王欣怡 王曉倩 王紅軍 晁躍輝

（1. 北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083；2. 北京泰德制藥股份有限公司，北京 100176）

1993年，Hamers?Casterman等［1］首次在駱駝血清中發(fā)現(xiàn)了一種新型抗體，被稱為重鏈抗體（heavy chain antibodies, HCAbs）。這種抗體由CH2、CH3、鉸鏈區(qū)和重鏈可變區(qū)（heavy chain variable domain,VHH）組成，天然缺失輕鏈和重鏈的CH1區(qū)（heavy chain constant region）。HCAbs的N端可變區(qū)，也稱為單域抗體（single domain antibody, sdAb），具有直徑約為2.5 nm和長度約為4 nm的尺寸，因其結(jié)構(gòu)簡單和尺寸小，也被稱為納米抗體（nanobody,Nb）［2］?？茖W(xué)家們在羊駝、單峰駝、美洲駝等駝科動物，以及鯊魚、鰩魚等軟骨魚中發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)構(gòu)的抗體［1,3］。

納米抗體是目前已知的具有完整功能、穩(wěn)定且能夠結(jié)合抗原的最小單位［4］。相較于常規(guī)抗體，納米抗體具有諸多優(yōu)點，例如相對分子質(zhì)量小、易于生產(chǎn)和改造、特異性和親和力高、穩(wěn)定性和可溶性高、組織滲透性強、易清除、易表達、免疫原性弱和能夠識別縫隙表位等［2,5-6］。因此，在基礎(chǔ)研究、分子成像、親和純化基質(zhì)、診斷試劑、新藥開發(fā)、疾病診斷和治療等領(lǐng)域，納米抗體具有廣泛的應(yīng)用。例如，納米抗體可作為腫瘤成像［7］和分子成像［8］的小分子探針、蛋白質(zhì)或大分子復(fù)合物的結(jié)晶伴侶［9］、理想的毒素中和劑［10］，以及用于癌癥治療的抗腫瘤藥物［11］。曹飛婷等［12］利用噬菌體篩選技術(shù)，成功篩選出抗小鼠IgG的納米抗體，并制備出特異性親和小鼠IgG的親和層析介質(zhì)。Orlov等［13］分離出抑制葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus, GFLV）的納米抗體Nb23，在煙草和葡萄砧木中穩(wěn)定表達并觀察到對GFLV的特異性抵抗力。Ahmadi等［14］總結(jié)了幾種蝎子毒液治療的抗毒劑，因具有較低的免疫原性和較高的體外穩(wěn)定性，納米抗體可以發(fā)展為下一代蝎子抗毒血清。Uchański等［15］通過將納米抗體嫁接到選定的支架蛋白質(zhì)上，以產(chǎn)生穩(wěn)定且有效折疊的單體嵌合體并開發(fā)了巨型抗體。

FLAG融合標簽是一個由8個氨基酸（Asp·Tyr·Lys·Asp·Asp·Asp·Asp·Lys）組成的親水性短肽，專門設(shè)計用于重組蛋白質(zhì)的免疫吸附純化工作［16］。利用FLAG融合標簽，可以建立一個基于融合多肽的高效檢測和純化系統(tǒng)，簡化蛋白質(zhì)的純化過程，控制蛋白質(zhì)固定的空間取向，并方便檢測和體內(nèi)生物事件的可視化，提高重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量、增強重組蛋白質(zhì)的可溶性和穩(wěn)定性等［17］。具有FLAG標簽的融合蛋白具有以下優(yōu)點：（1）序列短小，只需一條人工合成的寡核苷酸鏈即可編碼該抗原肽；（2）含有一個腸激酶切割位點，腸激酶可以識別該短肽C端的5個氨基酸（Asp·Asp·Asp·Asp·Lys），通過腸激酶處理除去標簽后可以獲得天然的非融合蛋白質(zhì)［16］；（3）融合在N端的FLAG序列很穩(wěn)定，且不會被大腸桿菌蛋白酶除去；此外，目的蛋白N端融合FLAG標簽后C末端還可以融合其他模塊；（4）融合有FLAG標簽的目的蛋白可直接通過FLAG進行親和層析，可純化有活性的融合蛋白且純化效率高；（5）抗FLAG的抗體可有效識別FLAG標簽，可以通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG標簽的融合蛋白進行檢測和鑒定［18］。然而，目前商品化的FLAG標簽抗體均為傳統(tǒng)類型的抗體，穩(wěn)定性差、不易保存、制備成本較高。因此，將FLAG標簽蛋白與納米抗體庫中的抗體進行相互作用篩選，可以快速、高通量地篩選出親和力較高和特異性較強的抗體。這對于FLAG標簽蛋白的檢測、定位和純化等方面具有十分重要的意義。

納米抗體篩選主要通過噬菌體展示技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù)兩種方法。噬菌體展示技術(shù)基于噬菌體的表面展示技術(shù)，通過將感興趣的抗原蛋白與噬菌體表面的蛋白進行融合，并使用噬菌體庫進行篩選，最終獲得與目標抗原高度特異性結(jié)合的納米抗體。該技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，能夠應(yīng)用于篩選各種抗原結(jié)合的納米抗體［19］。但噬菌體文庫的庫容非常大，其隨機多樣性可達107-109，篩選抗體需要特異、高效的篩選方法［20］。酵母雙雜交技術(shù)是利用酵母雙雜交系統(tǒng)進行篩選，該技術(shù)基于酵母細胞中的轉(zhuǎn)錄因子分為兩個部分：DNA結(jié)合域（DNA?binding domain, BD）和激活域（activation domain, AD），分別發(fā)揮結(jié)合DNA和激活轉(zhuǎn)錄的作用。將待篩選的納米抗體與AD域融合，而作為抗原的蛋白質(zhì)與BD域融合，分別連接到兩個不同的載體上，然后將這兩個載體一起轉(zhuǎn)染到酵母細胞中。若這兩個蛋白相互作用，則BD和AD結(jié)合形成一個功能完整的轉(zhuǎn)錄因子，激活其下游靶基因的表達，通過篩選生長特征正常的菌落，可以鑒定出這兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)具有靈敏度高、選擇性強、操作簡單等優(yōu)點，能夠篩選出高親和力的納米抗體［21］。噬菌體展示技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù)在納米抗體篩選方面各有優(yōu)劣。噬菌體展示技術(shù)可以直接篩選出抗原結(jié)合的納米抗體，具有高效性和高特異性，但是需要構(gòu)建大規(guī)模的噬菌體庫，且需要進行后續(xù)的體外生物學(xué)實驗。使用酵母雙雜交技術(shù)進行篩選，不需要構(gòu)建大規(guī)模的噬菌體庫，且可以在體內(nèi)進行篩選和驗證。由于酵母菌屬于真核細胞生物，所以與噬菌體表面展示技術(shù)相比，能夠更好地維持抗原抗體的生物活性。

在本研究中，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選、表達和驗證，成功獲得了兩株具有特異性識別FLAG標簽蛋白能力的納米抗體。這種簡便易行的FLAG標簽技術(shù)具有很好的應(yīng)用潛力，而納米抗體的制備和驗證為FLAG標簽技術(shù)的更廣泛應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的駝源納米抗體文庫為北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院構(gòu)建并保存。限制性內(nèi)切酶Sma I、Xba I和Bgl II，酵母轉(zhuǎn)化試劑盒等購買于TaKaRa公司。細胞質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒等購買于OMEGA公司。彩色預(yù)染蛋白Marker（10-170 kD）、原核表達菌株BL21購買于上海碧云天生物技術(shù)公司。鼠源Anti?Strep Tag II、HRP?conjugated Goat Anti?Mouse lgG、兔源HRP?conjugated Anti?Camelid VHH抗體購買于生工生物工程公司。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、酵母菌Y2H Gold及Y187菌株等均為北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 應(yīng)用軟件Primer Premier 5進行引物設(shè)計，其中pGBKT7?FLAG?F和pGBKT7?FLAG?R用于FLAG標簽酵母雙雜交篩庫載體的構(gòu)建；pCold?VHH?F和pCold?VHH?R用于原核表達載體的構(gòu)建（表1）。

表1 本試驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

1.2.2 pGBKT7?FLAG載體的構(gòu)建 使用pGBKT7?FLAG?F和pGBKT7?FLAG?R引物，通過鏈間退火的方法使兩條反向互補引物，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，具體操作為：95℃ 5 min；?0.2℃/s，25℃ 5 min。提取pGBKT7質(zhì)粒在30℃條件下使用Sma I酶切15 min；使用DNA純化試劑盒，純化并回收酶切產(chǎn)物，使用無縫連接酶在50℃條件下，將酶切及復(fù)性產(chǎn)物連接15 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中并涂布在含卡納霉素的LB固體培養(yǎng)基上。使用通用引物T7 promoter和3′BD對單菌落進行PCR鑒定，并將陽性單克隆菌落送至生物技術(shù)公司測序，將測序正確的載體命名為pGBKT7?FLAG。

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化 使用質(zhì)粒提取試劑盒從測序正確的大腸桿菌中提取pGBKT7?FLAG質(zhì)粒，并使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒將pGBKT7?FLAG轉(zhuǎn)入到Y(jié)2H Gold酵母菌株中，涂布在SD/?Trp固體培養(yǎng)基上，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱直至出現(xiàn)單菌落，挑取單克隆酵母菌落，經(jīng)PCR檢測后保存測序正確的pGBKT7?FLAG酵母菌液。

1.2.4 酵母雙雜篩選 將含有pGBKT7?FLAG的Y2H Gold酵母菌搖菌，離心棄上清后用SD/?Trp液體培養(yǎng)基重懸浮，加入納米抗體文庫菌液（酵母菌Y187）和2×YPDA液體培養(yǎng)基，放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度設(shè)置為29.5℃，時間為20 h，培養(yǎng)結(jié)束離心棄上清，并使用0.5×YPDA液體培養(yǎng)基重懸浮后，涂布于四缺培養(yǎng)基SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade/X?α-Gal/AbA，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4 d后，挑取生長狀態(tài)良好且呈現(xiàn)藍色的單菌落進行擴大培養(yǎng)，并提取酵母質(zhì)粒。使用引物T7 promoter與3′AD進行PCR檢測，將含有陽性條帶的質(zhì)粒送至北京睿博興科生物公司測序，并保存測序結(jié)果。

1.2.5 “點對點”驗證 將能夠在四缺培養(yǎng)基上正常生長，并且呈現(xiàn)藍色的單菌落，提取酵母質(zhì)粒，使用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒將提取的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)入到Y(jié)187酵母菌株中，涂布在SD/?Leu培養(yǎng)基進行篩選，單克隆菌落經(jīng)PCR檢測和測序后，進行保存，以備后續(xù)使用。將重新轉(zhuǎn)化的Y187酵母菌分別與含有誘餌載體pGBKT7?FLAG、pGBKT7空載Y2H Gold酵母菌分別組合進行酵母有性雜交，然后將每個組合分別稀釋10倍、100倍、1 000倍，將稀釋后的菌液吸取10 μL分濃度梯度涂于四缺培養(yǎng)基SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade/X-α-Gal/AbA上，放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3-4 d后，觀察并記錄分析菌落生長狀態(tài)及顏色變化。

1.2.6 原核表達載體構(gòu)建 由于pGADT7 AD與pCold?SUMO載體，均含有氨芐青霉素抗性基因，為了防止載體自身的干擾，使用Xba I和Bgl II對含有納米抗體的酵母載體進行雙酶切處理。以酶切產(chǎn)物為模板，使用pCold?VHH?F和pCold?VHH?R為引物進行PCR反應(yīng)，使用無縫連接酶將PCR產(chǎn)物連接到pCold?SUMO，具體步驟：pCold?SUMO質(zhì)粒在37℃條件下使用Kpn I酶切15 min，將PCR及酶切產(chǎn)物純化后使用無縫連接酶，50℃條件下連接15 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中并涂布在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上。經(jīng)過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，使用pCold?f和pCold?r為引物進行PCR檢測，送至北京睿博興科生物公司測序。對測序正確的大腸桿菌提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細胞，以備進行表達使用。

1.2.7 納米抗體的原核表達及檢測 取含有正確納米抗體序列的大腸桿菌BL21單菌落，接種于20 mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌至OD600為0.4-0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，調(diào)整溫度為14℃低溫誘導(dǎo)過夜，收集菌體，超聲破碎后，取上清進行SDS?PAGE分析。將超聲破碎后的上清樣品進行SDS?PAGE電泳，將凝膠與大小適當?shù)腘C膜組裝膜轉(zhuǎn)移裝置后置于冰內(nèi)，60 V轉(zhuǎn)膜40 min后調(diào)至120 V轉(zhuǎn)膜30 min，將NC膜轉(zhuǎn)移至含5%脫脂奶粉TBS封閉緩沖液放置于搖床上1 h后，將NC膜轉(zhuǎn)移至含5%脫脂奶粉TBST溶液中，加入1 μL的鼠源Anti?Strep Tag II單克隆抗體，放置于37℃恒溫振蕩器孵育1 h。用TBST溶液漂洗3遍，每次5 min，再將NC膜轉(zhuǎn)移至含5%脫脂奶粉的TBST溶液中，加入1 μL的HRP?conjugated Goat Anti?Mouse lgG二抗，放置于37℃恒溫振蕩器孵育30 min，用TBST溶液漂洗5遍，每次5 min，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，使用BioRad超靈敏化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)進行觀察，以未進行低溫誘導(dǎo)的樣品為陰性對照。使用Strep?tag II抗體磁珠對表達的表達蛋白進行純化，純化產(chǎn)物放置于4℃冰箱以備后續(xù)研究。

1.2.8 抗體的Western blot驗證 為了驗證制備的納米抗體的效果，分別吸取2 μL FLAG多肽、NAP?FLAG（融合FLAG標簽的紫花苜蓿MsNAP蛋白）、UFO?FLAG（融合FLAG標簽的紫花苜蓿MsUFO蛋白）、Tag標簽（含有16種標簽的蛋白質(zhì)，P0059，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、NAP（紫花苜蓿MsNAP蛋白）、UFO（紫花苜蓿MsUFO蛋白）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）、紫花苜?？偟鞍讟悠伏c樣于NC膜上，待樣品晾干后，取5 μL轉(zhuǎn)膜液覆蓋住樣品并再次晾干。以制備的納米抗體為一抗，兔源HRP?conjugated Anti?Camelid VHH為二抗，進行Western blot檢測。同時，以商品化的常規(guī)FLAG抗體為對照。

2 結(jié)果

2.1 酵母雙雜交篩選結(jié)果

將構(gòu)建好的pGBKT7?FLAG轉(zhuǎn)化至酵母Y2H Gold中，以FLAG標簽作為誘餌蛋白，對實驗室保存的含有FLAG納米抗體的酵母文庫進行篩選。通過酵母雙雜交操作，共計篩選到52個陽性克?。▓D1），通過PCR檢測、測序分析、序列比對、合并重復(fù)序列，初步確定5個FLAG納米抗體序列。

圖1 FLAG標簽酵母雙雜交篩選Fig. 1 Yeast two-hybrid screening of FLAG tag

2.2 序列分析

基于測序結(jié)果，使用DNA Man軟件，將DNA序列轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)序列。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，所獲得的5個納米抗體序列，長度為123-129 aa，符合駝源納米抗體結(jié)構(gòu)，其N端為駝源重鏈單域抗體（variable domain of heavy chain of heavy?chain antibody,VHH）保守序列“QVQLQSEGG”，C端為“TQVTVSSA”或“TLVTVSSA”。所有序列均含有4個骨架區(qū)（frag?ment region, FR）及3個抗原互補決定區(qū)（complemen?tarity determining region, CDR）（圖2）。

圖2 FLAG標簽納米抗體序列及結(jié)構(gòu)Fig. 2 Sequences and structures of FLAG-tag nanobody

2.3 酵母雙雜交點對點驗證

為了排除pGBD T7載體自身存在的假陽性干擾，需要對篩選的5個納米抗體進行進一步驗證。通過“點對點”分析顯示（圖3），5個含有納米抗體的Y187酵母菌，能夠分別與含有FLAG標簽的Y2H Gold酵母菌結(jié)合，同時在SD/?Trp?Leu?His?Ade/X?α-Gal/AbA能夠正常生長，而且呈現(xiàn)藍色；而僅含有pGBKT7空載的Y187酵母菌與含有FLAG標簽的Y2H Gold酵母菌結(jié)合后，雖然能夠在四缺培養(yǎng)基上生長，但是菌體卻不能呈現(xiàn)藍色。以上結(jié)果表明，所篩選的5個納米抗體能夠識別FLAG標簽，但不能識別GAL4蛋白質(zhì)的BD結(jié)構(gòu)域。

圖3 互作蛋白酵母雙雜交驗證Fig. 3 Yeast two-hybrid assay for protein-protein interaction

2.4 納米抗體原核表達

將5個納米抗體DNA序列連接至pCold?SUMO載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用pCold?F和pCold?R為引物，進行PCR檢測，結(jié)果（圖4）顯示，構(gòu)建的5個載體均能擴增出與預(yù)期大小一致的PCR條帶，初步顯示原核表達載體構(gòu)建成功。將檢測陽性的大腸桿菌送至北京睿博興科生物公司測序，結(jié)果顯示用于所構(gòu)建的5個原核表達載體序列正確，納米抗體原核表達載體構(gòu)建成功。

圖4 納米抗體原核表達載體PCR檢測Fig. 4 PCR detection of prokaryotic expression vector for nanobodies

將5種納米抗體的原核表達載體轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)低溫誘導(dǎo)過夜，收集菌體，超聲破碎，取5 μL上清液進行SDS?PAGE檢測，經(jīng)考馬斯亮藍染色，結(jié)果（圖5）顯示，僅有Nano?FLAG6和Nano?FLAG7成功表達出了可溶性納米抗體蛋白。

圖5 原核表達Fig. 5 Prokaryotic expression

為了確定蛋白表達成功，利用原核表達載體上的Strep?tag II標簽，對融合蛋白質(zhì)進行Western blot分析，結(jié)果（圖6）顯示，Nano?FLAG6和Nano?FLAG7均能被檢測出一條單一、清晰的雜交條帶，而作為陰性對照的兩個樣品，沒有任何雜交信號。以上結(jié)果表明，Nano?FLAG6和Nano?FLAG7均表達成功。

圖6 Western blot檢測Fig. 6 Western blot detection

2.5 表達抗體的Western blot驗證

對不同的蛋白質(zhì)樣品進行Western blot檢測，一抗為Nano?FLAG6和Nano?FLAG7原核表達的上清提取液，二抗為兔源HRP?conjugated Anti?Camelid VHH。檢測結(jié)果（圖7）顯示，兩種通過原核制備的納米抗體，均能成功識別含有FLAG標簽及含有FLAG標簽的蛋白質(zhì)，而作為陰性對照蛋白樣品NAP蛋白質(zhì)、UFO蛋白質(zhì)、BSA以及紫花苜蓿全蛋白，均不能被制備的納米抗體識別。該結(jié)果表明，成功制備了FLAG標簽的納米抗體，而且該納米抗體具有極高的特異性。

圖7 納米抗體Western blot驗證Fig. 7 Western blot validation of nanobodies

3 討論

本研究成功通過酵母雙雜交技術(shù)，從駝源納米抗體文庫中篩選出具有特異性識別FLAG標簽蛋白的納米抗體。經(jīng)過表達、驗證分析，獲得了兩株具有高特異性和親和力的抗FLAG標簽蛋白納米抗體。通過“點對點”驗證和原核表達Western blot分析，制備出含抗FLAG標簽蛋白的納米抗體，為FLAG標簽的更廣泛應(yīng)用提供了理論參考和技術(shù)支持。

3.1 FLAG標簽抗體

抗標簽蛋白抗體作為研究相應(yīng)融合蛋白的主要方法之一，具有很高的實用價值。然而，目前用于檢測和純化這些融合蛋白的商品化抗標簽蛋白抗體種類較少、價格較高、穩(wěn)定性較差、不易保存。因此，制備抗FLAG標簽的特異性納米抗體，可以滿足融合蛋白實驗研究的需求，發(fā)揮重要作用。本研究還可作為一種技術(shù)平臺，為其他多種帶標簽蛋白納米抗體的制備提供技術(shù)支持，并探討不同方法制備抗FLAG標簽納米抗體的效果與作用。隨著對FLAG短肽研究的深入和新型抗體的開發(fā)，F(xiàn)LAG標簽的應(yīng)用將會越來越廣泛。

3.2 FLAG納米抗體篩選

納米抗體篩選技術(shù)包括噬菌體展示、酵母雙雜交、mRNA展示、高通量測序和質(zhì)譜分析等［2］。酵母雙雜交技術(shù)是一種簡便、高效、快速篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的方法［22］。2013年，F(xiàn)u等［23］設(shè)計并構(gòu)建了一個駱駝科動物單鏈抗體酵母雙雜交文庫，并成功篩選出具有高親和力的抗豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）Cap蛋白的納米抗體，該工作為研究豬圓環(huán)病毒2型的診斷和治療提供新的工具和方法。Gao等［24］利用酵母雙雜交技術(shù)篩選抗紐卡斯爾病毒（Newcastle disease virus, NDV）血凝素-神經(jīng)氨酸酶（haemagglutinin?neuraminidase,HN）蛋白的納米抗體。本研究中，通過酵母文庫篩選出特異性強、親和力高的納米抗體，并通過Western blot等方法進行檢測和鑒定分析。通過酵母雙雜交分析，從駝源中獲得的5個納米抗體序列，長度在123-129 aa之間，同時在N端和C端分別含有納米抗體的保守序列；進一步的序列分析揭示了每個納米抗體序列都含有4個骨架區(qū)和3個抗原互補決定區(qū)。骨架區(qū)和抗原互補決定區(qū)是納米抗體與抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位，骨架區(qū)提供了穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，而抗原互補決定區(qū)是抗體和抗原特異性結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。表明了這些納米抗體與常見駝源納米抗體結(jié)構(gòu)的一致性［25］，這些特征說明這些序列可能在抗體的識別和穩(wěn)定性方面起到關(guān)鍵的作用，這些發(fā)現(xiàn)為理解駝源納米抗體的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的視角，這對開發(fā)更有效的抗體療法具有重要意義。

3.3 FLAG抗體融合表達

含標簽融合蛋白是由目的蛋白和標簽共同構(gòu)成的蛋白嵌合體，具有許多優(yōu)點，如有利于外源目的基因的有效翻譯和表達、保持目的蛋白天然構(gòu)象、避免重組蛋白降解、便于檢測和純化等［26］。常見的標簽包括His標簽、FLAG標簽、Strep?tag II標簽、GST、MBP、Ub和SUMO等［27］。如姜茵等［28］利用GST融合基因表達系統(tǒng)表達了幽門螺桿菌Catalase融合蛋白，李志要等［29］利用豬源SUMO3標簽蛋白可溶性表達豬腺病毒3型的Hexon基因高變區(qū)蛋白。SUMO標簽除具有傳統(tǒng)融合標簽的特性外，還具有分子小、促進折疊、能被SUMO蛋白酶1專一性識別、對熱和蛋白酶有很強的抗性、有利于保持目的蛋白的穩(wěn)定性等優(yōu)勢［30］。Strep?tag II系統(tǒng)的純化條件比較寬泛，因為其在純化過程中不依賴金屬離子，Strep?tag II也適合含金屬離子蛋白質(zhì)的純化［31］。本研究利用含SUMO和Strep?tag II標簽的pCold?SUMO載體進行原核表達，并利用原核表達載體上的Strep?tag II標簽對融合蛋白質(zhì)進行了Western blot分析。

3.4 抗體效果驗證

Western blot分析是進行蛋白質(zhì)檢測的重要手段，而外源蛋白質(zhì)的可溶性表達，對于維持蛋白質(zhì)的生物活性具有重要意義［32-33］。利用表達的納米抗體的融合標簽進行檢測，通過分析發(fā)現(xiàn)，使用Strep?tag II抗體，能夠檢測出6號和7號納米抗體在上清中成功表達。這一結(jié)果為制備兩種納米抗體，并為進一步評估這些納米抗體的功能提供了關(guān)鍵工具。然而，在后續(xù)的研究中仍需要深入探討其他3種納米抗體在原核表達系統(tǒng)中的表達效率較低的原因，并對Nano?FLAG6和Nano?FLAG7進行更多的功能性和療效性研究。由于使用了Strep?tag II標簽，以及在進行納米抗體純化的時候購買的磁珠吸附能力及純化效率低下等原因，導(dǎo)致僅僅富集了很少量的蛋白質(zhì)，鑒于此情況，可以考慮后續(xù)將Strep?tag II標簽更換為其他標簽，如6×His標簽等，進行納米抗體的大量制備及純化。

制備的納米抗體，需要進行抗體效果檢測，Western blot是進行抗體檢測的最簡單、有效的方法［34］。利用成功制備的納米抗體，并以商品化的FLAG標簽抗體作為對照，通過WB來分析抗體效果。經(jīng)過檢測，在所有測試的樣品中，只有含有FLAG標簽的蛋白質(zhì)被成功識別，而陰性對照組包括NAP蛋白質(zhì)、UFO蛋白質(zhì)、BSA以及紫花苜蓿全蛋白均未被識別，這一結(jié)果進一步確認了本研究所制備的納米抗體對于FLAG標簽的高度特異性。以上結(jié)果表明，通過篩選及制備納米抗體，來進行蛋白質(zhì)的Western blot檢測是可行的。為了進一步檢測抗體的效果，在未來工作中應(yīng)對抗體進行其他研究，如免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（co?inmunoprecipitation, CoIP）、染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）等。

總之，本研究為后基因組時代大量涌現(xiàn)的新分子的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了重要的工具。通過酵母雙雜交技術(shù)篩選、表達、驗證分析，以及制備含抗FLAG標簽蛋白的納米抗體，為應(yīng)用FLAG標簽融合蛋白的研究提供了重要工具，并為進一步的FLAG標簽應(yīng)用提供了理論參考。此外，本研究為其他標簽蛋白納米抗體的制備提供了技術(shù)平臺，有助于解決目前商品化抗標簽蛋白抗體的種類有限、價格高昂、穩(wěn)定性差和保存困難等問題，進一步拓寬FLAG標簽技術(shù)在目的蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究通過酵母雙雜交篩選方法，從駱源納米抗體文庫中發(fā)現(xiàn)了5個與FLAG標簽蛋白互作的蛋白。這些互作蛋白在大腸桿菌表達菌株BL21中成功表達并得到正確的驗證。其中，兩個蛋白通過原核表達Western blot驗證存在與FLAG標簽蛋白的相互關(guān)系。這兩種蛋白都能特異性識別FLAG標簽蛋白，從而成功制備出含有抗FLAG標簽蛋白的抗體。