趙昕 杜玉瑤 殷子揚 毛淑紅

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1）又稱細胞色素P450 7A1酶，是肝臟特異性微粒體細胞色素P450家族7亞家族A成員［1］。在肝臟中，CYP7A1催化膽固醇轉(zhuǎn)化為7α-羥基膽固醇，從而促進膽汁酸的分解，CYP7A1為該反應(yīng)的限速酶［2］，對維持體內(nèi)膽固醇代謝平衡起到關(guān)鍵的作用，其在保障膽固醇正常攝取、運輸和轉(zhuǎn)化方面有極其重要的作用。在體內(nèi)，若膽固醇代謝異常易造成血管內(nèi)壁的膽固醇沉積，形成動脈粥樣硬化、膽結(jié)石等疾病，還可導(dǎo)致膽囊癌、結(jié)直腸癌等疾病的發(fā)生［3-4］。

22例攜帶GJB3基因c.538 C>T受檢者電話隨訪中，針對聽力情況特別是尖叫等高頻區(qū)域是否受損進行問詢，所有攜帶c.538的受檢者均表示聽力正常但未行耳鼻喉科專業(yè)檢查，其中包含1例c.538 C>T純合。GJB3基因c.538 C>T早期研究認為是常染色體顯性遺傳模式的高頻率聽力損失[7]，但后期對于GJB3基因變異是否致病尚存在爭議[8]，結(jié)合本次報道臨床對于GJB3基因c.538C>T的咨詢建議應(yīng)謹慎。

CYP7A1依賴于氧化酶和還原酶之間特定的電子傳遞鏈進行7位羥基化反應(yīng)［5］。CYP7A1電子傳遞機制如圖1，NADPH提供的兩個電子轉(zhuǎn)移到CPR的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）區(qū)域，F(xiàn)AD接受電子會引起CPR的構(gòu)象變化，使FAD接近黃素單核苷酸（FMN）區(qū)域，之后FAD處的電子轉(zhuǎn)移到FMN；隨后CPR分子恢復(fù)到原來的構(gòu)象，允許FMN與CYP7A1分子電荷結(jié)合位點相互作用［6-9］，然后電子流向CYP7A1的血紅素鐵區(qū)域，通過Fe=O機制介導(dǎo)膽固醇羥基化反應(yīng)［10］，CYP7A1催化反應(yīng)可表示為：NADPH+H++O2+膽固醇→NADP++H2O+7α-羥基膽固醇。

圖1 膽固醇7α-羥化酶的電子傳遞機理Fig. 1 Electron transport mechanism of cholesterol 7α-hydroxylase

7α-羥基膽固醇不僅是一種膽固醇代謝產(chǎn)物，而且對膽汁酸合成、炎癥和腫瘤等方面的治療都有重要的作用。7α-羥基膽固醇在肝臟中被轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而促進膽汁酸的合成和分泌［11］。此外，7α-羥基膽固醇可以減少炎性細胞浸潤，降低炎癥水平，從而起到抗炎作用［12］。最后，7α-羥基膽固醇可以抑制癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，具有一定的抗腫瘤作用［13］。因此構(gòu)建一株利用CYP7A1高效生產(chǎn)7α-羥基膽固醇的菌株具有極大的醫(yī)學(xué)價值和工業(yè)生產(chǎn)價值。

在構(gòu)建表達膽固醇7α-羥化酶的畢赤酵母基因工程菌株的基礎(chǔ)上，對7α-羥化酶進行理性設(shè)計與分子改造，對篩選獲得的高活性7α-羥化酶適配不同來源CPR，并在畢赤酵母中共表達，從而為7α-羥基膽固醇高效生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

氣相色譜-質(zhì)譜法（GC?MS）分析條件：升溫程序：初始溫度50℃，保持2 min，以5℃/min升到270℃，保持0 min，再以2.5℃/min升到290℃，保持0 min；再以10℃/min升到310℃，保持4 min，不分流進樣，流速1 mL/min。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性核酸內(nèi)切酶（BamH I、EcoR I、Sal I和Sac I）、Goldstar best DNA聚合酶、Solution I連接酶、DNA提取純化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品，膽固醇為Diamond公司產(chǎn)品，7α-羥基膽固醇為Genewiz公司產(chǎn)品。

1.2.5 膽固醇的轉(zhuǎn)化 在YPD培養(yǎng)基上選取構(gòu)建成功的重組菌株的單菌落，接種到30 mL YPG培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min的搖床培養(yǎng)24 h；按培養(yǎng)基2%接種量接種到50 mL BMGY培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，30℃、220 r/min的搖床培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)接到BMMY培養(yǎng)基，于30℃、220 r/min的搖床繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入0.01%底物膽固醇及1%誘導(dǎo)劑甲醇，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，期間每24 h添加甲醇至1%的濃度。取發(fā)酵液10 mL，并加入等體積乙酸乙酯輕微振蕩萃取，離心后取上層有機相，濃縮至500 μL，使用薄層色譜（TLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC?MS）及蒸發(fā)光分析產(chǎn)物的生成情況。

蒸發(fā)光檢測分析條件：流動相為純甲醇，進樣量10 μL，載氣流速2.2 mL/min，載氣溫度90℃。

只有肯在泥濘的小路上摸爬滾打，才有機會踏上鋪滿鮮花的大道。今年33歲的王振東，現(xiàn)任哈佳項目部總工程師。對于一個80后青年來說，這已經(jīng)是值得稱傲的成就了，但是踏遍工程現(xiàn)場的艱辛腳印向我們展示了他的成功當之無愧。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pPIC3.5K?CYP7A1（WT/突變型）的構(gòu)建 以合成的CYP7A1（WT）基因為模板，通過特異性引物（表1）PCR擴增克隆出WT基因及突變基因H111A、I114A、V281A、W284A和G485A，用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對以上片段和pPIC3.5K質(zhì)粒進行雙酶切，切膠回收產(chǎn)物經(jīng)Solution I連接酶過夜連接，將連接的產(chǎn)物化轉(zhuǎn)至大腸桿菌E. coli JM 109，以卡那霉素抗性篩選重組轉(zhuǎn)化子并測序。得到E. coli JM 109/pPIC3.5K?CYP7A1（WT/突變型）。

表1 CYP7A1基因野生型及突變型引物Table 1 Wild-type and mutant primers of CYP7A1 gene

1.2.2 畢赤酵母/pPIC3.5K?CYP7A1（WT/突變型）菌株的構(gòu)建 將測序正確的重組質(zhì)粒pPIC3.5K?CYP7A1（WT/突變型）用Sal I限制性核酸內(nèi)切酶單酶切線性化；電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，使用含0.5 mg/mL G418的YPD和2.0 mg/mL G418的YPD培養(yǎng)基篩選高拷貝菌株，提取菌株基因組進行PCR驗證，以獲得重組菌株。

1.2.3 不同來源CPR與CYP7A1共表達畢赤酵母菌株的構(gòu)建 將實驗室保存的5種含不同來源CPR的質(zhì)粒pPICZX?CPR用Sac I限制性核酸內(nèi)切酶單酶切線性化后電轉(zhuǎn)至含CYP7A1（WT）基因的畢赤酵母感受態(tài)細胞中；5種CPR分別為人源氧化還原蛋白（hCPR）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）來源氧化還原蛋白（ScCPR）、黑曲霉（Aspergillus nige）來源氧化還原蛋白（AnCPR）、大鼠來源氧化還原蛋白（RatCPR）及羅漢果來源氧化還原蛋白（SgCPR）；使用含300 μg/mL博來霉素的YPDS和2.0 mg/mL G418的YPD培養(yǎng)基篩選高拷貝菌株，提取菌株基因組進行PCR驗證，以獲得重組菌株。

1.2.4 G485A與SgCPR共表達畢赤酵菌株的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pPICZX?SgCPR用Sac I限制性核酸內(nèi)切酶單酶切線性化，將線性化的質(zhì)粒加入含CYP7A1（G485A）基因的畢赤酵母感受態(tài)細胞中，使用含300 μg/mL博來霉素YPDS和2.0 mg/mL G418的YPD培養(yǎng)基篩選高拷貝菌株，提取菌株基因組進行PCR驗證，以獲得重組菌株。

實際上，縱觀近幾年的郵品拍賣，只要是精品、珍品，就能引起買家的追逐，不僅成交相當活躍，而且市場潛力十分可觀。如被稱為我國“十大珍郵”之一的“全國山河一片紅”郵票，單枚價格的漲勢就十分驚人：早在1977年，就有150元一枚的身價；1987年，它的身價又漲至800元；到了1993年，成交價為3萬元；在1997年，北京的一場藝術(shù)品拍賣會上，一枚的成交價高達17萬元。2000年廣州國際郵票錢幣博覽會上，一枚《全國山河一片紅》郵票更是賣到18．5萬元。據(jù)業(yè)內(nèi)人士介紹，該郵票在拍賣場上，只要一亮相就深受藏家追捧，幾乎沒有流拍的事情發(fā)生。由此可見，只要投資者收藏有重大紀念事件方面的郵票，增值的可能性很大。

薄層色譜分析條件：展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，用含10%濃硫酸的無水乙醇噴灑TLC板，高溫加熱顯色后，可清晰分辨膽固醇及產(chǎn)物7α-羥基膽固醇所在的位置。

師：同學(xué)們，老師覺得作者很了不起，廣玉蘭樹形比較高大，我們平時看它只看到葉子，四季常青，感到冬季給我們帶來生機。但是陳荒煤卻不這樣認為，他覺得藏在葉子里面的花更有生機。因此他著意來描寫它。一株樹上的花數(shù)世同堂，生生不息。有四種形態(tài)，其實作者也是有所側(cè)重，寫出了別人看不到，想不到的地方。你覺得他想突出哪種形態(tài)是最有生命力？

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得全長人源CYP7A1基因（GenBank: NP_000771.2），由金唯智生物技術(shù)有限公司按照畢赤酵母密碼子偏愛性進行優(yōu)化合成。質(zhì)粒pPIC3.5K（含有卡那霉素抗性基因）、pPICZX（含有博來霉素抗性基因）、大腸桿菌Escherichia coli JM 109、畢赤酵母GS115均由本實驗室保存。

2 結(jié)果

2.1 重組畢赤酵母/pPIC3.5K?CYP7A1對7α-羥基膽固醇產(chǎn)率的影響

通常，根據(jù)測量方法來劃分，可以將地面三維激光掃描技術(shù)分成兩種，分別是移動式及固定式激光掃描系統(tǒng)。[2]其中，固定式激光掃描系統(tǒng)，與傳統(tǒng)測量中的全站儀是十分相似的，由內(nèi)置數(shù)碼相機、控制系統(tǒng)及激光掃描儀等多個部分組成。但是相對于全站儀來說，固定式激光掃描儀收集的是整個系列的“點云”數(shù)據(jù)信息，而不是分散的單點三維坐標，其主要特征是掃描面積大、速度較快、精準度較高以及具備良好的野外操作性。而移動式激光掃描系統(tǒng)，是以車載平臺為基礎(chǔ)，由慣性導(dǎo)航系統(tǒng)、全球定位系統(tǒng)與固定式三維激光掃描系統(tǒng)相結(jié)合而組成的。

薄層色譜定性分析結(jié)果（圖2）顯示，圖中藍色的樣品點為7α-羥基膽固醇，粉色的樣品點為膽固醇。畢赤酵母GS115即使在投底物膽固醇的情況下，也不會將膽固醇轉(zhuǎn)化為7α-羥基膽固醇，而重組菌株具有催化膽固醇生成目的產(chǎn)物7α-羥基膽固醇的能力。

ADP受體拮抗劑噻吩并吡啶抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和活化，通過與P2Y型特殊巰基受體結(jié)合，抑制ADP受體的激活，常用于臨床的有氯吡格雷、替格瑞洛和普拉格雷，有關(guān)專家在相關(guān)章節(jié)已經(jīng)闡述。需要指出的是正在服用氯吡格雷患者，如準備進行CABG，除非血運重建緊急程度大于出血風(fēng)險，擬行擇期冠狀動脈旁路移植術(shù)的患者，建議擇期手術(shù)前停用氯吡格雷5天～7天。

圖2 重組畢赤酵母催化膽固醇TLC結(jié)果圖Fig. 2 TLC analysis of biotransformation result of cholesterol catalyzed by recombinant P. pastoris

氣相色譜-質(zhì)譜法（GC?MS）定性分析結(jié)果顯示，圖3?A為7α-羥基膽固醇標品的質(zhì)譜圖，特征峰出現(xiàn)在m/z 456（分子離子峰）、129、95、73和57的位置。圖3?B為重組菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)譜圖，特征峰與7α-羥基膽固醇標品的質(zhì)譜圖的特征峰相同，證明重組菌株生成的產(chǎn)物為7α-羥基膽固醇。

圖3 重組畢赤酵母催化生成7α-羥基膽固醇的GC-MS分析圖Fig. 3 GC-MS analysis of the 7α-hydroxycholesterol catalyzed by recombinant P. pastoris

2.2 CYP7A1的分子改造對7α-羥基膽固醇產(chǎn)率的影響

將利用分子生物學(xué)改造獲得的5株突變株，進行催化膽固醇能力分析，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)TLC分析（圖2）、蒸發(fā)光檢測（圖4），與野生型相比發(fā)現(xiàn)，對111、114和284位點突變后酶的活性消失，說明這些位點對CYP7A1的活性有關(guān)鍵作用。對281和485的位點突變后，CYP7A1仍然具有活性，其中281位點的纈氨酸突變?yōu)楸彼岷?，活性稍有降低，為突變前?7.86%，而485位點的甘氨酸突變?yōu)楸彼岷?，活性提高，是野生型?08.71%，之后選取突變體G485A進行后續(xù)研究。

圖4 突變畢赤酵母產(chǎn)率比較圖Fig. 4 Production abilities of the mutants when compared with the wild type

2.3 不同來源CPR對重組畢赤酵母7α-羥基膽固醇產(chǎn)率的影響

將不同來源CPR與CYP7A1共表達，轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖5所示，ScCPR、AnCPR、hCPR、RatCPR和SgCPR都能與CYP7A1適配，所獲得的重組菌株催化膽固醇的能力均有提高，其中CYP7A1與SgCPR共表達使7α-羥基膽固醇的產(chǎn)率與CYP7A1野生型菌株相比提高了82.26%，但與人源CYP7A1同源的hCPR在共表達過程中適配性沒有SgCPR顯著。突變體G485A與SgCPR共表達畢赤酵母催化膽固醇的能力顯著提高，與CYP7A1野生型菌株相比，產(chǎn)物產(chǎn)率提高了133.79%，產(chǎn)量為0.25 mg/L。

將全長的人源CYP7A1基因在畢赤酵母中進行表達，將畢赤酵母全細胞催化的發(fā)酵液進行萃取濃縮，用于薄層色譜（TLC）和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC?MS）分析，檢測后確定發(fā)酵液中含有的產(chǎn)物為7α-羥基膽固醇。

圖5 CYP7A1與不同來源CPR共表達畢赤酵母對膽固醇轉(zhuǎn)化能力的影響Fig. 5 Effects of P. pastoris co-expressed with CYP7A1 and CPR from different sources on cholesterol conversion

3 討論

目前報道的膽固醇7α-羥化酶主要是在大腸桿菌中異源表達，但CYP7A1為膜蛋白，存在純化步驟復(fù)雜、純化蛋白濃度低、不能翻譯修飾蛋白等問題。而且為了實現(xiàn)羥化酶在大腸桿菌中的高效表達，需要將N末端跨膜錨定結(jié)構(gòu)域（氨基酸2-24）的氨基酸序列優(yōu)化為MAKKT［14］，并且為了在層析過程中溶解膜并保持蛋白質(zhì)解聚，需要在純化過程中添加表面活性劑，如Triton X?100、Emulgen 913等［15］。不僅如此，還需要使用辛基氨基瓊脂糖4B柱和陽離子交換層析等對蛋白進行進一步純化［16］。為避免復(fù)雜的蛋白純化步驟，實驗選取畢赤酵母為表達宿主，它能識別真核基因，幫助其進行轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾，并且可以通過高密度發(fā)酵提高CYP7A1表達量和催化效率［17］。

3.1 突變體提高7α-羥基膽固醇產(chǎn)量的分析

目前對CYP7A1分子對接的研究主要集中在酶活性位點［18］，而實驗是通過Discovery studio軟件的半柔性分子對接抓取與膽固醇小分子作用關(guān)鍵蛋白質(zhì)位點，定點突變?yōu)楸彼帷８鶕?jù)對接結(jié)果（圖6），選取5個位點定點突變?yōu)楸彼幔謩e得到H111A、I114A、V281A、W284A和G485A突變體，這些位點存在于CYP7A1活性口袋附近，主要作用力為疏水作用力以及氫鍵相互作用，疏水作用可以維持活性中心空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。對111、114及284位點突變后酶的活性消失，說明這些位點對CYP7A1的活性有關(guān)鍵作用，這些位點突變后可能改變了傳遞電子的能力或改變結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)等。對281及485突變后催化活性變低或變高，可能是由于氨基酸極性不同導(dǎo)致的活性不同，氨基酸可分為親水氨基酸和疏水氨基酸，親水氨基酸對水分子具有一定的親和性，疏水氨基酸對脂溶性物質(zhì)的親和性更高。由于膽固醇為非極性分子，根據(jù)“相似相溶”的性質(zhì)，較容易與疏水氨基酸相互作用。實驗中涉及的氨基酸極性從大到小的順序為：His＞Trp＞Gly＞Ala＞Val＞Ile，突變體485位點甘氨酸突變?yōu)闃O性更小的丙氨酸后，與膽固醇形成的疏水鍵的作用力更強，催化活性提高；突變體281位點纈氨酸突變?yōu)闃O性更大丙氨酸后，與膽固醇形成的疏水鍵的作用力減弱，催化活性降低；其次也可能是由于突變位點距離膽固醇C?7位距離的不同導(dǎo)致活性不同，突變位點與膽固醇分子對接位置如圖7所示。281位點與膽固醇C?17位上的側(cè)鏈相連，與C?7位距離較遠，而485位點與A環(huán)相連，與C?7位距離較近，改變485位點氨基酸的大小對催化C?7羥基化有較大的影響。綜上所述281和485位點可以作為改造位點，將其突變?yōu)楦邮杷陌被峄蚋淖?85位點氨基酸的大小會對酶與底物結(jié)合有進一步影響。

圖6 CYP7A1與膽固醇分子對接結(jié)果圖Fig. 6 Docking results of CYP7A1 and cholesterol molecules

圖7 CYP7A1與膽固醇分子對接結(jié)果的二維平面圖Fig. 7 2D floor plan of docking results of CYP7A1 and cholesterol molecules

3.2 CYP7A1（WT/突變型）與CPR適配提高7α-羥基膽固醇產(chǎn)量的分析

畢赤酵母為真核表達系統(tǒng)，自身含有CPR可幫助CYP7A1轉(zhuǎn)移電子，但通過異源表達不同來源的CPR可增加產(chǎn)物7α-羥基膽固醇的產(chǎn)量。實驗表明，ScCPR、AnCPR、hCPR、RatCPR和SgCPR與CYP7A1共表達菌株催化膽固醇的能力均有提高，并且SgCPR與G485A適配后催化能力更加顯著。雖然CPR的過表達能夠增強CYP7A1在畢赤酵母的羥基化水平，但并不是與CYP7A1基因同源的人源CPR與其適配性最好，可能是由于CYP?CPR相互作用時，不同CPR中的FMN結(jié)構(gòu)域附近特定殘基組成不同導(dǎo)致的，F(xiàn)MN區(qū)域正電荷氨基酸數(shù)量顯著影響其相互作用［19］。

既然幼兒園里吃到的水產(chǎn)品不足，那么家里就要每周至少吃一次水產(chǎn)品了。當然為了安全起見，應(yīng)給孩子吃刺少的魚比如龍利魚、鱈魚、桂魚。這里特別要注意一類海魚（如金槍魚、沙丁魚、三文魚），青皮紅肉，富含歐米伽3脂肪酸和蝦青素，是適合全家人的健康食品，但是這類魚同時富含組氨酸，如果加熱時間不夠長或者不新鮮都可能造成組胺中毒。所以，吃這類魚一定要選新鮮的，然后充分加熱。當然還可以吃蝦，建議把蝦去頭之后再做，因為重金屬都蓄積在蝦頭中。

因此在畢赤酵母中異源表達其他CYP450時，可添加外源CPR提高轉(zhuǎn)化率。根據(jù)相關(guān)文獻報道，CYP450與CPR相互作用中存在著一定的比例，選取合適的比例可以大大提高酶的催化活性［20］，因此進一步實驗可以通過CYP7A1適配不同濃度SgCPR，提高CYP7A1的轉(zhuǎn)化能力。

3.3 重組畢赤酵母中生產(chǎn)7α-羥基膽固醇的分析

重組畢赤酵母生產(chǎn)7α-羥基膽固醇，是通過膽固醇7α-羥化酶在畢赤酵母異源表達的催化膽固醇實現(xiàn)的，其難點在于7α-羥基膽固醇的產(chǎn)量很低，只有產(chǎn)物濃度濃縮10-20倍才可用儀器檢測到，因此并不是酶沒有表達，而是產(chǎn)物濃度低到難以用蒸發(fā)光等儀器發(fā)現(xiàn)。并且膽固醇為脂溶性物質(zhì)，難于進入細胞進行催化反應(yīng)，即使在助溶劑的幫助下其溶解度也很低，因此找到膽固醇進入細胞的更有效辦法，可顯著提高7α-羥基膽固醇產(chǎn)量。

4 結(jié)論

構(gòu)建CYP7A1異源表達平臺并對其轉(zhuǎn)化膽固醇能力進行研究，獲得全細胞催化膽固醇生產(chǎn)7α-羥基膽固醇的重組畢赤酵母菌株，通過定點突變及適配不同來源CPR進一步提高了7α-羥基膽固醇產(chǎn)量。實驗為7α-羥基膽固醇的高效生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)，也為CYP450的高效表達提供了有效方法。