包海蘭 朱 赟 徐 偉

銀屑病是一種常見的免疫炎癥性皮膚病,其患病率為0.1%～3.0%[1],發(fā)病機(jī)制尚不清楚,主要涉及免疫系統(tǒng)紊亂、血管新生和角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocytes,KC)增生、皮膚屏障功能受損等多個(gè)環(huán)節(jié)。其病理表現(xiàn)以KC的增殖、分化異常,角化不全區(qū)中性粒細(xì)胞聚集引起Munro微膿腫,真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張及周圍可見淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤為主要特征。銀屑病皮損處最先發(fā)生的是血管分布和形成異常。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF) 在血管生成過程中起重要調(diào)控作用。異常增殖的KC通過釋放VEGF、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-23(IL-23)等促進(jìn)皮膚血管的扭曲、增生及中性粒細(xì)胞向皮膚中的募集,進(jìn)一步加劇炎癥,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞在銀屑病皮損處聚集引起表皮過度角化。

目前西醫(yī)用于治療銀屑病外用藥物種類多樣,但相當(dāng)一部分患者仍然存在外用藥物的刺激性反應(yīng)或者耐藥現(xiàn)象,且部分藥物的不良作用,其使用的安全問題也不容小覷。特別是銀屑病進(jìn)行期患者,此期皮損較敏感,常伴有“同形反應(yīng)”,故應(yīng)用外用藥不當(dāng)更易激惹皮損,加重病情。本研究以清疕膏外用干預(yù)銀屑病樣小鼠皮損,觀察銀屑病樣小鼠皮損及細(xì)胞因子VEGFmRNA及蛋白表達(dá)水平的變化,探討清疕膏治療銀屑病的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c 雄性小鼠32只,8～12周齡,體質(zhì)量18～20 g,均為無特定病原體動(dòng)物(Specific Pathogen Free,SPF),由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物許可證編號SCXK(京)2016-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物咪哇莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品)清疕膏(地榆、牡丹皮、苦參等,加入凡士林基質(zhì),中藥材統(tǒng)一由內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院中藥房提供)。

1.3 主要試劑和儀器兔二步法檢測試劑盒(PV-9001)(中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗血管內(nèi)皮生長因子多克隆抗體(ab46154)(Abcam公司);Trizol試劑(15596-026)、TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)(日本Takara公司);SYBRTMSelect Master Mix(4472908),美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);PCR擴(kuò)增儀ABI9700PCR(美國ABI公司);PCR擴(kuò)增儀Agilent Mx3000P(美國Agilent公司);-80 ℃冰箱、恒溫箱3111(美國Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 銀屑病樣小鼠模型的制備BALB/c小鼠,刮除其背部毛發(fā),形成約2 cm×3 cm大小的暴露區(qū)域,飼養(yǎng)1 d 后采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組:空白對照組、模型組、清疕膏組及基質(zhì)對照組,每組8 只。除空白對照組外均予以造模,定時(shí)在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏 62.5 mg,每日1次,在實(shí)驗(yàn)天數(shù)內(nèi)涂抹于小鼠背上暴露區(qū)皮膚,連續(xù)給藥。

1.4.2 藥物干預(yù)模型組: 每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg; 正常對照組: 每日在小鼠裸露背部涂抹等量凡士林;治療組(清疕膏):每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg,同時(shí)間隔6 h涂抹清疕膏;安慰劑組(凡士林基質(zhì)):每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg,同時(shí)間隔6 h涂抹凡士林基質(zhì)。

1.4.3 標(biāo)本采集各組造模當(dāng)天給藥,連續(xù)7 d,于第8天取材。按照九格法各組剪取相對應(yīng)皮損處組織,將其分為2個(gè)部分:一部分固定4%多聚甲醛溶液,一部分存于凍存管置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,對計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),并描述均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)、最小值、最大值。正態(tài)分布的數(shù)據(jù),2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較且方差齊采用One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析,非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn),顯著性檢驗(yàn)水平α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠銀屑病樣皮損癥狀及嚴(yán)重程度指數(shù)評分比較空白對照組小鼠表現(xiàn)為皮膚表面光滑嫩薄,無鱗屑、紅斑及浸潤增厚等變化;與對照組相比,模型組小鼠皮膚隨著時(shí)間逐漸出現(xiàn)了紅斑、鱗屑及浸潤增厚等改變,紅斑出現(xiàn)較早,鱗屑由細(xì)小逐漸變成大塊鱗屑,形成典型的PS樣小鼠模型;清疕膏組小鼠隨時(shí)間增加表現(xiàn)為輕度紅斑、鱗屑及浸潤肥厚;基質(zhì)對照組小鼠皮損嚴(yán)重程度介于模型組和清疕膏組之間。根據(jù)改良小鼠銀屑病面積和疾病嚴(yán)重程度指數(shù)(Psoriasis Area and Severity Index,PASI) 評分法,每日照相并記錄觀察銀屑病樣小鼠皮損的動(dòng)態(tài)變化,借鑒臨床上使用的PASI 評分標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)用改良PASI評分法評估小鼠皮膚炎癥的嚴(yán)重反應(yīng)程度。實(shí)驗(yàn)期間由同一人進(jìn)行評估。評估內(nèi)容包括:紅斑、鱗屑和增厚。評分標(biāo)準(zhǔn)如下:0:無現(xiàn)象;1:輕度;2:中度;3:重度;4:極重度。總積分為紅斑、鱗屑以及增厚各項(xiàng)評分之和,對各組小鼠總積分取平均值進(jìn)行評估炎癥嚴(yán)重反應(yīng)程度并繪制皮損積分趨勢圖。各干預(yù)治療組積分在實(shí)驗(yàn)期間均小于模型組。其中,清疕膏組紅斑及浸潤積分在7 d內(nèi)都較低,鱗屑的積分在4 d后趨于平穩(wěn);基質(zhì)對照組各項(xiàng)評分均值介于清疕膏和模型組之間。

2.2 qPCR WB法檢測各組小鼠皮損組織VEGFmRNA及蛋白表達(dá)水平模型組銀屑病樣小鼠皮損中VEGFmRNA的相對表達(dá)量明顯高于空白組,清疕膏組銀屑病樣小鼠皮損中VEGF相對表達(dá)量均低于模型組和基質(zhì)對照組(P<0.05)。模型組小鼠皮損中VEGF的蛋白表達(dá)量較空白組顯著增高,清疕膏組皮損中VEGF蛋白表達(dá)量較模型組和基質(zhì)對照組蛋白表達(dá)量減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組小鼠皮損組織中VEGF基因及蛋白表達(dá)量比較 (只,

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病,以紅斑、鱗屑、增厚為主要特征,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,研究認(rèn)為Th17介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)釋放大量炎癥因子逐步浸潤KC,而KC受刺激活化后產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以吸引更多免疫效應(yīng)細(xì)胞浸潤局部皮膚,使局部皮膚發(fā)生了一系列的病理改變的異常,從而導(dǎo)致銀屑病皮損形成。銀屑病皮損最早出現(xiàn)的病理改變?yōu)檎嫫の⒀墚惓Ｔ錾?在表皮異常增殖增厚、炎癥浸潤等典型病理改變之前,真皮乳頭層血管已經(jīng)出現(xiàn)增生,迂曲擴(kuò)張。因此血管新生與微循環(huán)異常在銀屑病發(fā)病機(jī)制中起到重要作用,而血管增生與 VEGF 密切相關(guān)[2,3]。研究表明,銀屑病患者VEGF的表達(dá)在皮損、血液中被強(qiáng)烈上調(diào),證實(shí)其表達(dá)與PASI評分為正相關(guān),血清VEGF濃度與銀屑病活動(dòng)性之間的這種關(guān)聯(lián),被認(rèn)為是疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)[4,5]。研究表明,抑制VEGF可以對銀屑病起到治療作用[6,7],現(xiàn)有臨床銀屑病相關(guān)的VEGF抑制劑主要包括VEGF單克隆抗體(貝伐單抗和蘭尼單抗等)、VEGFR2拮抗劑(融合蛋白Valpha等)、酪氨酸激酶抑制劑(舒尼替尼、索拉非尼等),在臨床治療中取得一定療效。中藥外用治療銀屑病常以清熱解毒藥物為主,本研究以內(nèi)治之法指導(dǎo)外治之藥,結(jié)合局部皮損辨證,認(rèn)為銀屑病局部病機(jī)特點(diǎn)為血熱毒蘊(yùn)化瘀,并認(rèn)為銀屑病遷延難愈與瘀熱互結(jié)密切相關(guān),以涼血解毒通瘀理論指導(dǎo)銀屑病血熱證外用藥。清疕膏中藥物的有效化學(xué)成分,已經(jīng)證實(shí)具有抗銀屑病的作用,具有一定理論基礎(chǔ)。例如:地榆中有效成分沒食子酸可顯著降低銀屑病標(biāo)志物角蛋白16和角蛋白17的mRNA和蛋白表達(dá),能明顯改善銀屑病發(fā)病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)得分,降低銀屑病樣疾病小鼠的表皮增生[8]。牡丹皮有效成分丹皮酚[9]可能通過抑制VEGFR2/Akt/ERK 1/2信號通路和抑制IFN-γ、IL-1β、IL-6的分泌,從而對銀屑病相關(guān)的血管異常新生和炎癥反應(yīng)起治療作用。苦參有效成分氧化苦參堿具有抗炎及抑制某些細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用,可作為一種免疫抑制劑,抑制AKs/STATs 信號通路激活,對銀屑病有很明確的治療作用[10]。故擬通過研究清疕膏對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化,真皮血管增生的影響,以進(jìn)一步了解清疕膏在銀屑病治療中的作用機(jī)制,并為清疕膏用于銀屑病的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給予IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠出現(xiàn)了鱗屑、紅斑等表現(xiàn),在病理組織學(xué)上可見棘層肥厚、角化不全、角化亢進(jìn)及角化不全區(qū)可見Munro微膿瘍等,說明通過IMQ誘導(dǎo)干預(yù)的銀屑病樣小鼠模型建立成功[11]。實(shí)驗(yàn)期間,對模型組、清疕膏組及基質(zhì)組小鼠的進(jìn)行改良的銀屑病面積和嚴(yán)重程度評分,比較各組PASI評分,清疕膏組明顯低于模型組,對照組評分優(yōu)于IMQ組,但改善程度不如清疕膏組。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)基質(zhì)對照藥似乎有抗銀屑病的作用,這是由于其脂質(zhì)性成分,凡士林可以減少皮損表面的鱗片,改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中皮損表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)研究了清疕膏對VEGF的影響,清疕膏能夠明顯減輕皮損中VEGF蛋白及mRNA的表達(dá),與模型組及對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)清疕膏外用可能通過抑制KC細(xì)胞分泌VEGF,進(jìn)而減少了小鼠銀屑病樣皮損中VEGF的表達(dá),抑制真皮血管增生及KC的增殖、分化,而發(fā)揮了治療作用,從而清疕膏干預(yù)銀屑病的作用靶點(diǎn)。本研究探究涼血解毒通瘀理論指導(dǎo)中藥外用治療銀屑病的作用環(huán)節(jié)和效應(yīng)靶點(diǎn),初步證實(shí)該藥的作用機(jī)制,為銀屑病血熱證外用藥的治療及開發(fā)應(yīng)用提供理論支持,為今后的進(jìn)一步研究提供了證據(jù)與方向。