)基因的富集分析

比較精巢處理組和精巢對照組共篩選出25 876個(gè)unigenes,去除重復(fù)和無效基因后共獲得23 221個(gè)差異基因,進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)化后共獲得18 676個(gè)EntrezID用于富集分析。GO條目富集到119個(gè)子類別,其中在分子功能模塊中,發(fā)現(xiàn)連接酶活性(GO:0016874)、氧化還原酶活性(GO:0016491)、作用于配對供體的氧化還原酶活性,摻入或還原分子氧(GO:0016705)、雙加氧酶活性(GO:0051213)、單加氧酶活性(GO:0004497)等條目被顯著富集(見圖7)。KEGG通路富集分析顯示,差異基因被顯著富集到氧化代謝、DNA修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)等過程,其中與DNA修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)通路包括:同源重組(Homologous recombination, tru03440)、范可尼貧血通路(Fanconi anemia pathway, tru03460)、DNA復(fù)制(DNA replication, tru03030)、核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair,tru03420)、錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair, tru03430)等,而氧化代謝通路包括氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation, tru00190)(見圖8)。GSEA分析結(jié)果顯示,同源重組通路、范可尼貧血通路、錯(cuò)配修復(fù)通路相關(guān)基因的表達(dá)模式和enrichment score得分大于0,說明這些通路在白消安處理后受到上調(diào);而核苷酸切除修復(fù)和DNA復(fù)制通路相關(guān)基因的表達(dá)模式和enrichment score得分小于0,說明這些通路在白消安處理后受到下調(diào)(見圖9)。

圖7 雄性白消安處理組和對照組差異基因的結(jié)果在生物過程(A)細(xì)胞成分(B)和分子功能(C)中最富集的20個(gè)GO條目

圖8 雄性白消安處理和對照組差異基因的KEGG通路氣泡圖

(A和F分別是錯(cuò)配修復(fù)通路的GSEA和通路圖,顯示通路為上調(diào);B和G分別是范可尼貧血通路的GSEA和通路圖,顯示通路為上調(diào);C和 H 分別是核苷酸切除修復(fù)通路的GSEA和通路圖,顯示通路為下調(diào);D和I分別是同源重組通路的GSEA和通路圖,顯示通路為上調(diào);E和J分別是DNA復(fù)制通路的GSEA和通路圖,顯示通路為下調(diào)。A and F represent the Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) and Pathview diagram of the Mismatch repair pathway, showing an upregulation of this pathway. B and G represent the GSEA and Pathview diagram for Fanconi anemia pathway, showing an upregulation of this pathway. C and H represent the GSEA and Pathview diagram for the Nucleotide excision repair pathway, showing a downregulation of this pathway. D and I represent to the GSEA and Pathview diagram for the Homologous recombination pathway, showing an upregulation of this pathway. E and J represent the GSEA and Pathview diagram for the DNA replication pathway, showing a downregulation of this pathway.)

2.6 精巢差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-seq的準(zhǔn)確性,使用qPCR對hbae5、lnx1、mnat1、rpa3、wdr48、xrn2等差異表達(dá)基因進(jìn)行定量檢測。定量結(jié)果顯示,hbae5、mnat1、rpa3基因在白消安處理后表達(dá)顯著下調(diào),與對照組相比,倍數(shù)分別是31.19、2.59和3.56倍;lnx1、wdr48、xrn2基因在白消安處理后表達(dá)顯著上調(diào),與對照組相比,倍數(shù)分別是3.63、2.61和48.84倍;這些基因的表達(dá)趨勢與RNA-seq結(jié)果均一致(見圖10),證明測序數(shù)據(jù)可信度較高。

(A: hbae5; B: lnx1; C: mnat1; D: rpa3; E: wdr48; F: xrn2。同一圖中,左側(cè)為qPCR結(jié)果,右側(cè)為RNA-Seq 中的FPKM值。**號代表差異極顯著,p<0.01。 In the same figure, the left side represents the qPCR results, while the right side shows the FPKM values from RNA-Seq. ** highly significant difference,p<0.01.)

3 討論

魚類生殖細(xì)胞移植技術(shù)的方法不同于哺乳動(dòng)物、鳥類。在哺乳動(dòng)物和鳥類中,化療、X射線、γ射線以及高溫都可以促進(jìn)內(nèi)源性生殖細(xì)胞凋亡[21,31-32]。而對于魚類,其性腺、生殖系統(tǒng)都包被在腹腔中,難以使用放射療法對性腺進(jìn)行處理,因此魚類多使用高溫或多次注射白消安來對成魚受體生殖細(xì)胞進(jìn)行清除。這一方法在多種魚類中都有應(yīng)用,如高身麗脂鯉 (Astyanaxaltiparanae)[33]、哈奇氏牙漢魚(O.hatcheri)[11]、褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)[34]、尼羅河羅非魚(Oreochromisniloticus)[10]、塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)[35]等。

硬骨魚和哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞發(fā)育過程存在較大差異,很難預(yù)估白消安對硬骨魚性腺的處理效果,如在褐牙鲆中白消安對精巢產(chǎn)生了較強(qiáng)的作用效果[34],而在塞內(nèi)加爾鰨中對卵巢有更強(qiáng)的作用效果[35],因此,在不同魚類中使用白消安時(shí)需要摸索。為了探究白消安對紅鰭東方鲀性腺退化的作用,我們通過性腺組織細(xì)胞水平觀察和轉(zhuǎn)錄組分析對白消安處理效果和分子作用機(jī)制進(jìn)行探討。

有研究表明[36],在白消安處理過程中,小鼠睪丸激素水平保持恒定,小鼠的類固醇激素生成環(huán)境未改變,且在所有的時(shí)間點(diǎn)內(nèi),包括塞爾托利氏細(xì)胞(Sertoli cell)和萊迪希細(xì)胞(Leydig cell)在內(nèi)的體細(xì)胞在大小、形狀和定位上均表現(xiàn)正常,這表明白消安的作用不是通過介導(dǎo)內(nèi)環(huán)境激素水平變化或破壞內(nèi)環(huán)境造成的。這與我們在形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相符,在白消安處理紅鰭東方鲀精巢后,曲細(xì)精管橫截面的精小囊中生殖細(xì)胞幾乎被完全清除,最終形成空洞結(jié)構(gòu),而體細(xì)胞表現(xiàn)基本正常。

色譜研究結(jié)果表明,白消安通過鳥嘌呤-鳥嘌呤橋在DNA中產(chǎn)生交聯(lián)或在嘌呤堿基處產(chǎn)生單烷基化,其中交聯(lián)損傷可能比單烷基化更難修復(fù)[37]。由于DNA受到攻擊,細(xì)胞周期容易被阻斷在G2期[17],因此,具有細(xì)胞分裂活性、DNA活動(dòng)劇烈的細(xì)胞更容易受到白消安作用的影響。我們在KEGG通路中富集的途徑包含范可尼貧血通路(FA,tru03460),FA途徑在協(xié)調(diào)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起重要作用,這歸因于FA途徑的主要功能是去除DNA鏈間交聯(lián), 而鏈間交聯(lián)衍生的雙鏈斷裂常通過同源重組途徑(Homologous recombination,tru03440)實(shí)現(xiàn)修復(fù),該通路同樣被富集且顯示為上調(diào)表達(dá)。Mehta等認(rèn)為FA途徑可能與白消安作用有關(guān)[38],我們的結(jié)果也支持這一假設(shè)。FA途徑的Pathview可視化圖顯示,跨損傷合成(Translesion synthesis,TLS)處差異基因被富集且特異性上調(diào),DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)通路下調(diào);這暗示TLS可能在白消安引起的DNA損傷修復(fù)中起著重要的作用。

有報(bào)道證實(shí),白消安可能通過對正常DNA的鳥嘌呤和腺嘌呤N7位進(jìn)行烷基化[39],產(chǎn)生H2O2,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑,從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。此外,白消安還可以與谷胱甘肽形成綴合物導(dǎo)致谷胱甘肽消耗誘導(dǎo)氧化應(yīng)激(Oxidative stress,OS)或通過抑制硫氧還蛋白還原酶調(diào)節(jié)細(xì)胞OS[40]。這些因素都能導(dǎo)致活性氧(Reactive oxygen species, ROS)增加和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。本研究中,GO富集分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)氧化還原酶系統(tǒng)相關(guān)的分子功能條目,例如:氧化還原酶活性(GO:0016491),作用于配對供體、摻入或還原分子氧(GO:0016705),雙加氧酶活性(GO:0051213),單加氧酶活性(GO:0004497)等;在KEGG分析中富集到氧化磷酸化通路(tru00190)。

關(guān)于白消安對精巢的作用原理,Kim等認(rèn)為是由于精原細(xì)胞對白消安具有相對較高的抗性,而單倍體細(xì)胞如圓形精子細(xì)胞階段對烷化劑如環(huán)磷酰胺極為敏感。因此,包括精原細(xì)胞和精母細(xì)胞在內(nèi)的二倍體細(xì)胞可以抵抗白消安的細(xì)胞毒性,而單倍體生殖細(xì)胞如次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、圓形精子、成熟精子等則被耗盡[40]。在本研究中,基于組織學(xué)觀察和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,我們提出另外一種解釋,可能有兩種途徑共同作用于阻止精子發(fā)生。一方面,白消安在G2期阻滯具有有絲分裂增值能力的精原細(xì)胞,干擾精原細(xì)胞分化因子,從而影響精原細(xì)胞的分化,促進(jìn)精原細(xì)胞的休眠,進(jìn)而在精子發(fā)生的源頭產(chǎn)生遏制。另一方面,白消安會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生ROS,ROS可以攻擊生物分子導(dǎo)致酶失活、遺傳毒性損傷、細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡。同時(shí),白消安的Ⅱ期代謝產(chǎn)物g-谷氨酰脫氫丙氨酸甘氨酸(g-glutamyldehydroalanylglycine, EdAG)是具有親電部分的谷胱甘肽的脫氫丙氨酸類似物,其可能與蛋白質(zhì)結(jié)合并破壞蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能[19]。因此,白消安及其代謝產(chǎn)物都會(huì)導(dǎo)致谷胱甘肽消耗,進(jìn)一步增加ROS,最終造成了ROS濃度的大幅度增長,ROS濃度超過了自由基清除和抗氧化系統(tǒng)的承受范圍,最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激(OS)[41-42]。而精子和精細(xì)胞DNA的壓縮程度更高,DNA損傷防御和修復(fù)有限,導(dǎo)致精子和精細(xì)胞對OS高度敏感,劇烈增加的OS可能就會(huì)誘導(dǎo)精細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡,但具體結(jié)果尚需進(jìn)一步研究予以驗(yàn)證。

綜上所述,白消安作用于所有類型細(xì)胞,但精原細(xì)胞分裂分化受到DNA損傷修復(fù)的影響,精細(xì)胞受到OS的影響,從而在不影響睪酮水平和支持細(xì)胞變化的前提下清除了受體體內(nèi)的內(nèi)源生殖細(xì)胞[36, 43-47]。此外,白消安處理兩周后精巢組織雖然在組織形態(tài)學(xué)上為生殖細(xì)胞移植提供了生態(tài)位的空缺,但是組織內(nèi)環(huán)境仍然處于氧化應(yīng)激態(tài),這種氧化應(yīng)激態(tài)可能同樣會(huì)攻擊移植的生殖細(xì)胞,從而阻礙供體細(xì)胞的定植。因此,此時(shí)的組織仍然不適合立即進(jìn)行生殖細(xì)胞移植,應(yīng)繼續(xù)拉長恢復(fù)期或在白消安后補(bǔ)充還原性的藥劑如氨磷汀、谷胱甘肽來幫助組織恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

關(guān)于白消安處理在哺乳動(dòng)物和魚類卵巢的作用效果差異,可能與魚類卵子發(fā)生模式有關(guān)。大多數(shù)哺乳動(dòng)物雌性在胎兒期間就喪失了生殖細(xì)胞更新的能力,卵母細(xì)胞儲備量固定[48];多年生硬骨魚類與之不同,其生殖周期是以年為單位循環(huán)。卵巢根據(jù)其卵子發(fā)生模式可分為三種類型:全同步性、副同步性和非同步性。關(guān)于白消安對魚類卵巢的作用效果差異,可能與處理性腺的分化階段和發(fā)育時(shí)期有關(guān)。在褐牙鲆中,白消安處理對卵巢的作用效果弱于精巢[34];而在塞內(nèi)加爾鰨幼魚中,白消安處理對卵巢的作用效果強(qiáng)于精巢[35]。因?yàn)槿麅?nèi)加爾鰨幼魚時(shí)期的雌性性腺發(fā)育速度快于雄性性腺,推測快速發(fā)育期的卵巢對白消安更敏感[35]。紅鰭東方鲀卵巢為副同步性,其在卵子發(fā)生過程同時(shí)存在兩個(gè)以上的不同卵母細(xì)胞階段,且雌魚每年產(chǎn)卵一次[1]。在本研究中采用白消安處理兩齡半的亞成熟紅鰭東方鲀雌魚,此時(shí)卵巢處于非快速發(fā)育階段,處理效果不佳。由于魚類的精原細(xì)胞具有很強(qiáng)的發(fā)育可塑性并顯示出雙向分化潛能[49],因此,在XY性別決定型魚類中,當(dāng)將雄性生殖細(xì)胞成功移植到雌性受體中時(shí),理論上就可以在受體后代中獲得YY超雄魚。而紅鰭東方鲀雄魚性腺具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,培育超雄魚進(jìn)行全雄性育種可以顯著增加養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。為獲得白消安對卵巢更好的處理效果,需對處理時(shí)卵巢的發(fā)育時(shí)期、白消安處理的劑量和次數(shù)等進(jìn)一步探究。

4 結(jié)語

本研究采用白消安處理紅鰭東方鲀,使其雄魚精巢中的生殖細(xì)胞被大量清除,可作為生殖細(xì)胞移植的理想受體,用于借腹生子和良種選育;從分子水平提供了對白消安誘導(dǎo)性腺退化作用機(jī)制的新認(rèn)知,為在其他經(jīng)濟(jì)魚類中應(yīng)用細(xì)胞移植技術(shù)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。