李宸儀, 陳慕雁

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué)), 山東 青島 266003)

神經(jīng)肽是一種作用于神經(jīng)基質(zhì)的小型蛋白質(zhì)[1],由神經(jīng)肽前體蛋白切割而來[2-3],是動(dòng)物生理過程和行為的重要調(diào)節(jié)因子,可作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)在局部發(fā)揮作用,或作為激素系統(tǒng)性地發(fā)揮作用[4]。相較于脊椎動(dòng)物和陸生無脊椎動(dòng)物,神經(jīng)肽在海洋無脊椎動(dòng)物中研究起步較晚,相關(guān)研究主要集中在攝食、繁殖、運(yùn)動(dòng)、免疫、生長發(fā)育等方面[5-8]。

luqin型神經(jīng)肽最初因其在軟體動(dòng)物海兔(Aplysiacalifornica)腹神經(jīng)節(jié)左上象限的L5神經(jīng)元(the Left Upper Quadrant cells of the abdominal ganglion)中表達(dá)而得以命名[9-10]。此后,根據(jù)luqin型神經(jīng)肽前體和受體的序列相似性分析在兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了該家族的其他成員,但在后口脊索動(dòng)物中尚未見報(bào)道[11],相較于其他神經(jīng)肽信號(hào)系統(tǒng),針對(duì)luqin型神經(jīng)肽信號(hào)系統(tǒng)功能的研究較少,目前對(duì)功能表征的研究表明luqin型神經(jīng)肽是進(jìn)化上古老的攝食行為調(diào)節(jié)子[12-16],在運(yùn)動(dòng)[10,17]和繁殖[18-19]方面也有一定的調(diào)節(jié)作用。在對(duì)棘皮動(dòng)物的研究中,Yaez-Guerra等[10]利用原位雜交技術(shù)對(duì)成體紅海盤車(Asteriasrubens)不同組織中l(wèi)uqin型神經(jīng)肽前體ArLQP進(jìn)行了定位分析,并利用體外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步的功能表征,但尚未見luqin型神經(jīng)肽在棘皮動(dòng)物早期發(fā)育階段中的分布及表達(dá)特征的研究。

大多數(shù)棘皮動(dòng)物為間接發(fā)育類型,即在由變態(tài)過程過渡到生殖活躍的成年階段前,會(huì)經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)幼體階段[20],幼體和成年棘皮動(dòng)物具有完全不同的解剖結(jié)構(gòu)和生活方式。對(duì)棘皮動(dòng)物幼體中神經(jīng)肽及其前體進(jìn)行定位和定量分析,將豐富神經(jīng)肽信號(hào)系統(tǒng)在棘皮動(dòng)物幼體中潛在功能的認(rèn)識(shí),為棘皮動(dòng)物神經(jīng)肽的比較生理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。Mayorova等[21]利用整胚原位雜交技術(shù)對(duì)紅海盤車8種神經(jīng)肽前體(L型SALMFamide、F型SALMFamide、NGFFYamide、加壓素/催產(chǎn)素型、促甲狀腺激素釋放激素型、促性腺激素釋放激素型、降鈣素型和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素型)在羽腕幼蟲和短腕幼蟲發(fā)育階段的分布進(jìn)行了表征。結(jié)果表明,這8種神經(jīng)肽前體都在附著復(fù)合體中表達(dá),部分神經(jīng)肽前體的表達(dá)與纖毛帶相關(guān)。Wood等[22]利用原位雜交和免疫組化技術(shù)對(duì)紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)的9種神經(jīng)肽及其前體在其幼蟲中的分布表達(dá)進(jìn)行了研究,鑒定到表達(dá)一種或多種NP基因的幾個(gè)細(xì)胞亞群,它們主要位于頂端器官、臂基部、口周、纖毛帶以及中腸和前腸中。目前,關(guān)于刺參(Apostichopusjaponicus)早期發(fā)育階段神經(jīng)肽分布及表達(dá)特征的研究尚未見報(bào)道。

刺參是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象之一,具有很高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值,近年來刺參增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展的同時(shí)也帶來了巨大的挑戰(zhàn)。要保證刺參增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、高效發(fā)展,亟待深入開展刺參生物學(xué)特征尤其是神經(jīng)生理學(xué)的研究。本研究選取刺參典型的早期發(fā)育階段(囊胚期、原腸胚期、耳狀幼蟲期,樽形幼蟲期和五觸手幼蟲期[23-25]),利用免疫熒光和熒光定量技術(shù)初步探究了刺參luqin型神經(jīng)肽AjLQ及其前體基因AjLQP在刺參典型的早期發(fā)育階段的分布表達(dá)特征,以期為研究luqin型神經(jīng)肽在刺參早期發(fā)育階段中生理功能提供見解。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和處理

刺參典型早期發(fā)育階段的胚胎和幼體采自青島市膠南靈山衛(wèi)刺參養(yǎng)殖廠,將刺參胚胎或幼體于PBS中沖洗并置于4% PFA中4 ℃固定過夜,隨后依次用25%、50%、75%和100%甲醇進(jìn)行處理,處理好的樣品用于后續(xù)免疫熒光實(shí)驗(yàn)或置于-20 ℃甲醇中長期保存;用凍存管收集刺參早期發(fā)育階段的樣品,于液氮中速凍并保存在-80 ℃超低溫冰箱中,用于后續(xù)熒光定量分析。

1.2 抗體制備

針對(duì)AjLQ(KPYKFMRW-NH2)的一抗由Abmart (China) 生產(chǎn)。首先,化學(xué)合成多肽AjLQ并偶聯(lián)載體蛋白KLH,將其作為抗原來免疫兔子,處死后取血,進(jìn)行抗體抗原親和純化;然后,利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)驗(yàn)證一抗效價(jià)。

1.3 免疫熒光

用吸管將刺參不同發(fā)育階段的胚胎和幼體吸至載玻片,37 ℃烤片至樣品附著在載玻片上。3%過氧化氫處理25 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBST洗滌3×5 min,用5%山羊血清室溫封閉30 min,按一抗∶PBS=1∶200的比例稀釋,4 ℃孵育過夜(陰性對(duì)照為分別滴加PBS或免疫前血清或預(yù)吸收AjLQ的一抗)。PBST洗滌3×5 min,按二抗∶PBS=1∶2 000的比例稀釋二抗(FITC標(biāo)記, absin, China),室溫孵育50 min。PBST洗滌3×5 min,滴加DAPI染液(G-clone,China)孵育3 min;熒光顯微鏡 (Olympus, Japan) 觀察拍照。

1.4 總RNA提取

采用Trizol法提取早期發(fā)育各階段的刺參總RNA。將組織在液氮中研磨成細(xì)粉狀,加入Trizol (Vazyme, China),4 ℃,14 000 r/min離心10 min;取上清液加入到含氯仿的新離心管中,渦旋混勻15 s至乳濁液,靜置5 min;4 ℃,14 000 r/min離心15 min;吸取適量上清液至新的離心管,加入等體積異丙醇,上下輕輕顛倒混勻30 s后4 ℃靜置15 min;4 ℃、14 000 r/min離心10 min;倒去上清液,加入75%乙醇,輕彈管底使沉淀懸浮,上下顛倒數(shù)次后靜置5 min,4 ℃、12 000 r/min離心5 min,重復(fù)該步驟一次;倒去上清,14 000 r/min離心1 min。用槍頭吸干液體,室溫晾干10 min。根據(jù)沉淀的多少,加入適量DEPC水,溶解30 min后混勻。隨后立即使用Biodropsis BD-1000核酸分析儀(OSTC, China) 和瓊脂糖電泳(Liuyi, China) 檢測(cè)提取總RNA的濃度和質(zhì)量,保存于-80 ℃待用。

1.5 cDNA克隆與熒光定量

使用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒(Yeasen, China)對(duì)早期發(fā)育各階段的刺參胚胎和幼體cDNA進(jìn)行全長擴(kuò)增,使用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(Yeasen, China)和Corbett Rotoe-Gnen Q(Qiagen, Germany) qPCR儀進(jìn)行熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR),操作步驟參照試劑盒說明書。添加熔解曲線驗(yàn)證PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。以β-actin和β-tubulin為雙內(nèi)參,采用2-ΔΔCT方法分析AjLQP基因表達(dá)量的變化,利用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± S.E.M.)來表示相對(duì)表達(dá)量。P<0.05為差異顯著。所用引物序列如表1所示。

表1 熒光定量所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 AjLQ在刺參早期發(fā)育階段的分布特征

ELISA結(jié)果顯示了抗AjLQ抗體的效價(jià)(見圖1)。100 ng的AjLQ抗原肽與制備的抗AjLQ抗體在實(shí)驗(yàn)所用的1∶200稀釋度下仍具有較好的反應(yīng)性,而未與免疫前血清發(fā)生反應(yīng)。

(■:添加免疫前血清;●:將一抗稀釋相應(yīng)倍數(shù)后添加100 ng AjLQ抗原。每個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行兩次重復(fù),數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤?！? Adding pre-immune serum; ●: Adding 100 ng AjLQ antigen to primary antibody with corresponding dilution. Data represents mean±SEM from two replicates.)

在刺參早期發(fā)育階段,AjLQ免疫熒光陽性信號(hào)始見于旋轉(zhuǎn)脫膜囊胚期的間質(zhì)(見圖2 A)。發(fā)育至原腸胚時(shí),AjLQ分布于向內(nèi)凹陷的胚孔處(見圖2 B)。

(A: 囊胚期; B: 原腸胚期。 VP: 植物極; Me: 間質(zhì); Bl: 囊胚腔; Be: 胚孔。 比例尺: 50 μm。A: Blastula stage; B: Gastrula stage. VP: Vegetal pole; Me: Mesenchyme; Bl: Blastocoel; Be: Blastopore. Scale bars: 50 μm.)

刺參幼體從耳狀幼蟲期開始攝食[24,26]。在耳狀幼蟲早期,刺參幼蟲的消化道開始明顯分化,此時(shí)在口部可見AjLQ免疫熒光陽性信號(hào)(見圖3 A)。隨著耳狀幼蟲進(jìn)一步發(fā)育,可以觀察到AjLQ在口、食道、肛前環(huán)和肛門(見圖3 B)及前背脊、中背脊、后背脊和后側(cè)脊等處纖毛帶的陽性信號(hào)(見圖3 C),且多集中于幼蟲反口端。

(A: 耳狀幼蟲早期; B: 耳狀幼蟲中期; C: 耳狀幼蟲后期。 Mh: 口; Es: 食道; As: 肛門; PL: 口前環(huán); PL*: 肛前環(huán); AD: 前背脊; MD: 中背脊; PD: 后背脊; PL: 后側(cè)脊。 比例尺: 50 μm。 A: Early auricular stage; B: Middle auricular stage; C: Late auricular stage. Mh: Mouth; Es: Esophagus; As: Anus; PL: Preoral loop; PL*: Preanal loop; AD: Anterior dorsal ridge; MD: Mid-dorsal ridge; PD: Posterior dorsal ridge; PL: Posterior lateral ridge. Scale bars: 50 μm.)

在樽形幼蟲期,AjLQ主要分布于纖毛環(huán)和內(nèi)部器官團(tuán)中(見圖4 A)。在五觸手幼蟲期的纖毛環(huán)和口觸手中也觀察到了AjLQ免疫熒光陽性染色(見圖4 B)。

2.2 AjLQP在刺參早期發(fā)育階段的表達(dá)特征

如圖5所示,AjLQP在刺參囊胚期的表達(dá)量最低,在原腸胚期有所上升,耳狀幼蟲期表達(dá)量顯著高于其他4個(gè)階段(P<0.05)。

3 討論

本研究率先結(jié)合免疫熒光和熒光定量PCR技術(shù)解析了luqin型神經(jīng)肽在刺參典型早期發(fā)育階段——囊胚期、原腸胚期、耳狀幼蟲期、樽形幼蟲期和五觸手幼蟲期的定位特征,測(cè)定了luqin型神經(jīng)肽前體基因在這些早期發(fā)育階段的表達(dá)特征,為后續(xù)鑒定神經(jīng)肽在刺參早期發(fā)育階段的生理功能奠定基礎(chǔ)。

刺參luqin型神經(jīng)肽前體在耳狀幼蟲期顯著上調(diào)表達(dá),而耳狀幼蟲期的顯著特征之一是攝食開始[24,26],在刺參早期發(fā)育階段游泳、攝食相關(guān)組織[21](耳狀幼蟲的口、食道、肛前環(huán)、肛門和纖毛帶,樽形幼蟲和五觸手幼蟲的纖毛環(huán))中也發(fā)現(xiàn)了AjLQ免疫熒光陽性信號(hào),由此我們推測(cè)luqin型神經(jīng)肽可能參與刺參幼蟲的游泳和攝食調(diào)控。我們?cè)诖虆⒊审wluqin型神經(jīng)肽功能表征的研究中同樣發(fā)現(xiàn)luqin型神經(jīng)肽是刺參運(yùn)動(dòng)和攝食潛在的調(diào)節(jié)子(未發(fā)表數(shù)據(jù))。類似的,在對(duì)棘皮動(dòng)物成體的研究中,Yaez-Guerra等[10]利用原位雜交技術(shù)對(duì)成體紅海盤車不同組織中l(wèi)uqin型神經(jīng)肽前體ArLQP進(jìn)行了定位分析,發(fā)現(xiàn)ArLQP在成體海盤車運(yùn)動(dòng)器官(管足)、消化系統(tǒng)的賁門胃和幽門胃中有所分布,體外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明ArLQP可能參與了紅海盤車運(yùn)動(dòng)和攝食方面的調(diào)節(jié)[10]。此外,luqin型神經(jīng)肽類似的潛在功能也在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)[17]、綠頭蠅(Phormiaregina)[13-14]和蝦(Marsupenaeusjaponicus)[16]等物種中被報(bào)道。Nakano等[27]使用3種一抗對(duì)刺參幼體神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,在耳狀幼蟲、樽形幼蟲和五觸手幼蟲時(shí)期,沿纖毛帶/環(huán)觀察到大量陽性信號(hào),這與我們觀察到的luqin型神經(jīng)肽的免疫熒光陽性信號(hào)分布區(qū)域重疊。有研究發(fā)現(xiàn),棘皮動(dòng)物幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)可能通過控制纖毛帶的擺動(dòng)方向以及食道和幼蟲臂的肌肉組織來控制游泳和攝食[28],這暗示了包括AjLQ在內(nèi)的神經(jīng)肽作為神經(jīng)系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子,可能是通過控制纖毛擺動(dòng)從而調(diào)節(jié)刺參早期發(fā)育階段的游泳和攝食行為。本研究結(jié)果表明了luqin型神經(jīng)肽在棘皮動(dòng)物幼體和成體中的功能保守性,但仍需對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的藥理學(xué)表征。未來,神經(jīng)肽在棘皮動(dòng)物早期發(fā)育階段和成體中的比較生理學(xué)研究可以擴(kuò)充我們對(duì)神經(jīng)肽生理功能的認(rèn)知,并有助于理解神經(jīng)肽信號(hào)系統(tǒng)的進(jìn)化。

口觸手和管足是海膽、海參和海蛇尾幼蟲的主要粘附器官[29-30],而粘附對(duì)包括棘皮動(dòng)物在內(nèi)的海洋無脊椎動(dòng)物的生長發(fā)育至關(guān)重要[31]。有研究表明,粘附器官中與附著和分離相關(guān)的分泌細(xì)胞受神經(jīng)分泌樣細(xì)胞的調(diào)節(jié),在其中表達(dá)的神經(jīng)肽可能參與控制幼蟲的附著相關(guān)過程[21,32]。AjLQ在五觸手幼蟲期口觸手中的陽性表達(dá)表明其在幼體粘附過程中的潛在調(diào)控作用, Mayorova等[21]同樣發(fā)現(xiàn)紅海盤車的8種神經(jīng)肽前體(L型SALMFamide、F型SALMFamide、NGFFYamide、加壓素/催產(chǎn)素型、促甲狀腺激素釋放激素型、促性腺激素釋放激素型、降鈣素型和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素型)在羽腕幼蟲和短腕幼蟲附著復(fù)合體中的表達(dá),這表明神經(jīng)肽在棘皮動(dòng)物早期發(fā)育階段的潛在生理功能上有一定的共性。

4 結(jié)語

本研究利用免疫熒光和熒光定量技術(shù)初步探究了luqin型神經(jīng)肽信號(hào)系統(tǒng)在刺參典型早期發(fā)育階段的分布及表達(dá)特征。AjLQ免疫熒光陽性信號(hào)主要分布在游泳、攝食和附著相關(guān)器官中,AjLQP基因在刺參耳狀幼蟲期表達(dá)量達(dá)到最高且與其他階段有顯著性差異。研究結(jié)果提示,luqin型神經(jīng)肽可能參與了刺參幼蟲的游泳、攝食和附著調(diào)控。